DR. EDWIN B. ASTWOOD oli modernin endokrinologian visionääri. Roy Greepin ja Monte Greerin kirjoittama elämäkerrallinen muistelmateos päättyi seuraavasti: ”Konkreettisen tutkimuspanoksensa lisäksi tohtori Edwin B. Astwood onnistui harvojen saavuttamassa mittakaavassa kattamaan laajan alueen luonnontieteiden ja kliinisen lääketieteen välillä.” Minulle tämä on endokrinologian korkein kutsumus.”

1960-luvun loppua ja 1970-luvun alkua leimasivat kahden ryhmän uskomattomat saavutukset, tohtoreiden Andrew Schallyn ja Roger Guilleminin ryhmien, jotka eristivät, luonnehtivat ja sekvensoivat hypotalamuksen säätelyhormonit. Ensimmäinen sekvensoitu hypotalamuksen säätelyhormoni oli TRH (tripeptidi), toinen oli gonadotropiinia vapauttava hormoni (dekapeptidi) ja kolmas 14 aminohappoa sisältävä somatostatiini. GHRH:n olemassaolosta oli saatu viitteitä jo 1960-luvun alussa Reichlinin (1 ) klassisissa kokeissa; hän teki vaurioita hypotalamukseen ja osoitti, että GH:n pitoisuus aivolisäkkeessä väheni. Näiden tietojen perusteella hän ehdotti, että hypotalamuksessa on oltava GHRH.

Suoritin lääkärikoulutukseni Lontoossa, Englannissa, endokriinisen koulutukseni professori G. Michael Besserin johdolla. Yksi miellyttävimmistä konferensseista, joihin osallistuimme säännöllisesti, oli kliinisten tapausten esittely Royal Society of Medicinessä. Mieleeni on jäänyt, että aina kun akromegaliapotilas esiteltiin, professori Peter Sonksen kysyi, oliko potilaalla viitteitä karsinoidikasvaimesta vai ei. Yleisössä vallitsi käsitys: ”Miksi tämä mies esittää aina tämän kysymyksen?”, koska tällaisia tapauksia ei todennäköisesti ole olemassa, tai jos on, niin hyvin harvoin!”

Vuonna 1977 muutin St. Bartholomew’s Hospitalista (Lontoo, Englanti) Virginian yliopistoon. Pääasiallinen kiinnostukseni kohdistui tuolloin PRL:ää erittäviin aivolisäkekasvaimiin ja niiden lääketieteelliseen hoitoon.

Lokakuussa 1980 tohtori Ann Johanson lähetti minulle 21-vuotiaan potilaan. Tällä potilaalla oli amenorrea ja galaktorrea, kun hän käytti suun kautta otettavaa ehkäisyvälinettä sukurauhasen steroidien korvaamiseksi. Hänellä oli Turnerin oireyhtymästä johtuva sukurauhasen ageneesi.

Hänen arviossaan todettiin kallon röntgenkuvassa suurentunut aivolisäkekuoppa, tietokonetomografiakuvassa aivolisäkemassa, jolla oli vaatimaton suprasellulaarinen laajeneminen, ja seerumin PRL:n pitoisuus oli kohonnut 68 μg/l. Hänen kohonnut seerumin GH-arvonsa (95 μg/l) ei suppressoitunut suun kautta otettavalla glukoosilla, nousi TRH:lla ja suppressoitui dopamiini-infuusiolla. Hänen seeruminsa insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF)-I-taso oli koholla, 11 U/ml (normaali, 0,41-2,2 U/ml).

Näiden tulosten perusteella akromegaliadiagnoosi oli selvä. Mielenkiintoista on, että potilaan pituus oli 1,5 metriä, mikä on hyvin pitkä Turnerin oireyhtymää sairastavalle potilaalle. Tässä suhteessa oli onni, että seerumia oli säästetty edelliseltä seitsemältä vuodelta. Hänen seerumin GH-pitoisuutensa olivat olleet koholla koko tuon ajanjakson ajan (taulukko 1).

Potilas ohjattiin transsfenoidileikkaukseen, joka tehtiin 15. tammikuuta 1981. Seitsemän viikkoa leikkauksen jälkeen todettiin, että hänellä oli edelleen akromegalia; seerumin GH-pitoisuus oli 52 μg/l, ja IGF-I-pitoisuus oli edelleen koholla (7,7 U/ml).

Osana meneillään olevaa yhteistyötä aivolisäkkeen patologiset näytteet oli lähetetty tohtori Kalman Kovacsille (St. Michael’s Hospital, Toronto, Kanada). Jonkin aikaa myöhemmin tohtori Kovacs soitti ja kertoi minulle kudosten tutkimustulokset. Hänen raporttinsa osoitti, että potilaalla oli somatotrofinen hyperplasia eikä aivolisäkekasvain. Tähän diagnoosiin johtaneet syyt olivat seuraavat: 1) retikuliinikuvio oli säilynyt (se tuhoutuu kasvaimissa) (kuva 1); 2) somatotrofit olivat vallitsevia, vaikka tyreotrofeja, gonadotrofeja ja kortikotrofeja esiintyi sekaisin; ja 3) somatotrofien elektronimikroskooppitutkimuksessa havaittiin hyvin kehittynyt endoplasminen retikulum ja Golgin laitteisto, mikä viittasi aktiiviseen hormonisynteesiin (kuva 2). Koska somatotrofeissa oli tiheästi erittäviä granuloita, tämä viittasi minusta siihen, että tämä heijasti hormonien vapautumisen estymistä johtuen erittyneen GH:n palautteesta, oletettavasti tehostamalla somatostatiinin eritystä (ja/tai IGF-I:n).

Aivolisäkkeen histologian perusteella oli selvää, että aivolisäkettä stimuloi jokin eksternaalinen tekijä. Oli epätodennäköistä, että tämä johtui GHRH-reseptorin mutaatiosta tai GHRH-reseptoriin kytketyn G-proteiinin konstitutiivisesta aktivaatiosta, koska tämä todennäköisesti tapahtuisi yksittäisessä solussa, mikä johtaisi kasvaimen kehittymiseen ja retikuliinikuvion hajoamiseen. Siksi oli paljon todennäköisempää, että aivolisäkettä stimuloi ulkoinen tekijä, joko hypotalamuksesta tai periferiasta tuleva GHRH. Toiseksi jatkuva akromegalia teki välttämättömäksi sen, että löysimme tämän potilaan akromegalian syyn. Tuolloin Frohmanin ym. artikkelissa (2) kerrottiin osittaisesta puhdistuksesta ja karakterisoinnista peptidistä, jolla oli GH:ta vapauttava aktiivisuus akromegalisten potilaiden ekstrapituitaarisista kasvaimista.

Vatsan tietokonetomografiakuvaus osoitti halkaisijaltaan 5 cm:n suuruisen kasvaimen haiman hännässä. Kasvain poistettiin 26. elokuuta 1981. Se oli hyvin kapseloitunut, ja histologisessa tutkimuksessa se todettiin saarekesolukasvaimeksi. Kasvain ei kuitenkaan ollut β- eikä α-solukasvain. Se oli voimakkaasti positiivinen neuronispesifisen enolaasin suhteen, ja immunovärjäyksessä se oli negatiivinen GH:n, insuliinin, glukagonin, kalsitoniinin ja ACTH:n suhteen, ja somatostatiinin suhteen se oli epäselvästi värjäytynyt.

Immunosytokemiassa kasvain ei sisältänyt GH:ta. Ensimmäisten 2 tunnin aikana kasvaimen poiston jälkeen seerumin GH-pitoisuus laski nopeasti 70 μg/l:sta 3 μg/l:aan (kuva 3) (3). Potilasta on nyt seurattu 18 vuoden ajan, ja hän on edelleen parantunut akromegaliastaan.

Seuraava kysymys oli, mitä tehdä haimakasvaimelle. Tuolloin minulla oli onneksi edesmennyt tohtori Michael Cronin kolleganani Virginian yliopistossa. Michael tuli kanssani leikkaussaliin auttamaan huolellisesti laatimamme strategian toteuttamisessa kasvaimen käsittelemiseksi. Puolet kasvaimesta kuutioitiin ja laitettiin välittömästi nestemäiseen typpeen, ja toinen puoli valmisteltiin kudosviljelyä varten. Jälkimmäinen lähetettiin useille ryhmille, jotka olivat asiantuntijoita vakaiden solulinjojen luomisessa. Michael Cronin pystyi osoittamaan, että tätä kasvainta kylpevä väliaine sisälsi GHRH-aktiivisuutta ja stimuloi adenylaattisyklaasia (4). Kasvain toimitettiin alun perin tohtori Wylie Valelle Salk-instituuttiin (La Jolla, Kalifornia), ja hän antoi myöhemmin osan siitä tohtori Guilleminille. Nämä kaksi ryhmää havaitsivat itsenäisesti, että se sisälsi suurta GHRH-aktiivisuutta, ja pystyivät eristämään GHRH:n kasvaimesta, karakterisoimaan sen ja sekvensoimaan sen (5-8). Tästä kasvaimesta saatu GHRH oli 40 aminohappoa sisältävä peptidi, jolla on homologiaa glukagoni/sekretiini/VIP-peptidiperheen jäsenten kanssa.

Valitsin endokrinologian erikoisalaksi, koska mentorini iskostivat minuun fysiologian soveltamisen merkityksen ymmärtääkseni endokriinisiä sairauksia sairastavien potilaiden patofysiologiaa ja hoitoa.

Jokaista potilasta katsellessani on luonnon koe. Olin hyvin onnekas, kun minulle ohjattiin tämä potilas, joka mahdollisti sen, että minä ja kollegani pystyimme toimittamaan kasvaimen kahdelle johtavalle ryhmälle, jotka sitten pystyivät eristämään, karakterisoimaan ja sekvensoimaan kauan etsityn GHRH:n. Itse asiassa GHRH oli yksi ensimmäisistä hypotalamuksen hormoneista, joita etsittiin, mutta oli ollut monia vääriä lähtökohtia.

Oli useita syitä, miksi GHRH:n onnistunut karakterisointi ja sekvensointi oli mahdollista vuonna 1982. Ensinnäkin kasvainuutteiden aktiivisuuden arviointimenetelmiä oli hiottu ja ne olivat paljon herkempiä. Toiseksi mikrosekvensointimenetelmät olivat parantuneet huomattavasti edellisen 10 vuoden aikana. Kolmas ja luultavasti tärkein syy oli kuitenkin se, että tämä kasvain sisälsi suuria pitoisuuksia GHRH:ta ja hyvin vähän somatostatiinia. Somatostatiini estää GH:n vapautumista biotestissä, joten sen läsnäolo vaikeutti GHRH:n puhdistuksen seurantaa. Tästä kasvaimesta saatu uute yksinkertaisti prosessia huomattavasti (koska siinä oli suuria pitoisuuksia GHRH:ta ja vain vähän somatostatiinia) verrattuna aiempiin yrityksiin, joissa käytettiin satoja tuhansia eläinten hypotalamuksia, joissa oli runsaasti somatostatiinia ja hyvin pieniä pitoisuuksia GHRH:ta. Tämä oli ensimmäinen esimerkki yksittäisestä ihmisen kasvaimesta, jota käytettiin hormonin tunnistamiseen ja eristämiseen. PTH:hen liittyvä proteiini eristettiin vastaavalla tekniikalla käyttäen ihmisen kasvainsolulinjaa.

Klinikkalääkäreinä meillä kaikilla on vastuu tunnistaa luonnon kokeita ja tarttua tilaisuuksiin esittää kysymyksiä, joihin olisi hyvin vaikea vastata muulla tavoin. Luonnon kokeet ovat usein ainutlaatuisia, ja varmasti tätä edeltäneet 15 tai 20 potilasta antoivat viitteitä siitä, että ektooppista GHRH:n eritystä sairastavan potilaan kasvain voisi vastata kysymykseen GHRH:n luonteesta ja rakenteesta. Itse asiassa tohtori Guilleminin ryhmä sai sittemmin tietää tohtori Genevieve Sassolasin (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Ranska) toisesta kasvaimesta, ja koska heillä oli enemmän kudosta kyseisestä kasvaimesta, he tutkivat sitä aggressiivisemmin kuin Charlottesvillestä peräisin olevaa kasvainta. Alkuperäinen Charlottesvillen kasvain oli kuitenkin se, joka viittasi siihen, että tällainen kasvain saattaisi tarjota avaimen GHRH:n etsimiseen.

GHRH:n fysiologian myöhempi tutkiminen ja sen terapeuttinen potentiaali GH:n puutteen hoitona lapsilla on ollut ryhmämme työskentelyn keskipisteenä viimeisten 17 vuoden aikana (9, 10). Aluksi annoimme GHRH:ta normaaleille vapaaehtoisille ja osoitimme sen tehokkuuden ja spesifisyyden seerumin GH-pitoisuuksien nostamisessa (11). Sen jälkeen määrittelimme GH-vasteen akuuttiin GHRH-injektioon lapsilla, joilla on idiopaattinen GH:n puutos (kuva 4). Monilla lapsilla GH-pitoisuus nousi hyvin voimakkaasti, kun taas joillakin GH-pitoisuus nousi vain vähän tai ei lainkaan (12); vaste GHRH:lle oli suurempi kuin arginiinille ja l-dopalle. Näiden tulosten perusteella ehdotimme, että monet idiopaattista GH-puutosta sairastavat lapset kärsivät todella GHRH:n puutteesta.

Tällöin aloitettiin monikeskustutkimus GHRH-hoidosta. Tämä vaikutti erityisen tarkoituksenmukaiselta, koska GH-puutoksen hoitoon käytetty GH oli peräisin ruumiista, ja sen oli todettu olevan osallisena Jacob Creutzfeldin taudin tarttumisessa. Yhteensä 24 lasta hoidettiin; 10 lapselle annettiin pumpun avulla sc GHRH-bolus 3 tunnin välein. Tämä reitti ja annos valittiin jäljittelemään normaalia fysiologiaa, jossa kasvavilla lapsilla on noin yksi GH-pulssi 3 tunnin välein. Lisäksi 10 lasta hoidettiin pumpulla vain yön yli 3 tunnin välein, ja 4 lasta sai kaksi kertaa päivässä GHRH:n sc-injektioita. Lasten kasvunopeudet ennen hoitoa ja 6 kuukauden kuluttua hoidosta on esitetty kuvassa 5 (13).

Tämän tutkimuksen tulosten perusteella Serono Laboratories, Inc. aloitti 12 kuukauden monikeskustutkimuksen, jossa GHRH(1-29)-NH2 annettiin sc kerran päivässä (14). Hitaimmin kasvavilla lapsilla kasvunopeus lisääntyi eniten (kuva 6). Tämä viittaa siihen, että GHRH voi palauttaa fysiologisen GH-erityksen. Food and Drug Administration on hyväksynyt GHRH:n diagnostiseen käyttöön sekä lasten GH-puutoksen hoitoon. GHRH on turvallinen ja kiihdyttää kasvunopeutta tehokkaasti suurimmalla osalla GH-puutteellisista potilaista.

GHRH:n syntetisoinnin aikaan oli suurta kiinnostusta gonadotropiinia vapauttavan hormonin gonadotropiinivasteen alasäätelyyn. Meitä kiehtoi havainto toisesta potilaasta, jolla oli ektooppinen GHRH:n eritys metastaattisesta karsinoidikasvaimesta, joka synnytti akromegalian. Vaikka GHRH-pitoisuudet olivat jatkuvasti koholla koko 24 tunnin ajan, GH:n vapautumisen malli oli silti sykkivä, mikä osoittaa, että GH:n erityksen sykkivää mallia säätelevät oletettavasti muutkin tekijät (15). On ehdotettu, että tämä saattaa johtua somatostatiinin vetäytymisestä. Näin ollen ektooppinen GHRH-eritys osoittaa yksiselitteisesti, että pitkävaikutteinen GHRH-agonisti voi lisätä sykkivää GH-eritystä. GHRH:n jatkuvan iv-infuusion tutkimukset normaaleilla koehenkilöillä osoittavat saman ilmiön, ja näin ollen on selvää, että GHRH:n depotvalmiste voi olla hyödyllinen terapeuttinen aine.

Ryhmämme (16) ja Mayo (17) kloonasivat GHRH-reseptorin. On mielenkiintoista, että GHRH-reseptori kuuluu G-proteiinikytkentäisten reseptorien B-luokkaan, johon kuuluvat glukagoni-/sekretiiniperheen peptidien sekä CRH:n, kalsitoniinin ja lisäkilpirauhashormonin reseptorit. Niiden rakenne on täysin erilainen kuin suuremmilla rodopsiinireseptoreilla (A-perhe). Myös tässä reseptoriperheessä on kuitenkin seitsemän transmembraanin ylittävää domeenia.

GHRH:n kriittisen roolin osoittaa kääpiölit-hiiri, jolla on pistemutaatio GHRH-reseptorissa (18, 19). Wajnrajch ja muut (20) kuvasivat nonsense-mutaation (Glu 72stop) ihmisen GHRH-reseptorissa, joka aiheutti kasvuhäiriön ja GH:n puutteen kahdella lapsella, jotka olivat peräisin samasta intialaisesta muslimi-suvusta. Maheshwari ja muut (21) ovat kuvanneet Pakistanissa Sindhin laaksossa sijaitsevan suvun, jolla on sama mutaatio. Tämän suvun jäsenet ovat erittäin lyhytkasvuisia. Toinen reseptorin mutaatio on kuvattu suuressa brasilialaisessa suvussa, johon kuuluu yli 110 henkilöä, joilla on vaikea GH:n puutos ja äärimmäinen lyhytkasvuisuus (22). Nämä luontokokeet osoittavat, että GHRH-reseptorin vika heikentää normaalia kasvua, ja korostavat GHRH:n elintärkeää merkitystä.

Kuvassa 7 on esitetty GHRH-reseptorin piirroskuva (10). Asparagiinihappo kohdassa 60 aloituskodonista on hiiren lit-mutaation paikka. Western blottingia käyttäen C-terminaalista GHRH-reseptoriantiseerumia, joka oli kasvatettu ihmisen GHRH-reseptorin sekvenssiin perustuvalle peptidille, käytettiin sellaisten HEK293-solujen kalvojen tutkimiseen, jotka oli transfektoitu GHRH-reseptorin komplementaarisella DNA:lla. Tutkimukset osoittavat, että lit-hiiren reseptori käännetään proteiiniksi ja sitä todella on lit-hiiren aivolisäkesolujen kalvoissa. Olemme ehdottaneet, että tämä mutaatio johtaa reseptorin tertiäärirakenteen muutokseen, joka estää sitoutumisen (23). Valoaffiniteettikoettien avulla saamamme todisteet viittaavat siihen, että muut paikat ovat sidotun GHRH:n välittömässä läheisyydessä, mikä osoittaa, että signaalin transduktioon tarvitaan todennäköisesti useita vuorovaikutuskohtia. Rekombinanttireseptorin saatavuus tekee ei-peptidisten GHRH-agonistien etsimisen mahdolliseksi.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että yhden akromegaliaa sairastavan potilaan huolellisesta havainnoinnista saatu tieto johti GHRH:n eristämiseen, karakterisointiin ja synteesiin. Lisätutkimukset johtivat GH-puutoksen GHRH-hoidon käyttöönottoon. Myöhemmin me ja muut pystyimme kloonaamaan GHRH-reseptorin. GHRH:lla tehdyt tutkimukset ovat vahvistaneet, että se on välttämätön GH-synteesille ja normaalille kasvulle. Tämä kanta on nyt vahvistettu havainnoilla, joiden mukaan GHRH-reseptorin mutaatiot, jotka johtavat sen inaktivoitumiseen, johtavat syvään GH:n puutokseen ja vakavaan lyhytkasvuisuuteen ja sulkevat ympyrän ymmärryksessämme GH:n säätelystä GHRH:n avulla.