Viime vuosikymmenen aikana genomiteknologian kehitys on mahdollistanut biologisten prosessien ja sairauksien molekyylimekanismien tunnistamisen, mikä on vaikuttanut kaikkiin kliinisen tutkimuksen aloihin, erityisesti syöpään. Kasvainsisäinen heterogeenisuus, syöpäsolujen genomin dynaamiset muutokset ja geneettiset poikkeavuudet ovat jokaisen syöpätyypin ainutlaatuisia sormenjälkiä . Nämä syövän erityispiirteet yhdessä ennusteellisten alatyyppiluokitusten ja riskin osittamisen kanssa ovat osoittaneet, että geeniekspressioprofiloinnin avulla voidaan paremmin ymmärtää esimerkiksi syövän ennusteen ja hoitoherkkyyden molekulaarisia taustoja. Lisäksi geeniekspressioprofilointi on tehokas molekulaarinen lähestymistapa lääkeherkkyyden ennustamiseen.
Kehitetään koordinoituja laajamittaisia syöpägenomihankkeita, joiden tarkoituksena on tuottaa luetteloita eri syöpätyyppien genomimuutoksista. Kaksi tärkeintä hanketta ovat Cancer Genome Atlas (TCGA) ja International Cancer Genome Consortium (ICGC) , johon kuuluu monia keskuksia, jotka käyttävät erilaisia alustoja tuottaakseen syöpägenomitietoa, kuten geeniekspressiota, DNA-mutaatioita, DNA-metylaatiota, proteiini-ekspressiota ja kliinisiä tietoja. Nämä hankkeet tuottavat suuria määriä genomitietoa, joka auttaa tutkijoita luomaan tai testaamaan uusia hypoteeseja, jotka voivat viime kädessä auttaa uusien syöpähoitojen, diagnostisten menetelmien ja ennaltaehkäisevien strategioiden kehittämisessä. Suurten monimutkaisten tietomäärien tutkiminen, yhdistäminen ja analysointi on kuitenkin haastavaa erityisesti tutkijoille, joilla ei ole taustaa laskennallisesta ohjelmoinnista tai tietotekniikasta.
Syöpägenomitiedon suurten määrien tehokas hyödyntäminen on edelleen haaste laskentamenetelmien rajoitusten ja riittämättömän ohjeistuksen vuoksi. Datan visualisointi on erittäin hyödyllistä tehokkaan data-analyysin kannalta, ja kehittyneitä työkaluja on kehitetty helpottamaan datan visualisointia, kuten avoimesti saatavilla olevat portaalit cBioPortal, UCSC Cancer Browser ja canEvolve (taulukko 1). Avoimet portaalit helpottavat kuitenkin lähinnä suurten tietokokonaisuuksien tutkimista, ja ne ovat joskus rajallisia, kun tietokokonaisuuksia tutkitaan syvällisemmin. Tässä kuvaamme yksinkertaisen mutta tehokkaan menetelmän, jolla voidaan tutkia näytteiden tai potilaiden osajoukkoja, joilla on tietty geneettinen, biologinen tai kliininen kiinnostuksen kohde. Keskitymme geeniekspression profilointiin ja esittelemme menetelmän, jolla voidaan analysoida geeniekspressiotietoja suhteessa DNA-metylaatioon ja proteiiniekspressioon (taulukko 2) ja jota voidaan integroida tiettyjä syöpätyyppejä koskevien tutkimushypoteesien testaamiseen.
| Genomityyppi | Data |
|---|---|
| Geeni-ekspressio | RNA-seq Kasvaimen RNA (microarray) |
| DNA-metylaatio | Metylaatio (HM27) |
| Proteiiniekspressio | Reverse-phase protein array (RPPA) |
Materiaalit & menetelmät
Protokolla in silico geeniekspressioprofilointiin
Geeniekspressioprofilointi on tehokas tekniikka, jolla voidaan tutkia biologisia prosesseja molekyylitasolla. Geenin aktiivisuutta eli ekspressiota voidaan arvioida proteiinien tunnistamisen avulla, mutta geeniekspressiota tutkitaan yleensä tutkimalla RNA-viestiä eli transkriptiä. Kaksi korkean läpimenon menetelmää, joita käytetään yleisesti kattavaan geeniekspressioprofilointiin, ovat RNA-sekvensointi seuraavan sukupolven sekvensoinnilla (NGS) ja DNA-mikrosarjat.
Yleisesti ottaen syövän geeniekspression lähestymistapoja on kahdenlaisia: differentiaalinen ja suhteellinen analyysi. Differentiaalisessa lähestymistavassa selvitetään kasvaimen ilmentymisprofiileja suhteessa potilasta vastaaviin tai vastaaviin normaaleihin kudosnäytteisiin, kun taas suhteellisessa lähestymistavassa verrataan transkriptiotasoja eri kasvaintyyppien tai solu- ja kudosnäytteiden välillä. Erityisestä lähestymistavasta riippuen näytteiden ja näytteiden geeniekspressioprofiilien profilointi voi antaa tietoa paitsi biologiasta myös yksityiskohtaisia tietoja transkriptien rakenteesta, muutoksista ja vaihteluista. Monet avoimet portaalit helpottavat geeniekspressiotietojen tutkimista. Protokollaamme havainnollistetaan cBioPortalin tarjoaman työkalun avulla. Myös muita avoimia portaaleja, kuten UCSC Cancer Browser ja canEvolve, voidaan käyttää genomitietojen tutkimiseen. Annamme vaiheittaisen protokollan seuraavissa luvuissa (Supplemental Protocol):
|
Yleiskatsaus ja kiinnostavan syöpätietoaineiston valinta (cBioPortal); |
|||||
|
Kiinnostavien tapausjoukkojen/osajoukkojen luominen yhdessä tutkimuksessa; |
|||||
|
Geenien integroiva analyysi yhdessä tutkimuksessa. Kun kiinnostava syöpätutkimus on määritelty kohdassa 1 ja kun näytteiden/potilaiden osajoukot, joilla on kiinnostavia kliinisiä tai geneettisiä tietoja, on luotu kohdassa 2. Tässä osiossa luokitellaan kukin geeni kussakin näytteessä, ja sitä käytetään kaikkeen genomitiedon analysointiin ja visualisointiin; |
|||||
|
Geeni-ekspressio- ja proteiini-ekspressiotietojen kerääminen; |
|||||
|
Metylaatiodatan kerääminen; |
|||||
|
Korrelaatioanalyysi. Geeniekspression ja joko metylaatiotilanteen tai proteiinitason välisen korrelaation tutkimiseksi tämä osio tarjoaa työkalun suhteen kuvaamiseen; |
|||||
|
Grafinen visualisointi ja tilastollinen analyysi. Jaksossa 5 kerättyjen mRNA-ekspressio-, metylaatio- tai proteiini-ekspressiotietojen tai jakson 6 korrelaatioanalyysin tietojen visualisointi ja analysointi. |
|||||
Tulokset & keskustelu
Esittelytulokset
Mutaatiot IDH1-geenissä ovat matala-asteisen gliooman ja sekundaarisen glioblastooman synnyn esiaste . IDH1-mutaation (IDH1MUT) esiintyminen liittyy glioomapotilaiden pidentyneeseen eloonjäämiseen verrattuna IDH1:n villityyppisiin (IDH1WT) potilaisiin . Edustava analyysi kokonaiselossaolokäyristä, joissa verrataan IDH1MUT- ja IDH1WT-gliooma-potilaita TCGA-tietokannassa.
Analyysiä varten analysoitiin matala-asteisen gliooman ja glioblastoma multiforme -tutkimuksen (TCGA, Cell 2016) yhdistettyä kohorttia, johon kuului 411 IDH1MUT- vs. 401 IDH1WT-gliooma-potilasta. Kokonaiseloonjäämisen Kaplan-Meier-kaavio osoittaa IDH1MUT-glioomapotilaiden (punainen) noin kuusinkertaisesti pidennetyn eloonjäämisajan IDH1WT-glioomapotilaisiin (sininen) verrattuna.
IDH1MUT indusoi metabolisen uudelleenkytkennän, jota ei täysin ymmärretä, mutta metabolisten entsyymien ilmentymistasojen eroavaisuuksien tutkiminen on lupaava tutkimuksellinen lähestymistapa. IDH1MUT:n vaikutukset metabolisia entsyymejä koodaavien geenien ilmentymiseen tarjoavat tilaisuuden havainnollistaa cBioPortalin mahdollisuuksia tietojen integrointiin, tutkimiseen ja analysointiin. TCGA tarjoaa 112 IDH1WT vs. 399 IDH1MUT low-grade glioma (LGG) -näytteen ja 157 IDH1WT vs. yhdeksän IDH1MUT glioblastoma -näytteen tiedot tutkittavaksi ja integroitavaksi analyysiä varten.
Glukoosiaineenvaihdunnassa valittiin geenejä, jotka koodaavat nopeutta rajoittavia metabolisia entsyymejä: GLUT1/3, HK1, HK2, HK3, PKLR, PKM2, LDHA ja LDHB. IDH1WT vs. IDH1MUT LGG- ja glioblastoomapotilasnäytteissä GLUT3:n, HK2:n, PKM2:n ja LDHA:n geeniekspressio oli korkeampi (kuva 2), mikä viittaa siihen, että IDH1WT-gliooma on riippuvaisempi glykolyysistä ATP:n tuotannossa kuin IDH1MUT-gliooma.
Analyysi IDH1WT- (n = 112) ja IDH1MUT-näytteistä (n = 399) matala-asteisesta glioomasta ja IDH1WT- (n = 157) ja IDH1MUT-näytteistä (n = 9) glioblastoomasta, jotka on saatu cBioPortalista käyttäen TCGA:n tietokokonaisuuksia Aivojen matala-asteinen gliooma (alustava aineisto) ja Monimuotoinen glioblastooma (alustava). Suhteellisten mRNA-ekspressiotasojen yhdistetyt tiedot on esitetty IDH1WT:n (sininen) ja IDH1MUT:n (punainen) osalta.
***p < 0.001; ****p < 0.0001.
G6PD: Glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi; GLUT: Glukoosin kuljettaja; HK: heksokinaasi; LDH: laktaattidehydrogenaasi; PK: pyruvaattikinaasi.
Koska IDH1/2:n mutaatioita esiintyy myös 20 %:lla potilaista, joilla on myelooisia kasvaimia, mukaan lukien AML, on kuvassa 3 esitetty esimerkki mRNA:n ilmentymisanalyysistä kolmesta ryhmästä, IDHWT, IDH1MUT ja IDH2MUT. Akuuttia myelooista leukemiaa (AML; TCGA, alustava) koskeva tutkimus tarjoaa 136 IDHWT-, 16 IDH1MUT- ja 16 IDH2MUT-AML-näytettä geeniekspressioprofiilien tutkimiseen. Kuvassa 3 on esitetty ATM-geenin, DNA-vaurioihin reagoivan proteiinin , mRNA-ekspressiotasot IDHWT-, IDH1MUT- ja IDH2MUT-AML-näytteissä, mikä osoittaa, että ATM:n mRNA-ekspressio on voimakkaasti vähentynyt IDH1MUT-AML:ssa.
Asianalyysi akuutin myelooisen leukemian IDHWT- (n = 138), IDH1MUT- (n = 16) ja IDH2MUT-näytteistä (n = 16), jotka on hankittu cBioPortal-sivustolta TCGA datasets Akuutin myelooisen leukemian tietokannoista (alustava). Tiedot suhteellisista mRNA-ekspressiotasoista on esitetty IDHWT:n (sininen), IDH1MUT:n (punainen) ja IDH2MUT:n (vihreä) osalta.
**p < 0.01.
Toinen esimerkki on esitetty kuvassa 4, jossa on esitetty geeniekspression kuvaaja LDHA-geenin DNA-metylaation funktiona LGG:ssa. LDHA:n alhaisemmat ilmentymistasot, joita havaittiin IDH1MUT-glioomissa, liittyivät sen promoottorin hypermetylaatioon (kuva 4A), mutta LDHB-geenin alhaisemmat ilmentymistasot IDH1WT:ssä eivät korreloineet metylaation kanssa (kuva 4B).
Kuvio (A)LDHA-geenin ja (B)LDHB-geenin geeniekspression ja DNA-metylaation korrelaatiosta matala-asteisessa glioomissa (Brain Lower Grade Glioma, väliaikainen) IDH1MUT-statuksen mukaan (sininen: IDH1WT, punainen: IDH1MUT).
Tutkittaessa, korreloivatko geenien ilmentymistasot proteiinien runsauden kanssa, havainnollistava esimerkki on esitetty kuvassa 5. IDH1MUT-glioomissa havaittiin alhaisemmat G6PD:n geeniekspressiotasot verrattuna IDH1WT-glioomaan (kuva 5A), kun taas G6PD:n proteiinitasot olivat samat IDH1MUT- ja IDH1WT-LGG:ssä (kuva 5B), mikä viittaa siihen, että toiminnassa on ylimääräisiä posttranslationaalisia mekanismeja .
(A) Analyysi G6PD:n geeniekspressiotasoista matala-asteisessa glioomassa (LGG) korrelaatiossa (B) G6PD:n proteiinien runsauden kanssa IDH1MUT-statuksen mukaan (sininen: IDH1WT, punainen: IDH1MUT). (C) Geeniekspression ja proteiinien runsauden korrelaatiokuvio.
****p < 0.0001.
LGG: matala-asteinen gliooma; ns: Ei merkitsevä.
Jatkuva innovaatiotoiminta on auttanut suuresti laajentamaan ymmärrystämme syövästä, mutta se on myös muuttanut syöpätutkimuksen yhdeksi biologian dataintensiivisimmistä aloista. Hyvin jäsennellyt ja organisoidut syöpägenomiikan hankkeet tarjoavat tutkijoille valtavia määriä kasvainnäytteitä, jotka valmistellaan, normalisoidaan ja käsitellään samalla tavalla laskennallista analyysia varten, jotta voimme laajentaa ymmärrystämme syövän genetiikasta. Tässä lueteltu protokolla yhdessä avoimen saatavuuden välineiden kanssa madaltaa näiden monimutkaisten tietojen saatavuuden esteitä ja tarjoaa syvällisempää tiedonlouhintaa, jotta genomitiedon kääntäminen uusiksi biologisiksi ja kliinisiksi oivalluksiksi nopeutuu.
Gliooman syöpägenomiikan hanke oli yksi ensimmäisistä TCGA:n hankkeista, joka tarjosi hyvin jäsenneltyjä tietoja kasvainnäytteistä useilta alustoilta. Näiden tietojen genomianalyysissä tunnistettiin kliinisesti merkityksellisiä glioblastooman alatyyppejä ja rajattiin kolme eri molekyyliluokkaa matala-asteisessa glioomassa, mukaan lukien luokka, jossa on IDH-mutaatio . Avoimet portaalit helpottavat pääsyä näihin tietokokonaisuuksiin, mutta ne ovat rajallisia tiettyjen ryhmien tutkimisessa. Tässä asiakirjassa käsiteltävässä protokollassa kuvataan yksinkertainen menetelmä sellaisten näytteiden tai potilaiden osajoukkojen tutkimiseksi, joilla on erityinen geneettinen, biologinen tai kliininen kiinnostuksen kohde, kuten kasvainnäytteet, joissa on IDH-mutaatio. Toiseksi protokollassa kuvataan, miten luodaan ekspressioprofiileja geeneistä, jotka osallistuvat tiettyyn reittiin tai prosessiin, kuten aineenvaihduntaan, tässä erityisessä näytteiden osajoukossa. Tämä mahdollistaa yksittäisten kiinnostavien geenien valinnan kaikkien geenien tutkimisen sijasta ja luokittelee jokaisen geenin kussakin näytteessä, jota käytetään analyysiin ja visualisointiin. Lopuksi tarjotaan moniulotteinen analyysi, jonka avulla voidaan tutkia geeniekspressiota suhteessa DNA-metylaatioon ja proteiiniekspressioon.
Vertailtuna muihin saatavilla oleviin työkaluihin tämä protokolla hyödyntää web-käyttöliittymätyökaluja, jotka eivät vaadi lisäohjelmia. Kriittinen vaihe protokollassa on oikean syöpägenomitutkimuksen tai -projektin valinta, joka sisältää kiinnostavat tiedot. Tällä hetkellä monet portaalit tallentavat tietoja kirjallisuudesta ja TCGA-portaalista peräisin olevista tietokokonaisuuksista. Esimerkkinä cBioPortal tarjoaa tällä hetkellä 76 syöpägenomiikan hanketta geeniekspressiosta (RNAseq ja microarray) yhdessä 21 metylaatio- ja 41 proteiiniekspressiohankkeen kanssa. Genomitiedon vertailun validiteetti riippuu siitä, miten hyvin näyte on sovitettu referenssiin teknisten (esim. tiedonkäsittelyn tyyppi) ja biologisten (esim. molekyylinen alatyyppi) vääristymien osalta. Siksi sellaisten portaalien käyttäminen, jotka tarjoavat genomitietoja hyvin jäsennellyistä syöpägenomiprojekteista, ei vaadi kehittyneitä normalisointitekniikoita ja eräkorjauksia.
Yhteenvetona voidaan todeta, että menetelmämme mahdollistaa sellaisten näytteiden valikoivan osajoukon tuonnin ja integroinnin, joilla on erityisiä genomisia, biologisia tai kliinisiä kiinnostuksen kohteita, kuten genomimuutoksia, mutaatioita, syövän alatyyppejä tai eloonjäämisominaisuuksia. Menetelmä sisältää ainutlaatuisen konseptin, jonka avulla voidaan luoda geeniekspressioprofiileja ja ristikytkeä nämä profiilit DNA-metylaatioon ja proteiiniekspressioon, jotka voidaan integroida tutkimushypoteesien testaamiseksi tietyissä syövän alatyypeissä.
Tulevaisuuden näkymät
Syöpätutkimus on kehittynyt yhdeksi biologian tietointensiivisimmistä tieteenaloista. Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange (GENIE) -hanke on yksi suurimmista tähän mennessä julkaistuista täysin julkisista syöpägenomitietoaineistoista. cBioPortalin kaltaisilla helposti hallittavilla portaaleilla on yhä tärkeämpi rooli tällä alalla.
Tekijöiden osuus
MK suunnitteli ja toteutti tutkimuksen, RJM ja CJFvN valvoivat tutkimusta, MK ja CJFvN kirjoittivat käsikirjoituksen, kaikki kirjoittajat lukivat ja hyväksyivät käsikirjoituksen lopullisen version
Taloudellisten & kilpailevien etujen ilmoittaminen
Tätä tutkimusta on tukenut Alankomaiden syöpäyhdistys (KWF:n apurahat UVA 2014-6839 ja AMC 2016.1-10460). Kirjoittajilla ei ole muita asiaankuuluvia sidonnaisuuksia tai taloudellisia sidonnaisuuksia mihinkään organisaatioon tai yksikköön, jolla on taloudellisia intressejä tai taloudellisia ristiriitoja käsikirjoituksessa käsiteltyjen aiheiden tai materiaalien kanssa, paitsi ne, jotka on julkistettu.
Tämän käsikirjoituksen tuottamisessa ei hyödynnetty kirjoitusapua.
- 1. Hanahan D, Weinberg RA. Syövän tunnusmerkit. Cell 100(1), 57-70 (2000).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 2. Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A et al. Gene expression profiling for the prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breast cancer. Lancet 362(9381), 362-369 (2003).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 3. Byron SA, Van Keuren-Jensen KR, Engelthaler DM, Carpten JD, Craig DW. RNA-sekvensoinnin siirtäminen kliiniseen diagnostiikkaan: mahdollisuudet ja haasteet. Nat. Rev. Genet. 17(5), 257-271 (2016). crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 4. International Cancer Genome C, Hudson TJ, Anderson W et al. International network of cancer genome projects. Nature 464(7291), 993-998 (2010).Crossref, Medline, Google Scholar
- 5. Chin L, Andersen JN, Futreal PA. Cancer genomics: from discovery science to personalized medicine. Nat. Med. 17(3), 297-303 (2011).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 6. Weeraratna AT, Nagel JE, De Mello-Coelho V, Taub DD. Geeniekspressioprofilointi: mikrosarjoista lääketieteeseen. J. Clin. Immunol. 24(3), 213-224 (2004).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 7. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P et al. Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science 302(5653), 2141-2144 (2003).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 8. Trapnell C, Williams BA, Pertea G et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28(5), 511-515 (2010).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 9. Gao J, Aksoy BA, Dogrusoz U et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci. Signal 6(269), pl1 (2013).Crossref, Medline, Google Scholar
- 10. Cerami E, Gao J, Dogrusoz U ym. cBio-syöpägenomiikan portaali: avoin alusta moniulotteisten syöpägenomiikan tietojen tutkimiseen. Cancer Discov. 2(5), 401-404 (2012).Crossref, Medline, Google Scholar
- 11. Parsons DW, Jones S, Zhang X et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science 321(5897), 1807-1812 (2008).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 12. Balss J, Meyer J, Mueller W, Korshunov A, Hartmann C, Von Deimling A. IDH1-kodonin 132 mutaation analyysi aivokasvaimissa. Acta Neuropathol 116(6), 597-602 (2008).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 13. Bleeker FE, Atai NA, Lamba S et al. Ennusteellinen IDH1(R132)-mutaatio liittyy vähentyneeseen NADP+-riippuvaiseen IDH-aktiivisuuteen glioblastoomassa. Acta Neuropathol. 119(4), 487-494 (2010).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 14. Khurshed M, Molenaar RJ, Lenting K, Leenders WP, Van Noorden CJF. In silico -geeniekspressioanalyysi paljastaa glykolyysi- ja asetaattianapleroosin IDH1-villiintyneessä glioomassa ja laktaatti- ja glutamaattianapleroosin IDH1-mutoituneessa glioomassa. Oncotarget 8(30), 49165-49177 (2017).Crossref, Medline, Google Scholar
- 15. Khurshed M, Aarnoudse N, Hulsbos R et al. IDH1-mutantti syöpäsolut ovat herkkiä sisplatiinille ja IDH1-mutantin estäjä kumoaa tämän herkkyyden. FASEB J. 32, 6344-6352 (2018).Crossref, Google Scholar
- 16. Molenaar RJ, Radivoyevitch T, Nagata Y ym. IDH1/2-mutaatiot herkistävät akuuttia myelooista leukemiaa PARP:n estolle ja tämä kumoutuu IDH1/2-mutantin estäjillä. Clin. Cancer Res. 24(7), 1705-1715 (2018).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 17. Frederiks WM, Bosch KS, De Jong JS, Van Noorden CJ. Glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasiaktiivisuuden posttranslationaalinen säätely rotan maksan (pre)neoplastisissa vaurioissa. J. Histochem. Cytochem. 51(1), 105-112 (2003).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 18. Verhaak RG, Hoadley KA, Purdom E et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell 17(1), 98-110 (2010).Crossref, Medline, CAS, Google Scholar
- 19. Cancer Genome Atlas Research N, Brat DJ, Verhaak RG et al. Comprehensive, integrative genomic analysis of diffuse lower-grade gliomas. N. Engl. J. Med. 372(26), 2481-2498 (2015).Crossref, Medline, Google Scholar
.