Essentiellement, la culture cellulaire implique la distribution de cellules dans un environnement artificiel (in vitro) qui est composé des nutriments nécessaires, de la température idéale, des gaz, du pH et de l’humidité pour permettre aux cellules de croître et de proliférer.

• In vivo – Lorsque l’étude implique des entités biologiques vivantes à l’intérieur de l’organisme.

• In vitro – Lorsque l’étude est menée à l’aide d’entités biologiques (cellules, tissus, etc) qui ont été isolées de leur environnement biologique naturel. Par exemple, des tissus ou des cellules isolés du foie ou du rein.

Alors que des morceaux de tissus peuvent être mis dans la culture appropriée pour produire des cellules qui peuvent ensuite être utilisées pour la culture (explantculture), les cellules des tissus (tissus mous) peuvent être obtenues par des réactions enzymatiques. Des enzymes telles que la trypsine et le proname sont utilisées pour décomposer le tissu et libérer les cellules souhaitées.

Lorsque les cellules ont été obtenues directement à partir de l’organisme/tissu animal (ou même du tissu végétal) par des techniques enzymatiques ou mécaniques, ces cellules sont appelées cellules primaires. Cependant,les cellules qui continuent à proliférer indéfiniment (après la première sous-culture)dans des conditions particulières sont appelées lignées cellulaires.

Ces cellules particulièressont censées avoir été passées pendant une longue période, ce qui leur faitacquérir des traits génotypiques et phénotypiques homogènes (similaires).

Morphologie

Selon leur apparence, les cellules en culture peuvent être classées en trois groupes principaux :

• Fibroblastique – Cela comprend les cellules qui ont tendance à être bipolaires/multipolaires avec des formes allongées. Ces cellules sont attachées au substrat pendant leur croissance.

• Epitheliales – Les cellules de type épithélial atteignent une forme polygonale avec des dimensions régulières. Bien qu’elles aient tendance à se développer en plaques discrètes, ces cellules se développent également attachées au substrat.

• Lymphoblaste – Ces cellules sont généralement de forme sphérique et ne s’attachent pas à la surface du substrat. Par conséquent, elles sont cultivées en suspension.

* Pour les plaques solides, on utilise des agents solidifiants (comme l’agar) lorsque le milieu liquide est utilisé avec de l’agar.

Signification de la culture cellulaire

La culture cellulaire est une technique importante en biologie cellulaire et moléculaire étant donné qu’elle fournit la meilleure plateforme pour étudier la physiologie et la biochimie normales des cellules. Une cellule est l’unité structurelle, fonctionnelle et biologique de base de tous les êtres vivants.

Pour comprendre un organisme ou des tissus donnés, il est important de comprendre comment ses cellules fonctionnent. Grâce à la culture cellulaire, cela devient possible notamment grâce au fait que les cellules primaires ressemblent aux cellules parentales de l’organisme/du tissu.

Tout ce que l’on apprend sur les cellules in vitro est représentatif de ce qui se passe dans l’organisme/le tissu. Cela rend la culture cellulaire significativement importante pour le développement de vaccins, le dépistage (médicaments, etc.) et le diagnostic de maladies/conditions données.

Etant donné que différents types de cellules nécessitent des environnements différents pour proliférer, il existe différents types de milieux utilisés pour la culture tels que les milieux sans sérum et les milieux contenant du sérum, entre autres.

Une fois que les bonnes conditions ont été fournies, les cellules vont augmenter en nombre et peuvent former des colonies, qui peuvent alors être facilement vues et identifiées.Cependant, tout cela nécessite que le but de la procédure soit compris.

En ayant une bonne compréhension de ce que la procédure est censée atteindre, il devient plus facile de préparer la culture avec les bons composants. En comprenant ce que la procédure vise, le chercheur saura s’il doit préparer un milieu sélectif (qui permet à des cellules spécifiques de se développer) ou un milieu indifférencié (qui permet à différents types de cellules de se développer).

Culture cellulaire primaire

La culture cellulaire est un processus où les cellules (animales ou végétales) sont retirées de l’organisme et introduites dans un environnement artificiel avec des conditions favorables à la croissance. Cela permet aux chercheurs d’étudier et d’en apprendre davantage sur les cellules.

Il existe trois grands types de culture cellulaire, qui comprennent :

• Culture cellulaire primaire
• Culture cellulaire secondaire, et
• Ligne cellulaire

Nous nous concentrerons ici sur la culture cellulaire primaire.

Il existe deux types de cellules primaires :

Cellules adhérentes – Également appelées cellules dépendantes de l’ancrage, ce sont les types de cellules qui nécessitent un attachement pour leur croissance. Les cellules adhérentes sont immobiles et obtenues à partir d’organes tels que le rein.

Cellules en suspension – Il s’agit du type de cellules qui ne nécessitent pas d’attachement pour se développer. Elles sont donc également appelées cellules indépendantes de l’ancrage et comprennent des cellules telles que les lymphocytes que l’on trouve dans le système sanguin.

Dans la culture cellulaire primaire, les cellules obtenues à partir de tissus parentaux (tissus vivants) tels que le foie et le rein, sont introduites dans des milieux appropriés pour la croissance. Une fois que les cellules ont été obtenues, elles peuvent soit être cultivées en tant que culture d’explants, suspension ou monocouche.

* Dans la culture cellulaire primaire, les cellules doivent avoir été obtenues à partir du tissu parental/ vivant. C’est-à-dire qu’elles ne proviennent pas d’un autre processus de culture.

Avant que les cellules soient cultivées, elles sont d’abord soumises à un traitement enzymatique de dissociation. Cependant, doit être pour une quantité minime de temps pour éviter d’endommager ou de tuer les cellules. Une fois que les cellules uniques sont obtenues, elles sont ensuite cultivées de manière appropriée dans des milieux pour leur permettre de croître (se diviser) sont atteindre les nombres désirés.

Initialement, la culture tend à être hétérogèneousin qu’elle est composée de différents types de cellules obtenues à partir du tissu.Bien que cela puisse être maintenu par le processus in vitro (dans une culture dans un milieu approprié), ce ne serait que pour une période de temps limitée.

Par le processus de transformation, les cellules primaires peuvent être utilisées pendant une longue période de temps, modifiant la culture au fil du temps. Ces cellules sont appelées lignées cellulaires continues.

Cependant, les cellules primaires sont généralement préférées aux lignées cellulaires continues car elles sont plus similaires (physiologiquement) aux cellules invivo (cellules du tissu vivant). En outre, les lignées cellulaires continues peuvent subir certains changements (changements phénotypiques et génotypiques) qui entraîneraient des divergences lors de l’analyse. Elles ne peuvent donc pas être utilisées pour déterminer ce qui se passe dans les cellules in vivo. C’est pour cette raison que les cellules primaires sont préférées.

Etant donné que les cellules primaires ressemblent considérablement aux cellules obtenues à partir de tissus vivants, elles sont importantes pour les objectifs de recherche dans la mesure où elles peuvent être utilisées pour étudier leurs fonctions, les régulations métaboliques, la physiologie cellulaire, le développement, les défauts et les conditions affectant le tissu d’intérêt.

Egalement, ils sont utilisés à des fins telles que la production de vaccins, le dépistage de médicaments par génie génétique ainsi que les tests de toxicité et le diagnostic prénatal, entre autres.

Milieux de culture cellulaire

Dans les techniques de culture cellulaire, les cellules (ou les tissus)sont prélevées d’une plante ou d’un animal et introduites dans un nouvel environnement artificiel qui peut soutenir leur prolifération (survie et croissance).

Certaines des exigences d’un tel environnement pour la prolifération des cellules comprennent :

• Un substrat (source de nutrition)
• Une plage de température idéale (contrôlée)
• Un milieu de croissance, et
• Un pH idéal entre autres

Ici, nous nous concentrerons sur le milieu (milieu de culture cellulaire)

Bien qu’il existe différents types de milieux de culture (pour différents types de cellules), ils sont généralement composés de :

• Glucose
• Acides aminés
• Vitamines
• Sels inorganiques
• Facteurs de fixation Etc.

Il existe deux grands types de milieux de culture, à savoir :

Milieux naturels – Les milieux de culture naturels sont composés de fluides biologiques d’origine naturelle. Bien que ce type de milieu puisse être utilisé pour une gamme de cellules, son plus grand inconvénient est qu’il peut manquer des composants exacts requis par des cellules données, ce qui peut grandement affecter la reproductibilité.

Milieu artificiel – Également appelé milieu synthétique, le milieu artificiel désigne le type de milieu qui est produit par l’ajout de nutriments tels que des vitamines, des gaz (oxygène et dioxyde de carbone) et des protéines, entre autres. Ces nutriments organiques et inorganiques sont ajoutés de manière à répondre aux besoins spécifiques de cellules données et à fournir ainsi l’environnement idéal pour leur croissance.

A ce titre, ils peuvent être utilisés à plusieurs fins, notamment :

• Assurer la survie immédiate des cellules
• Assurer la survie prolongée des cellules
• Assurer la croissance indéfinie des cellules
• Assurer des fonctions spécialisées

D’autre part, la culture peut être catégorisée comme suit :

Milieux sélectifs- Il s’agit d’un type spécial de milieu qui ne permet qu’à certaines cellules de se développer. Par exemple, la gélose au sang (utilisée pour isoler les espèces de Streptococcus & Moraxella) peut être transformée en un milieu sélectif en ajoutant des antibiotiques.

Milieux différentiels- Ce type de milieu permet à différents types de cellules/microorganismes de se développer en fonction de leur métabolisme.

Comme mentionné ci-dessus, différents types de milieux synthétiques sont préparés de manière à fournir l’environnement de prolifération idéal pour des cellules données. Pour cette raison, les milieux synthétiques peuvent être divisés en quatre grandes catégories.

Ceux-ci comprennent :

Milieux contenant du sérum – Dans ces types de milieux,le sérum (sérum bovin fœtal) est utilisé comme support pour les nutriments et les facteurs de croissance entre autres qui ont tendance à être insolubles dans l’eau.

Milieux sans sérum – Ces types de milieux sonttypiquement produits dans le but de soutenir un seul type de culture cellulaire.En tant que tel, il fournit des nutriments spécifiés et d’autres facteurs requis par le type de cellule. Dans ce type de milieu, le sérum est absent car il présente certains inconvénients et peut entraîner une mauvaise interprétation des résultats immunologiques.

Milieu chimiquement défini – Comme son nom l’indique, ce type de milieu est composé d’ingrédients organiques et inorganiques purs exempts de contamination. Les constituants de ce type de milieu sont généralement produits par génie génétique dans des bactéries/levures.

Milieux sans protéines – Les milieux sans protéines sont typiquement dépourvus de tout type de protéine. Il est largement utilisé pour promouvoir une croissance supérieure des cellules ainsi que l’expression des protéines en plus de faciliter la purification de tout produit exprimé.

Certains des principaux composants des milieux de culture cellulaire comprennent :

• Nutriments – fournis par les peptides et les acides aminés, qui sont les éléments constitutifs des protéines
• Hydrocarbures pour l’énergie
• Minéraux essentiels tels que le calcium, le magnésium, phosphateset le fer entre autres agents tampons tels que les acétates pour stabiliser le milieu de culture
• Vitamines
• Indicateurs de changement de PH tels que le rouge de phénol

Les milieux de culture cellulaire sont utilisés pour laprolifération des cellules, qui peuvent ensuite être identifiées et étudiées. Ainsi, ils peuvent être utilisés à diverses fins, notamment pour l’éducation, le diagnostic et le traitement d’une maladie, entre autres.

Suspension cellulaire

Dans les méthodes de culture, la suspension cellulaire désigne un type de culture où les cellules sont en suspension dans un milieu liquide.

Pour obtenir des cellules uniques, on met un cal friable (petit tissu qui se défait facilement) dans un milieu liquide agité (l’agitation permet un échange gazeux contrairement au milieu solide), ce qui le fragmente. Cela permet de libérer des cellules uniques, qui sont ensuite transférées dans un autre milieu frais.

Les cultures en suspension cellulaire présentent un grand avantage par rapport aux cultures stationnaires, car elles permettent de baigner les cellules de manière uniforme. De plus, étant donné que le milieu a tendance à être agité, elle permet l’aération du milieu,fournissant des gaz aux cellules. Étant donné que le milieu est une suspension, il devient également facile de manipuler le contenu de la culture.

Comme toute autre culture, la culture de cellules en suspension doit se faire dans des conditions contrôlées, fournissant aux cellules un environnement idéal pour proliférer. Une fois qu’elles atteignent environ 80 pour cent de confluence, il est temps de procéder à une sous-culture afin d’assurer la poursuite d’une croissance adéquate.

* 80 pour cent de confluence fait référence à l’état où80 pour cent de la surface de la culture est couverte par les cellules en croissance.

Dans certains cas, les cellules en suspension peuventadhérer à la surface en plastique du flacon de culture ou même former des amas. Dans ces cas, une pipette peut être utilisée pour prélever ces cellules et les expulser sur la surface du flacon et donc loin de la surface en plastique. Cela aide à obtenir des cellules uniques étant donné qu’elles n’adhèrent pas à la surface du plastique.

Suspension de globules rouges

• (à gauche : sans hémolyse) suspension de globules rouges (0,5% de GR de mouton dans une solution saline), semble rouge et opaque.
• (au milieu : sans hémolyse) les GR ont sédimenté spontanément pendant 60 minutes. Notez que le surnageant n’est pas coloré.
• (droite : hémolyse) Suspension de GR traitée avec l’hémolysine de S. pyogenes à 37C pendant 30 min, devient transparente par hémolyse.

Voir plus sur les globules rouges

Compter les cellules

Compter le nombre de cellules dans une suspension est un processus qui implique l’utilisation d’une coloration. Par exemple, lorsque le bleu trypan est utilisé, il pénètre la membrane cellulaire des cellules mortes, mais pas celle des cellules vivantes.

Les cellules sont ensuite expulsées doucement dans un hémocytomètre (contient la chambre de comptage) sous la lamelle couvre-objet et observées au microscope. Les cellules sont ensuite comptées dans un nombre donné de carrés pour les calculs.

Signification

Cette méthode est largement préférée en raison du fait qu’elle permet de mettre les cellules en suspension dans une solution plutôt que de les maintenir dans un milieu solide. Il est donc plus facile de manipuler les contenus en les empêchant de former des amas. Avec les suspensions cellulaires, il est également plus facile d’observer des cellules individuelles au microscope.

Dans ce cas, il devient possible non seulement d’étudier la structure des cellules, mais aussi d’observer comment elles se sont différenciées ; en regardant les cellules mortes et vivantes sous le microscope.

Protocole de culture cellulaire

Les protocoles de culture cellulaire sont destinés à assurer que les procédures de culture sont effectuées selon les normes requises. Il s’agit non seulement d’empêcher la contamination des cellules, mais aussi de s’assurer que les chercheurs eux-mêmes sont protégés de toute forme de contamination.

De plus, la nature du travail est censée être conforme aux directives éthiques appropriées. Par conséquent, avant toute chose, il est essentiel de s’assurer que l’ensemble de la procédure est conforme aux directives en matière d’éthique médicale et d’expérimentation animale. En effet, aller à l’encontre de cette législation et de ces directives peut entraîner de lourdes sanctions et même la fermeture du laboratoire.

Avant de commencer à travailler, effectuez la procédure suivante :

• Assurez-vous que la zone de travail est désinfectée (en utilisant de l’éthanol à 70 %)
• Utilisez toujours une nouvelle paire de gants. Si une paire de gants doit être utilisée pour une autre procédure de culture cellulaire,il faut les désinfecter en utilisant de l’éthanol à 70 pour cent et les laisser sécher à l’air libre.
• Tout équipement qui avait été sorti de l’armoire doit également être désinfecté pour éviter toute contamination
• Ces équipements tels que la pipette, les bocaux en verre et les plastiques qui seront utilisés pour la procédure doivent être autoclavés

Bien qu’il existe une large gamme de milieux de culture pour les cellules, il est important de garder à l’esprit que les cultures de cellules, et en particulier les cultures de cellules primaires, sont facilement sujettes à la contamination, en plus du risque de contenir des virus non détectés. Pour cette raison, tout le matériel doit être manipulé comme potentiellement infectieux afin d’éviter toute infection.

En outre, pour des raisons de sécurité, le travail sur la culture cellulaire doit être effectué dans la hotte à flux laminaire appropriée,où l’air est dirigé loin du chercheur.

Protocoles de préparation des cultures cellulaires

Vérifiez toujours les informations figurant sur le récipient pour vous assurer que le milieu est approprié pour la cellule à cultiver,

Une fois préparée, la culture cellulaire doit être maintenue dans la plage de température recommandée,

Surveiller la culture toutes les 30 à 48 heures et vérifier la confluence (lorsque les cellules recouvrent complètement la surface de la culture) – Cependant, cela dépend largement du type de cellules.

Une fois que la procédure est terminée et que les cellules ont été analysées, la culture doit être jetée de manière appropriée. Ici, il est important de prendre beaucoup de précautions étant donné qu’à ce moment-là, les cellules ont déjà proliféré et augmenté en nombre. De plus, il y a de fortes chances que le spécimen ait été contaminé, ce qui augmente les risques de causer des infections au chercheur s’il n’est pas manipulé de manière appropriée.

Élimination

• Pour des articles comme les scalpels, les lames de verre et les lamelles couvre-objet, entre autres, la dé-contamination peut impliquer l’autoclavage à 121 degrés Celsius et 15 psi (pression) pendant au moins 30 minutes. Cependant, s’ils doivent être jetés, il est important qu’ils soient mis dans un sac en plastique et dans le conteneur approprié pour être incinérés plus tard.
• Avec les déchets liquides, la désinfection chimique est l’une des meilleures méthodes par lesquelles le produit de déchets peut être activé. Des produits chimiques tels que l’eau de Javel peuvent être utilisés à cette fin avant de verser le liquide dans l’évacuation de l’évier.
• Pour les déchets solides, ils sont rassemblés dans un sac en plastique pour être incinérés. En revanche, ils peuvent d’abord être autoclavés avant d’être incinérés.

Conclusion

En général, la culture cellulaire, qu’il s’agisse de l’utilisation d’une suspension ou d’un milieu stationnaire, implique la croissance de cellules dans un environnement artificiel présentant des conditions favorables. Alors que l’action enzymatique peut être utilisée pour obtenir des cellules pour la culture, c’est la méthode de désagrégation mécanique qui est la plus préférée étant donné qu’elle fournit une manière plus simple et moins traumatisante d’obtenir des cellules.

Cette méthode implique simplement la découpe d’un tissu en morceaux plus petits à partir desquels les cellules qui s’écoulent sont ensuite recueillies. La technique des explants primaires peut également être utilisée pour obtenir les cellules. Cependant, cette méthode est surtout utile pour la désagrégation de plus petites quantités de tissu.

Bien que toutes les cellules puissent être utilisées dans des cultures pour observer leur comportement, les tissus embryonnaires sont préférés (pour les cellules primaires) par rapport aux cellules adultes parce qu’ils fournissent des cellules qui sont plus viables et peuvent proliférer rapidement.

Il est également important de s’assurer que les cellules sont en plus grande quantité étant donné que leur taux de survie a tendance à être plus faible par rapport aux sous-cultures. I

Afin d’améliorer le succès des cultures, il est également important de s’assurer que les dommages aux cellules sont minimisés à la fois pendant la collecte et le traitement des cellules. Cela s’ajoute à l’utilisation du milieu approprié pour les cellules en question.

Dans le même ordre d’idées, jetez un coup d’œil aux types et aux techniques de culture de tissus.

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