Soluviljelyssä soluja jaetaan keinotekoisessa ympäristössä (in vitro), joka koostuu tarvittavista ravintoaineista, ihanteellisesta lämpötilasta, kaasuista, pH-arvosta ja ilmankosteudesta solujen kasvattamisen ja lisääntymisen mahdollistamiseksi.

• In vivo – Kun tutkimukseen osallistuu eläviä biologisia yksiköitä elimistössä.

• In vitro – Kun tutkimuksessa käytetään biologisia yksiköitä (soluja, kudoksia jne.), jotka on eristetty niiden luonnollisesta biologisesta ympäristöstä. Esim. maksasta tai munuaisista eristetty kudos tai solut.

Mikäli kudospaloja voidaan laittaa sopivaan viljelyyn tuottamaan soluja, joita voidaan sitten käyttää viljelyyn (explantoviljely), kudoksista (pehmytkudoksista) voidaan saada soluja entsymaattisten reaktioiden avulla. Tällaisia entsyymejä, kuten trypsiiniä ja pronaamia, käytetään hajottamaan kudos ja vapauttamaan halutut solut.

Kun solut on saatu suoraan organismin/eläinkudoksesta (tai jopa kasvikudoksesta) entsymaattisten tai mekaanisten menetelmien avulla, tällaisia soluja kutsutaan primaarisoluiksi. Kuitenkin soluja, jotka jatkavat lisääntymistään loputtomiin (ensimmäisen aliviljelyn jälkeen) erityisolosuhteissa, kutsutaan solulinjoiksi.

Tällaisia soluja on yleensä kasvatettu pitkään, jolloin ne saavat homogeenisia (samanlaisia) genotyyppisiä ja fenotyyppisiä ominaisuuksia.

Morfologia

Viljelyssä olevat solut voidaan ulkonäkönsä perusteella luokitella kolmeen pääryhmään:

• Fibroblastiset – Tähän kuuluvat solut, joilla on taipumus olla bipolaarisia/multipolaarisia ja jotka ovat muodoltaan pitkulaisia. Nämäsolut kiinnittyvät substraattiin kasvaessaan.

• Epiteelisolut – Epiteelin kaltaiset solut saavuttavat monikulmaisen muodon, jolla on säännölliset mitat. Vaikka nämä solut kasvavat yleensä erillisinä laikkuina, ne kasvavat myös kiinnittyneinä substraattiin.

• Lymfoblastit – Nämä solut ovat yleensä pallomaisia eivätkä kiinnity substraatin pintaan. Tämän vuoksi niitä kasvatetaan suspensiossa.

* Kiinteissä levyissä käytetään jähmettyviä aineita (kuten agaria), kun nestemäistä elatusainetta käytetään agarin kanssa.

Soluviljelyn merkitys

Soluviljely on tärkeä tekniikka sekä solu- että molekyylibiologiassa, koska se tarjoaa parhaan alustan solujen normaalin fysiologian ja biokemian tutkimiseen. Solu on kaikkien elävien olentojen rakenteellinen, toiminnallinen ja biologinen perusyksikkö.

Organismin tai tietyn kudoksen ymmärtämiseksi on tärkeää ymmärtää, miten sen solut toimivat. Soluviljelyn avulla tämä on mahdollista erityisesti siksi, että alkusolut muistuttavat organismin/kudoksen vanhempien soluja.

Mitä tahansa soluista in vitro opitaankin, se edustaa sitä, mitä organismille/kudokselle tapahtuu. Tämä tekee soluviljelystä huomattavan tärkeän rokotteiden kehittämisessä, seulonnassa (lääkkeet jne.) ja tiettyjen sairauksien/tilojen diagnosoinnissa.

Koska erityyppiset solut vaativat erilaisia ympäristöjä lisääntyäkseen, on olemassa erityyppisiä elatusaineita, joita käytetään viljelyyn, kuten seerumivapaita elatusaineita ja seerumia sisältäviä elatusaineita.

Kun oikeat edellytykset on luotu, solujen määrä kasvaa ja ne voivat muodostaa pesäkkeitä, jotka voidaan sitten helposti nähdä ja tunnistaa.Kaikki tämä edellyttää kuitenkin, että toimenpiteen tarkoitus ymmärretään.

Kun tietää, mihin toimenpiteellä pyritään, on helpompi valmistaa viljely oikeilla komponenteilla. Ymmärtämällä, mihin menettelyllä pyritään, tutkija tietää, pitäisikö valmistaa selektiivinen väliaine (joka sallii tiettyjen solujen kasvamisen) vai differentiaalinen väliaine (joka sallii erityyppisten solujen kasvamisen).

Primaarinen soluviljely

Soluviljelyllä tarkoitetaan prosessia, jossa soluja (eläin- tai kasvisoluja) irrotetaan elimistöst{1704> ja siirret{³”a}{³”a}n keinotekoiseen ymp{³”a}rist{³”o}h{³”o}{³”o}{³”o}{³”o}{³”o}n jossa vallitsevat suotuisat olosuhteet kasvulle. Näin tutkijat voivat tutkia ja oppia lisää soluista.

Soluviljelyssä on kolme päätyyppiä, joita ovat:

• Primäärinen soluviljely
• Sekundäärinen soluviljely ja
• Solulinja

Keskitymme tässä ensisijaiseen soluviljelyyn.

Primäärisoluja on kahta tyyppiä:

Kiinnittyvät solut – Näitä soluja kutsutaan myös ankkurointipaikasta riippuvaisiksi soluiksi, ja ne ovat solutyyppejä, jotka vaativat kiinnittymistä kasvaakseen. Tarttuvat solut ovat liikkumattomia, ja niitä saadaan esimerkiksi munuaisista.

Suspensiosolut – Nämä ovat solutyyppejä, jotka eivät tarvitse kiinnittymistä kasvaakseen. Niitä kutsutaan siksi myös kiinnittymisestä riippumattomiksi soluiksi, ja niihin kuuluvat esimerkiksi verenkierrossa esiintyvät lymfosyytit.

Primäärisessä soluviljelyssä solut, jotka on saatu sellaisista kantakudoksista (elävistä kudoksista), kuten maksasta ja munuaisista, tuodaan sopivaan kasvualustaan. Kun solut on saatu, niitä voidaan kasvattaa joko solunsalpaajaviljelynä, suspensioviljelynä tai monokerrosviljelynä.

* Primaarisessa soluviljelyssä solujen on oltava peräisin vanhemmasta/elävästä kudoksesta. Toisin sanoen ne eivät ole peräisin jostain muusta viljelyprosessista.

Ennen kuin soluja viljellään, niille tehdään ensin entsymaattinen käsittely dissosiointia varten. Sen on kuitenkin kestettävä mahdollisimman vähän aikaa, jotta solut eivät vahingoittuisi tai kuolisi. Kun yksittäiset solut on saatu, niitä viljellään asianmukaisesti väliaineessa, jotta ne voivat kasvaa (jakautua) ja saavuttaa halutun lukumäärän.

Aluksi viljelmä on yleensä heterogeeninen siinä mielessä, että se koostuu erityyppisistä kudoksesta saaduista soluista.Vaikka tämä voidaan säilyttää in vitro -prosessin avulla (viljelyssä sopivassa elatusaineessa), se on mahdollista vain rajoitetun ajan.

Transformaatioprosessin avulla primaarisoluja voidaan käyttää pitkään, jolloin viljely muuttuu ajan mittaan. Näitä soluja kutsutaan jatkuvatoimisiksi solulinjoiksi.

Primäärisoluja suositaan kuitenkin yleensä jatkuvatoimisten solulinjojen sijaan, koska ne ovat (fysiologisesti) samankaltaisempia kuin invivo-solut (elävästä kudoksesta peräisin olevat solut). Lisäksi jatkuvissa solulinjoissa voi tapahtua tiettyjä muutoksia (fenotyyppisiä ja genotyyppisiä muutoksia), jotka aiheuttaisivat eroavaisuuksia analyysin aikana. Näin ollen niitä ei voida käyttää määrittämään, mitä in vivo -soluille tapahtuu. Tästä syystä primäärisoluja suositaan.

Koska primäärisolut muistuttavat huomattavasti elävästä kudoksesta saatuja soluja, ne ovat tärkeitä tutkimustarkoituksiin, koska niiden avulla voidaan tutkia niiden toimintoja, aineenvaihduntasäätelyä, solufysiologiaa, kehitystä, vikoja ja olosuhteita, jotka vaikuttavat kyseiseen kudokseen.

Myös niitä käytetään muun muassa rokotteiden tuottamiseen, geenitekniikan lääkeseulontaan sekä toksisuustestiin ja synnytysdiagnostiikkaan.

Soluviljelyvälineet

Soluviljelytekniikoissa solut (tai kudokset)irrotetaan kasveista tai eläimistä ja siirretään uuteen, keinotekoiseen ympäristöön, joka voi tukea solujen proliferaatiota (eloonjäämistä ja kasvua).

Joitakin tällaisen ympäristön vaatimuksia solujen lisääntymiselle ovat:

• Substraatti (ravinnonlähde)
• Ideaalinen lämpötila-alue (valvottu)
• Kasvualusta ja
• Ideaalinen pH muun muassa

Tässä, keskitymme väliaineeseen (soluviljelymedia)

Vaikka on olemassa erityyppisiä viljelymedioita (eri solutyypeille), ne koostuvat tyypillisesti seuraavista aineista:

• Glukoosi
• Aminohapot
• Vitamiinit
• Epäorgaaniset suolat
• Kiinnitystekijät jne.

Viljelyalustoja on kahta päätyyppiä.Näitä ovat:

Luonnollinen elatusaine – Luonnollinen elatusaine koostuu luonnossa esiintyvistä biologisista nesteistä. Vaikka tämäntyyppistä elatusainetta voidaan käyttää useille erilaisille soluille, sen suurin haittapuoli on se, että siitä saattaa puuttua juuri ne komponentit, joita tietyt solut tarvitsevat, mikä voi vaikuttaa suuresti toistettavuuteen.

Keinotekoinen elatusaine – Keinotekoisella elatusaineella tarkoitetaan elatusaineita, joita valmistetaan lisäämällä niihin muun muassa vitamiineja, kaasuja (happea ja hiilidioksidia) ja proteiineja. Nämä orgaaniset ja epäorgaaniset ravintoaineet lisätään siten, että ne täyttävät tiettyjen solujen erityistarpeet ja tarjoavat siten ihanteellisen ympäristön niiden kasvulle.

Siten niitä voidaan käyttää moniin tarkoituksiin, mm:

• Solujen välittömän eloonjäämisen mahdollistaminen
• Solujen pitkäkestoisen eloonjäämisen mahdollistaminen
• Solujen rajoittamattoman kasvun mahdollistaminen
• Erikoistuneiden toimintojen mahdollistaminen

Toisekseen viljelmät voidaan kategorisoida seuraavasti:

Selektiivinen media- Tämä on erityyppinen media, joka sallii vain tiettyjen solujen kasvun. Esimerkiksi veriagar (jota käytetään Streptococcus & Moraxella-lajien eristämiseen) voidaan muuttaa selektiiviseksi väliaineeksi lisäämällä siihen antibiootteja.

Differentiaaliset väliaineet- Tämäntyyppiset väliaineet mahdollistavat erityyppisten solujen/mikro-organismien kasvamisen niiden aineenvaihdunnasta riippuen.

Kuten edellä mainittiin, erityyppiset synteettiset väliaineet valmistetaan siten, että ne tuottavat tietylle solutyypille ideaalisen proliferaatioympäristön. Tästä syystä synteettiset elatusaineet voidaan jakaa neljään pääryhmään.

Näihin kuuluvat:

Serumia sisältävät elatusaineet – Näissä elatusainetyypeissä seerumia (naudan sikiöseerumi) käytetään muun muassa sellaisten ravintoaineiden ja kasvutekijöiden kantajana, joilla on taipumus olla veteen liukenemattomia.

Serumittomat elatusaineet – Tämäntyyppiset elatusaineet valmistetaan tyypillisesti yksittäisen solutyypin viljelyn tukemiseksi.Sellaisenaan ne sisältävät tiettyjä ravintoaineita ja muita solutyypin tarvitsemia tekijöitä. Näissä väliaineissa ei ole seerumia, koska siitä on joitakin haittoja ja se voi johtaa immunologisten tulosten väärään tulkintaan.

Kemiallisesti määritellyt väliaineet – Kuten nimestä voi päätellä,tämäntyyppiset väliaineet koostuvat kontaminaatiosta vapaista puhtaista orgaanisista ja epäorgaanisista ainesosista. Tämäntyyppisten väliaineiden ainesosat tuotetaan tyypillisesti geenitekniikan avulla bakteereissa/hiivaeläimissä.

Proteiinivapaat väliaineet – Proteiinivapaissa väliaineissa ei yleensä ole minkäänlaisia proteiineja. Sitä käytetään suurelta osin edistämään solujen parempaa kasvua ja proteiinien ilmentymistä sekä helpottamaan ilmentyneen tuotteen puhdistamista.

Soluviljelymedian tärkeimpiä komponentteja ovat:

• Ravintoaineet – joista huolehtivat proteiinien rakennusaineina olevat peptidit ja aminohapot
• Hiilihydraatit energiaa varten
• Välttämättömät mineraalit, kuten kalsium, magnesium, fosfaatit ja rauta muun muassa puskuriaineet, kuten asetaatit, jotka stabiloivat elatusaineita
• vitamiinit
• PH-muutosindikaattorit, kuten fenolipuna

Soluviljelmien elatusaineita käytetään solujen lisääntymiseen, minkä jälkeen ne voidaan tunnistaa ja tutkia. Sellaisenaan sitävoidaan käyttää erilaisiin tarkoituksiin, muun muassa koulutukseen, diagnosointiin ja sairauden hoitoon.

Solususpensio

Viljelymenetelmissä solususpensiolla viitataan viljelytyyppiin, jossa solut suspendoidaan nestemäiseen väliaineeseen.

Yksittäisten solujen saamiseksi mureneva kallus (pienikokoinen kudos, joka hajoaa helposti) laitetaan sekoitettavaan nestemäiseen väliaineeseen (sekoittaminen mahdollistaa kaasujen vaihdon toisin kuin kiinteässä väliaineessa), jolloin se hajoaa. Tämä mahdollistaa yksittäisten solujen irtoamisen, jotka sitten siirretään toiseen tuoreeseen väliaineeseen.

Solususpensioviljelmillä on suuri etu paikallaan oleviin soluviljelmiin nähden, koska ne mahdollistavat solujen tasaisen kylvetyksen. Lisäksi, koska väliaine yleensä sekoitetaan, se mahdollistaa väliaineen ilmastoinnin, jolloin solut saavat kaasuja. Koska väliaine on suspensiota, sen sisältöä on myös helppo manipuloida.

Kuten missä tahansa muussa viljelyssä, suspensiosoluviljelyssä on oltava valvotut olosuhteet, jotka tarjoavat soluille ihanteellisen ympäristön lisääntyä. Kun solut saavuttavat noin 80 prosentin konfluenssin, on aika subkulturoida, jotta voidaan varmistaa, että kasvu jatkuu moitteettomana.

* 80 prosentin konfluenssilla tarkoitetaan tilaa, jossa80 prosenttia viljelyn pinnasta on kasvavien solujen peitossa.

Joissakin tapauksissa suspensiossa olevat solut saattavat tarttua kiinni viljelyn pullojen muovipinnalle tai jopa muodostaa paakkuja. Tällaisissa tapauksissa voidaan käyttää pipettiä näiden solujen poimimiseen ja niiden karkottamiseen pullon pinnalle ja siten pois muovipinnalta. Näin saadaan yksittäisiä soluja, koska ne eivät tartu muovipinnalle.

Punasolususpensio

• (vasen: ilman hemolyysia) punasolusususpensio (0,5 % lampaan punasoluja keittosuolaliuoksessa) näyttää punaiselta ja läpinäkymättömältä.
• (keskimmäinen: ilman hemolyysia) Punasoluja sedimentoitui spontaanisti 60 min ajan. Huomaa, että supernatantti ei ole värjäytynyt.
• (oikealla: hemolyysi) RBC-suspensio, jota on käsitelty S. pyogenes -bakteerin hemolysiinillä 37 C:ssa 30 min, muuttuu hemolyysin vaikutuksesta läpinäkyväksi.

Katso lisää aiheesta Punasolut

Solujen laskeminen

Solujen lukumäärän laskeminen suspensiossaon prosessi, jossa käytetään värjäystä. Esimerkiksi trypaninsinistä käytettäessä se läpäisee kuolleiden solujen solukalvon, mutta ei elävien solujen.

Solut karkotetaan sitten varovasti hemosytometriin (sisältää laskentakammion) peitinliinan alle ja niitä tarkkaillaan mikroskoopilla. Solutlaskennan jälkeen solut lasketaan tietyn neliömäärän sisällä laskentaa varten.

Merkitys

Tämä menetelmä on suurelta osin suositeltavin, koska siinä solut suspendoidaan liuokseen sen sijaan, että ne pidettäisiin kiinteässä väliaineessa. Näin ollen sisältöä on helpompi manipuloida, mikä estää niitä muodostamasta klustereita. Solususpensioiden avulla on myös helpompi tarkastella yksittäisiä soluja mikroskoopilla.

Tällöin on mahdollista paitsi tutkia solujen rakennetta, myös tarkkailla, kuinka hyvin ne ovat erilaistuneet; kuolleita ja eläviä soluja voidaan tarkastella mikroskoopilla.

Soluviljelyprotokolla

Soluviljelyprotokollien tarkoituksena on varmistaa, että viljelymenetelmät suoritetaan vaadittujen standardien mukaisesti. Tarkoituksena ei ole ainoastaan estää solujen kontaminaatio, vaan myös varmistaa, että tutkijat itse ovat suojassa kaikenlaiselta kontaminaatiolta.

Työn luonteen odotetaan lisäksi olevan asianmukaisten eettisten ohjeiden mukainen. Sen vuoksi on ennen kaikkea varmistettava, että koko menettely on sekä lääketieteen eettisten että eläinkokeita koskevien ohjeiden mukainen. Tämä johtuu siitä, että tällaisen lainsäädännön ja ohjeiden vastainen toiminta voi johtaa ankariin rangaistuksiin ja jopa laboratorion sulkemiseen.

Toteuta seuraavat toimenpiteet ennen työn aloittamista:

• Varmista, että työskentelytila on desinfioitu (70-prosenttista etanolia käyttäen)
• Käytä aina uusia käsineitä. Jos käsineparia joudutaan käyttämään toiseen soluviljelytoimenpiteeseen, ne on desinfioitava 70-prosenttisella etanolilla ja annettava ilmakuivua.
• Kaikki kaapista pois otetut välineet on myös desinfioitava kontaminaation estämiseksi
• Tällaiset välineet, kuten pipetti,lasipurkit ja toimenpiteessä käytettävät muovit on autoklavoitava

Vaikka soluviljelyalustoja on monenlaisia, on tärkeää pitää mielessä, että soluviljelmät ja erityisesti primäärisoluviljelmät ovat helposti alttiita kontaminaatiolle sen lisäksi, että ne voivat sisältää havaitsemattomia viruksia. Tästä syystä kaikkea materiaalia on käsiteltävä mahdollisesti tartuntavaarallisena tartuntojen välttämiseksi.

Turvallisuussyistä soluviljelmillä työskentely on lisäksi suoritettava asianmukaisessa laminaarivirtaushupussa, jossa ilma ohjataan poispäin tutkijasta.

Soluviljelyn valmistuksen protokollat

Tarkista aina pakkauksen tiedot varmistaaksesi, että elatusaine on sopiva viljeltäville soluille,

Valmistuksen jälkeen, soluviljelmä on pidettävä suositellulla lämpötila-alueella,

Monitoroi viljelmää 30- 48 tunnin välein ja tarkista konfluenssi (kun solut peittävät kokonaan viljelmän pinnan) – Tämä riippuu kuitenkin suuresti solutyypistä.

Kun toimenpide on suoritettu ja solut analysoitu, viljely on hävitettävä asianmukaisesti. Tässä yhteydessä on noudatettava suurta varovaisuutta ottaen huomioon, että tähän mennessä solut ovat jo lisääntyneet ja niiden määrä on kasvanut. Lisäksi on erittäin todennäköistä, että näyte on kontaminoitunut, mikä lisää infektioiden aiheuttamisen riskiä tutkijalle, jos sitä ei käsitellä asianmukaisesti.

Hävittäminen

• Kontaminaation poistaminen voi edellyttää muun muassa skalpellien, lasiliuskojen ja peitinliuskojen kaltaisten esineiden autoklavointia 121 asteessa ja 15 psi:n paineessa (paine) vähintään 30 minuutin ajan. Jos ne kuitenkin hävitetään, on tärkeää, että ne laitetaan muovipussiin ja asianmukaiseen astiaan, jotta ne voidaan myöhemmin polttaa.
• Nestejätteiden osalta kemiallinen desinfiointi on yksi parhaista menetelmistä, joilla jätetuotteet voidaan inaktivoida. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää esimerkiksi valkaisuaineita, ennen kuin neste kaadetaan lavuaariviemäriin.
• Kiinteiden jätteiden osalta ne kerätään muovipussiin poltettavaksi. Toisaalta ne voidaan ensin autoklavoida ennen polttamista.

Johtopäätökset

Yleisesti ottaen soluviljelyssä, käytettiinpä sitten suspensiota tai paikallaan pysyvää elatusainetta, on kyse solujen kasvattamisesta keinotekoisessa ympäristössä, jossa on suotuisat olosuhteet. Vaikka entsymaattista toimintaa voidaan käyttää solujen saamiseksi viljelyä varten, mekaaninen erottelumenetelmä on suositeltavin, koska se tarjoaa yksinkertaisemman ja vähemmän traumaattisen tavan saada soluja.

Tässä menetelmässä kudos yksinkertaisesti leikataan pienemmiksi paloiksi, joista sitten kerätään valuneet solut. Solujen hankkimiseen voidaan käyttää myös primaarikuvantamistekniikkaa. Tämä menetelmä on kuitenkin hyödyllinen lähinnä pienempien kudosmäärien pilkkomiseen.

Vaikka mitä tahansa soluja voidaan käyttää viljelmissä niiden käyttäytymisen tarkkailuun, alkion kudoksia suositaan (primaaristen solujen osalta) aikuisten soluihin verrattuna, koska niistä saadaan elinkykyisempiä soluja, jotka pystyvät nopeasti lisääntymään.

Tässä yhteydessä on myös tärkeää varmistua siitä, että soluja on suurempia määriä ottaen huomioon, että niiden eloonjäämisprosentti on yleensä alhaisempi kuin osaviljelmissä. I

Viljelmien onnistumisen parantamiseksi on myös tärkeää varmistaa, että solujen vaurioituminen minimoidaan sekä solujen keräämisen että käsittelyn aikana. Tämä sen lisäksi, että käytetään kyseisille soluille sopivaaemediumia.

Katso samoilla linjoilla kudosviljelytyyppejä ja -tekniikoita.

Katso MicroscopeMasterin poimintoja mikroskooppitarvikkeista.

Sekä tietoa solunjakautumisesta, solujen erilaistumisesta ja solujen värjäytymisestä, ja saat käsityksen soluteoriasta.

Kehittyneemmille ja hyvä luettava on Molecular Biology of the Cell. Sekä oppia sytokemiasta.

Olet ehkä opiskelija, opettaja tai harrastaja ja haluat seurata MicroscopeMasterin tietoja hauskoista mikroskooppikokeista.

Katso myös Mikroskooppiviljely ja herkkyystestaus

Palaa soluviljelystä solubiologian pääsivulle

Palaa soluviljelystä Mikroskooppimestarin kotisivulle

.