- Abstract
- 1. Johdanto
- 2. Mikrolinssi-immunomäärityksen periaate
- 3. Mikrolinssi-immunomäärityslaitteen rakenne ja toiminnot
- 3.1. Rinnakkaisvalon säteilytysjärjestelmä
- 3.2. Rinnakkaisvalo. Korkean resoluution automaattitarkennuskuvausjärjestelmä
- 3.3 . Automaattinen älykäs kuvantunnistus- ja analyysijärjestelmä
- 3.4. Lämpötilan säätöjärjestelmä
- 3.5. Mikrolinssi-testilevy
- 4. Immuunimikrokuvantamisjärjestelmän soveltaminen
- 4.1. Immuunimikrokuvantamisjärjestelmä . Antigeeni-vasta-aine-reaktion mittaaminen
- 4.2. Kliinisten näytteiden mittaaminen
- 6. Johtopäätökset
- Conflicts of Interest
- Tekijöiden panos
- Kiitokset
Abstract
Antigeeni-vasta-aine-reaktion havaitseminen ja analysointi on yksi kriittisimmistä havaitsemistekniikoista lääketieteen, biologian, ympäristötieteiden ja elintarviketurvallisuuden aloilla. Perinteiset ja klassiset menetelmät antigeenin ja vasta-aineen havaitsemiseksi kohtaavat monia ongelmia, kuten aikaa vieviä, kalliita ja epätarkkoja. Uutta immuuni-mikrosfäärin kuvantamistekniikkaa mikrolinssin avulla käytetään taitekertoimen muutosten testaamiseen ennen antigeeni-vasta-aine-reaktiota ja sen jälkeen. Se voi nopeasti suorittaa laadullisen ja määrällisen määrityksen antigeeni-vasta-aine-reaktiolle ilman leimausta, esimodifiointia, jälkipesua ja kalliita entsyymejä. Tässä esittelemme ja keskustelemme sen periaatteesta ja eduista, mikrolinssi-immunomäärityslaitteen rakenteesta ja mahdollisuuksista kliinisten näytteiden mittaamisessa. Se on lupaava kehitettäväksi sovellettavaksi kliinisten sairauksien diagnosointiin.
1. Johdanto
Yleisiä nykyisin saatavilla olevia tekniikoita antigeenien ja vasta-aineiden osoittamiseen ovat muun muassa entsyymisidonnainen immunosorbenttimääritys (ELISA), pintaplasmoniresonanssi (SPR), radioimmunomääritys (RIA), kolloidisen kullan immunokromatografinen määritys (GICT), epäsuora immunofluoresenssimääritys (IFA), kemiluminesenssi-immunomääritys (CLIA) ja hiukkasilla tehostettu turbidimetrinen immunomääritys (PETIA). ELISA yhdistää entsyymikatalysoidun reaktion vahvistamisen sekä antigeenin ja vasta-aineen spesifisen reaktion suurella tarkkuudella ja alhaisin kustannuksin, mutta sen menettelyt ovat monimutkaisia, ja olosuhteiden valvonta on tiukkaa. SPR kehitettiin 1990-luvulla biomolekyylien ja muiden molekyylien välisen vuorovaikutuksen havaitsemiseksi, ja se ei vaadi mitään merkintöjä ja voi saada tuloksen nopeasti, mutta sen laitteet ovat kalliita ja tarvitsevat suuren näytemäärän . RIA:n ominaisuuksia ovat suuri herkkyys, luotettavuus ja pieni näytemäärävaatimus. Sitä käytetään laajalti proteiinien, entsyymien ja muiden molekyylien havaitsemisessa, mutta radionuklidi on terveydelle haitallinen ja muuttaa myös näytteiden biologista toimintaa, mikä johtaa kokeelliseen virheeseen . Uudentyyppisenä immunomääritystekniikkana ja yhtenä yleisimmistä menetelmistä antigeenin ja vasta-aineen havaitsemiseksi GICT on helppo, yksinkertainen ja nopea, ja sen kustannukset ovat alhaiset, mutta sen näytemäärä on rajallinen ja herkkyys alhainen. CLIA-, IFA- ja PETIA-menetelmiä käytetään myös laajalti antigeenin ja vasta-aineen osoittamiseen. Niiden yhteiset edut ovat erittäin tarkat, vakaat, helpot ja nopeat, mutta niiden kustannukset ovat korkeat ja näytemäärä suuri .
Immuuni-mikrolinssien kuvantamistekniikka taitekertoimen muutoksen testaamiseksi voi poistaa edellä mainittujen menetelmien rajoitukset. Se on nopea, herkkä ja yksinkertainen, jossa ei ole saastumista ja alhaiset kustannukset havaitsemiseksi ja jota odotetaan sovellettavan laajalti ensisijaisiin lääketieteellisiin laitoksiin . Tämä tekniikka koostuu rinnakkaisesta valonsäteilytyksestä, korkean resoluution kamerasta, älykkäästä analyysiohjelmistosta, automaattisesta tarkennuksesta ja lämpötilan säätöjärjestelmistä, joissa on usean kuopan mikrolinssi-näytteen testauslevy, ja sillä voidaan saavuttaa antigeenin ja vasta-aineen monikäytäväinen havaitseminen. Korkearesoluutioinen kamerajärjestelmä voi täyttää mikrolinssien kuvantamisen vaatimukset, ja lämpötilansäätimen, automaattisen tarkennuksen ja automaattisten älykkäiden analyysijärjestelmien käyttö voi vähentää huomattavasti kokeissa esiintyviä virheitä tarkkaa mittausta varten.
2. Mikrolinssi-immunomäärityksen periaate
Mikrolinssi on sylinterimäinen linssi, jonka toisessa päässä on pallopinta ja toisessa päässä tasopinta. Sillä on voimakas vahvistusvaikutus ja se parantaa merkittävästi perinteisen optisen mikroskoopin kuvantamiskykyä. Kun mikrolinssi, jonka säde on ja taitekerroin (RI) on , upotetaan () -liuokseen ja valaistaan tasovalolla, sen kuva on taitekerroksen vaikutuksesta pyöreä ja sen reunalla on tumma rengas . Kuvan kirkkaan pisteen säteen ja muiden parametrien, kuten , , ja mikrolinssin sylinterin korkeuden, välinen suhde esitetään seuraavasti :missä on mikrolinssin pallonmuotoiseen yläosaan osuvan valon kulma ja . Tämän kaavan perusteella väliaineen hetkelliset muutokset voidaan määrittää mittaamalla kirkkaan pisteen säde kuvassa ja mikrolinssin säde. Koska optinen taittuminen tapahtuu valon nopeudella, mikä tahansa hetkellinen RI-muutos mikrolinssiä ympäröivässä väliaineessa voi välittömästi aiheuttaa muutoksen keskimmäisen kirkkaan pisteen säteessä. Siksi menetelmällä voidaan seurata hetkellistä RI:n/pitoisuuden muutosta nopealla kameralla kuvantamista varten (kuva 1).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3. Mikrolinssi-immunomäärityslaitteen rakenne ja toiminnot
Kuten kuvassa 2 on esitetty, rinnakkainen valonlähde, korkearesoluutioinen kuvantaminen, automaattinen älykäs analyysi, automaattitarkennus- ja lämpötilan säätöjärjestelmät sekä usean kuopan mikrolinssi-testilevy muodostavat mikrolinssi-immunomäärityslaitteen . Kun rinnakkainen valonlähde lähettää rinnakkaista valoa mikrolinssiin, korkean resoluution automaattitarkennuskuvausjärjestelmä saa tarkennetun kuvan millisekunneissa. Tämän jälkeen älykäs analyysiohjelmistojärjestelmä analysoi immuunimikropallokuvan ja ja sekä antigeenin/vasta-aineen pitoisuuden arvojen päättelemiseksi. Lämpötilan säätöjärjestelmän tehtävänä on säätää erilaisia lämpötiloja, joita tarvitaan eri antigeeni-vasta-aine-reaktioita varten. Koko prosessi vie enintään 2 minuuttia.
3.1. Rinnakkaisvalon säteilytysjärjestelmä
LED rinnakkaisvalon lähteenä tuottaa sylinterimäisen rinnakkaisvalaistusalueen, joka on samankaltainen kuin alkuperäinen kondensaattori, jonka etuina ovat alhaiset kustannukset, pitkä elinkaari, täydellinen valoteho ja pieni mittakaava . Kuten kuvassa 3 on esitetty, varsinainen rinnakkaisvalo voidaan vastaanottaa linssin taittumisen vuoksi. LEDin säteilytysalueella linssi voi muuttaa valon suuntaa ja jakautumista konfiguroimalla asiaankuuluvan linssin niin, että varsinainen yhdensuuntainen valo saadaan (kuva 3).
3.2. Rinnakkaisvalo. Korkean resoluution automaattitarkennuskuvausjärjestelmä
Tämä järjestelmä koostuu nopeasta digitaalikamerasta ja automaattitarkennusjärjestelmästä. Tällä hetkellä joidenkin kaupallisten digitaalikameroiden kuvausnopeus on ylittänyt 10 000 kuvaa sekunnissa . Näin ollen korkearesoluutioisella kuvantamisjärjestelmällä voidaan seurata reaaliaikaisesti RI:n dynaamisia muutoksia liuoksessa. Suuripikselisellä CCD-kameralla on tärkeä rooli korkearesoluutioisen mikrolinssien kuvantamisen aikaansaamisessa. Automaattitarkennusjärjestelmän ytimet koostuvat kuvan tunnistuksesta, kuvankäsittelystä ja ohjausosista . Kamerajärjestelmän keräämät kuvat analysoidaan ja selkeyden arviointi esitetään. Tämän arvioinnin mukaan järjestelmä ohjataan automaattisesti sopivalle alueelle tai suuntaan, kunnes otettujen kuvien resoluutio täyttää esiasetetun vaatimuksen.
3.3 . Automaattinen älykäs kuvantunnistus- ja analyysijärjestelmä
Automaattinen älykäs analyysijärjestelmä suorittaa pääasiassa kuvantunnistuksen ja data-analyysin mikrolinssien kuvantamisesta, jotta voidaan seurata sen kuvan hetkellistä vaihtelua ja siten päätellä näyteliuoksen taitekertoimen muutos antigeenin ja vasta-aineen reaktioprosessin aikana. Sen tarkkuus liittyy läheisesti kuvan laatuun, ja parametrit, kuten pikseli, pikselikoko ja resoluutio, vaikuttavat suoraan RI:n mittaukseen. Jos hyödynnetään CCD-digitaalikameraa, jossa on ≥10 miljoonaa pikseliä ja pieni pikselikoko, joka ulottuu alle 3 nm:iin, ja mikrolinssiä, jonka säde on 600 μm, taitekerroinmuutos määritetään keskimmäisen kirkkaan pisteen suhdeluvun ja ulomman renkaan säteen suhdeluvun muutoksilla siten, että mitattu taitekerroinmuutos voi olla 10-6 .
3.4. Lämpötilan säätöjärjestelmä
Lämpötilan säätöjärjestelmä on läpinäkyvä karkaistu lasilevy, jossa on ohut indiumtinaoksidikalvo ja jota ohjataan erittäin tarkalla PID-lämpötilansäätimellä (proportional-integral-derivative). Sen avulla näytteen lämpötila monikuoppaisessa mikrolinssi-testilevyssä saavutetaan nopeasti asetettuun arvoon 2 minuutissa ja pidetään 0,1 °C:n muutosalueella, jotta antigeenin ja vasta-aineen välinen reaktio olisi tehokas.
3.5. Mikrolinssi-testilevy
Monikuoppainen mikrolinssilevy on suunniteltu erityisesti mikrolinssi-immunomäärityslaitteelle. Se on valmistettu polymetyylimetakrylaattimateriaalista (PMMA), ja se valmistetaan yleensä 2 tai 16 puolisuunnikkaanmuotoisena kuoppana erilaisten toteamisvaatimusten täyttämiseksi. Jokaisen kuopan sisällä on mikrolinssi, jonka säde on useita satoja mikrometrejä. Mikrolinssilevyn käyttö tarjoaa objektiiviset olosuhteet monikanavaiselle detektiolle. Koska kuopan alapuolen halkaisija on vain noin 2 mm, useita mikrolitroja näyteliuosta riittää hukuttamaan mikrolinssin antigeenin ja vasta-aineen havaitsemiseen.
4. Immuunimikrokuvantamisjärjestelmän soveltaminen
4.1. Immuunimikrokuvantamisjärjestelmä
. Antigeeni-vasta-aine-reaktion mittaaminen
Huang ja hänen kollegansa havaitsivat erityyppisiä antigeeni-vasta-aine-reaktioita ja selvittivät niiden säännölliset piirteet. Ensinnäkin taitekerroin muuttui reaktioajan myötä antigeeni (Ag)-vasta-aine (Ab)-reaktiossa. Toiseksi RI:n vaihtelussa reaktioajan mukaan oli kolme vaihetta: nopeasti kasvava, suhteellisen vakaa ja hitaasti laskeva jakso. Ensimmäinen vaihe liittyi Ag:n ja Ab:n yhdistymiseen siten, että RI kasvoi äkillisesti Ag:n ja Ab:n nopean yhdistymisen myötä muodostaen komplekseja. RI:n maksimi on toisessa vaiheessa. Kolmanneksi Ag:n tai Ab:n pitoisuudella oli suuri vaikutus RI:hen. Näin ollen saamalla RI:n muutos Ag- tai Ab-konsentraation funktiona niiden pitoisuudet testatuissa näytteissä voidaan laskea sovituskäyrän avulla. Neljänneksi erilaiset vasta-aineet, kuten capture Ab ja probing Ab, vaikuttavat myös RI:n vaihteluun. Käyttämällä tätä tekniikkaa antigeeni-vasta-aine-reaktioiden mittaamiseen useilla Ag-Ab-järjestelmillä taitekertoimen muutoksen ja useiden erityyppisten antigeeni-vasta-aineliuosten pitoisuuksien (interferoni-γ (IFN-γ) Ag-Ab, istukan emäksinen fosfataasi (PAP) Ag-Ab, kallikreiini 6 (KLK6) Ag-Ab, ihmisen koriongonadotropiini (HCG) Ag-Ab, sydämen troponiini (cTnI) Ag-Ab, rasvahappoja sitovat proteiinit (FABP) Ag-Ab ja C-reaktiivinen proteiini (CRP) Ag-Ab -liuokset) (kuva 4). Koska tiedämme, että antigeeni-vasta-ainekompleksin assosiaatio ja dissosiaatio ovat dynaamisia prosesseja, perustuen RI vs. ajan suhteen ja laskemalla derivaatta ajan suhteen, voidaan myös saada tietoa assosiaatio- ja dissosiaationopeusvakioista ja (kuva 4 a)) ja muista termodynaamisista parametreista käyttämällä seuraavaa yhtälöä:
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
4.2. Kliinisten näytteiden mittaaminen
Kliinisten näytteiden testauksessa hyödynnettiin lisäksi immuunimikrosfäärikuvantamistekniikkaa. Tällä havaittiin 36 kliinisestä näytteestä CRP Ag:n pitoisuudet. Sen suhteellinen standardipoikkeama on noin 2-10 % verrattuna immunokromatografiaan, ja korrelaatiokerroin kahdella tavalla saatujen tulosten välillä on jopa 0,989 (kuva 5). On hyvin tiedossa, että kliinisesti hemolysoituneet seeruminäytteet voivat vaikuttaa suuresti perinteisillä menetelmillä havaittujen tulosten tarkkuuteen. Sitä vastoin hemolysoiduissa näytteissä mikrolinssin kuvat ovat edelleen selkeitä tämän tekniikan avulla. Suhteelliset virheet havaittujen antigeeniarvojen välillä näytteissä, joissa on hemolyysi, ja näytteissä, joissa ei ole hemolyysiä, ovat vain noin 2 %, mikä osoittaa, että hemolysoituneilla seeruminäytteillä on vähemmän vaikutusta tulosten tarkkuuteen.
Suurin osa antigeeneistä on proteiineja, kun taas muutamat ovat polysakkarideja, nukleiinihappoja ja muita aineita, ja kaikki vasta-aineet ovat proteiineja. Koska proteiini sisältää suuren määrän amidoa ja karboksyyliä, nämä polaariset ryhmät aiheuttavat kolloidisten hiukkasten sähköisen varauksen sähköstaattisen vaikutuksen vuoksi, ja hiukkaset, joilla on sama varaus, hylkivät toisiaan. Samaan aikaan polaariset ryhmät, jotka ovat voimakkaasti hydrofiilisiä, reagoivat vesimolekyylien kanssa ja muodostavat hydrataatiokerroksen hydrofiilisen kolloidin tuottamiseksi, mikä varmistaa, että proteiini ei agglomeroidu saostumaksi niin, että kolloidiset hiukkaset dispergoituvat tasaisesti liuoksessa .
Kun antigeeni yhdistetään vasta-aineeseen, kolloidisten hiukkasten sähköinen varaus vähenee tai katoaa, ja hydrataatiokerros katoaa tai ohenee myös. Proteiini muuttuu hydrofiilisestä hydrofobiseksi kolloidiksi . Elektrolyytin ympäristössä kolloidiset hiukkaset agglomeroituvat edelleen muodostaen antigeeni-vasta-ainekomplekseja, jotka voidaan havaita silmin . Hydrofiilisen ja hydrofobisen kolloidin taitekertoimet ovat huomattavan erilaiset. Siksi tällä tekniikalla voidaan seurata taitekertoimen dynaamisia muutoksia ja arvioida, tapahtuuko liuoksessa antigeeni- ja vasta-ainereaktioita. Antigeenin ja vasta-aineen konsentraation ja niiden reaktioajan välisen suhteen perusteella voidaan laatia standardikäyrä. Kompleksi kasvaa antigeenin ja vasta-aineen välisen reaktion edetessä, ja myös taitekertoimen muutos tulee selvemmäksi. Standardikäyrän avulla on helppo kvantifioida havaitun vasta-aineen tai antigeenin konsentraatio.
On osoitettu, että eri antigeenien epitooppeja komplementaarinen vasta-aine aiheuttaisi samanlaisen RI:n nousun Ag-Ab-reaktiossa mikrolinssikuvantamisimmunomäärityksessä. Kuten kuvissa 4(b) ja 4(c) on esitetty, antigeenimittaukset suoritettiin käyttämällä tietyn antigeenin osalta kaappaus-Ab:tä ja koestus-Ab:tä tai monoklonaalista Ab:tä ja polyklonaalista Ab:tä. Käyristä nähdään, että kahdenlaisten vasta-aineiden välillä ei ollut merkittävää eroa Ag-Ab-reaktion aikana tapahtuvan muutoksen aikaansaamisessa, mikä osoittaa, että mikrolinssi-imaging-immunomäärityksessä voidaan käyttää erityyppisiä vasta-aineita, joko kaappaus- tai koettelemis-Ab:tä ja monoklonaalista tai polyklonaalista Ab:tä havaitsemiseen. Monoklonaalinen Ab on kuitenkin suositeltavampi mikrolinssien kuvantamisimmunomäärityksessä, sillä se ei ainoastaan aiheuta suurempaa reaktiota korkeamman affiniteettinsa ansiosta antigeeniin, vaan myös vähentää väärän positiivisen ristireaktion mahdollisuutta, joten antigeenit voidaan havaita pienemmillä pitoisuuksilla. Kaiken kaikkiaan ristireaktio on teoreettisesti väistämätön tässä tekniikassa, kuten muissakin immunomäärityksissä. Toisin sanoen immunologisen mikrolinssikuvantamisen spesifisyys riippuu täysin kohdeantigeenia vastaan valittujen vasta-aineiden spesifisyydestä. Siksi on erittäin tärkeää seuloa sopivat vasta-aineet ja optimoida Ag-Ab-reaktiojärjestelmä.
6. Johtopäätökset
Tällä immuunimikrolisenssikuvantamistekniikalla voidaan nopeasti ja tarkasti mitata eri näytteiden RI:tä ja seurata RI:n reaaliaikaisia muutoksia antigeenin ja vasta-aineen reaktioprosessissa. RI muuttuu Ag:n tai Ab:n pitoisuuden muuttuessa. Näin ollen näytteiden pitoisuudet voidaan laskea kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti RI:n muutoksen perusteella Ag- tai Ab-konsentraation funktiona ilman merkintöjä, esimodifiointia, jälkipesua ja kalliita entsyymejä. Perinteisiin havaitsemistapoihin verrattuna tämän menetelmän etuja ovat tarkkuus, luotettavuus, nopeus (valmistuu muutamassa minuutissa) ja yksinkertaisuus ilman saastumista. Lisäksi sen havaitsemisraja on niinkin alhainen kuin pg/ml, mikä riittää vain muutaman μl:n määritykseen, ja se soveltuu myös hemolysoiduille kliinisille näytteille, joita on vaikea havaita perinteisillä menetelmillä. Lisäksi se ei häiritse näytteitä. Rinnakkainen valonsäteilytysjärjestelmä, korkean resoluution kamerajärjestelmä, automaattinen älykäs analyysijärjestelmä, automaattitarkennusjärjestelmä, lämpötilan säätöjärjestelmä ja mikrolinssihuokoinen havaitsemislevy muodostavat mikroskooppisen immunomäärityslaitteen. Se on pieni ja helppo kuljettaa.
On hyvin tiedossa, että antigeenin ja vasta-aineen reaktioon vaikuttavat suuresti sen oma pitoisuus, lämpötila, pH ja elektrolyyttiliuos. Tästä syystä nämä tekijät otetaan huomioon mikrolinssikuvantamisjärjestelmässä, jotta tiedot pysyvät vakaina niiden muutoksia tasapainottamalla. Tätä järjestelmää voidaan optimoida esimerkiksi valitsemalla sopivat materiaalit testilevylle, joka tarjoaa antigeenin ja vasta-aineen reaktiokohdan, ja tekemällä levystä hydrofiilinen hydrofobisten häiriöiden välttämiseksi. Tunnistustarkkuutta voidaan edelleen parantaa säätämällä antigeenin ja vasta-aineen suhdetta, seulomalla sopiva laimennusaine, muokkaamalla niitä metalli-ioneilla ja niin edelleen.
Antigeenin ja vasta-aineen havaitseminen on suhteellisen merkittävää biolääketieteellisissä tutkimuksissa, kliinisissä diagnooseissa, lääkeaineanalyyseissä, elintarviketurvallisuudessa ja ympäristön valvonnassa. Kun ihmiset ovat huolissaan ympäristöterveydestä, elintarviketurvallisuudesta ja terveydenhuollosta, herkän instrumentin kehittämisestä, jolla on alhaiset kustannukset, korkea tarkkuus, pieni koko, siirrettävyys ja yksinkertainen käyttö, on tullut kiireellinen yhteiskunnallinen tarve. Näin ollen tämä immuuni-mikrolinssien kuvantamistekniikka on lupaava sovellettavaksi laajasti eri aloilla, ja sitä on tarkoituksenmukaista popularisoida erityisesti yhteisössä ja maaseudulla.
Conflicts of Interest
Tekijät ilmoittavat, että tämän asiakirjan julkaisemiseen liittyviä eturistiriitoja ei ole.
Tekijöiden panos
Jiahui Liang ja Xiaotian Ye osallistuivat yhtä paljon tähän työhön.
Kiitokset
Olemme kiitollisia Guangzhoun kaupungin tiede- ja teknologiaohjelman synergistisen innovaation suurhankkeelle (apurahan numero: 201604020146) ja Kiinan kansalliselle luonnontieteelliselle säätiölle (apurahojen numerot: 81172824 ja 30971465) niiden antamasta rahoitustuesta.