Abstract

Melioidoosin ja räkätaudin aiheuttavat läheisesti sukua olevat lajit Burkholderia pseudomallei (Burkholderia pseudomallei -bakteeriyksilö) ja Burkholderia mallei (Burkholderia mallei -bakteeri). Melioidoosi on merkittävä sairastuvuuden aiheuttaja Kaakkois-Aasiassa, mutta räkätauti on erittäin harvinainen. Siprofloksasiinin ja doksisykliinin tehoa arvioitiin B. pseudomallei -kantaan ja B. mallei -kantaan, jotka olivat herkkiä molemmille mikrobilääkkeille in vitro. Porton-ulkoistetuille hiirille ja syyrialaisille hamstereille annettiin 40 mg/kg joko doksisykliiniä tai siprofloksasiinia kahdesti päivässä sc-injektiona jollakin seuraavista kolmesta annosteluohjelmasta: annostelu aloitettiin 48 tuntia ennen tartuntaa ja sitä jatkettiin 5 päivän ajan tartunnan jälkeen; 5 päivän hoito aloitettiin välittömästi tartunnan jälkeen; 5 päivän hoito aloitettiin 24 tuntia tartunnan jälkeen. Hiiret altistettiin B. pseudomallei 4845 -bakteerille (ip) ja hamsterit B. mallei 23344 -bakteerille (ip). Mikrobilääkkeen teho määritettiin tappavan mediaaniannoksen (MLD) muutoksen perusteella. Sekä siprofloksasiiniprofylaksia että välitön hoito nostivat B. pseudomallei -bakteerin MLD:n 4 × 106 cfu:hun 19 cfu:sta käsittelemättömissä eläimissä, mutta terapeuttinen siprofloksasiini nosti MLD:n vain 180 cfu:hun. Doksisykliinin tulokset olivat samanlaiset. Siprofloksasiiniprofylaksiini nosti B. mallei 23344:n MLD:n 4,6 × 105 cfu:hun verrattuna 4 cfu:hun käsittelemättömissä kontrolleissa. Välitön hoito nosti MLD:n 7,0 × 104 cfu:hun ja hoito nosti MLD:n 1,6 × 103 cfu:hun. Kaikki doksisykliinihoidot suojasivat hamstereita jopa 2 × 107 cfu:n haasteilta. Huolimatta herkän B. pseudomallei -kannan käytöstä kumpikaan mikrobilääke ei ollut tehokas terapeuttisesti käytettynä. Kummankin mikrobilääkkeen oikea-aikainen antaminen esti kuitenkin tehokkaasti oireisen infektion. Doksisykliini oli kahdesta mikrobilääkkeestä parempi kokeellista räkätautia vastaan, vaikka hoidetuilla eläimillä esiintyi uusiutumista noin 4-5 viikon kuluttua haasteesta.

Esittely

Melioidoosia ja räkätautia aiheuttavat läheisesti sukua olevat lajit Burkholderia pseudomallei ja Burkholderia mallei. Melioidoosi on merkittävä kuolleisuuden ja sairastavuuden aiheuttaja Kaakkois-Aasiassa, Pohjois-Australiassa ja Intian niemimaalla, kun taas räkätauti on erittäin harvinainen ja rajoittuu yleensä hevoseläinten tautiin joissakin osissa Lähi-itää, Aasiaa ja Etelä-Amerikkaa.1,2

Sen vuoksi B. pseudomallei -bakteerin mikrobilääkeherkkyyttä on tutkittu3-5 , ja melioidoosin mikrobilääkehoito on vakiintunut.5,6,6 Fluorokinolonien käyttö melioidoosin hoidossa on yleensä suljettu pois, koska joidenkin B. pseudomallei -kantojen in vitro MIC-arvot ovat korkeat ja ylittävät seerumissa saavutettavat arvot.4,5,5 Siprofloksasiinia, joko yksinään tai yhdistelmänä, on käytetty melioidoosin hoidossa tästä vasta-aiheesta huolimatta7,8 sillä perusteella, että siprofloksasiini voi tunkeutua fagosyyttisiin soluihin, joissa B. pseudomallei asuu, ja saavuttaa pitoisuuksia, jotka ovat 4-12 kertaa suuremmat kuin solunulkoinen pitoisuus9,10 . Näin ollen tavanomaisella oraalisella annostelulla voidaan saavuttaa 2-3 mg/l seerumipitoisuudet, joten teoreettisesti solunsisäiset pitoisuudet voivat olla jopa 20 mg/l.11 Lisäksi 9 mg/l seerumipitoisuudet voidaan saavuttaa laskimonsisäisellä infuusiolla, vaikkakin lyhytaikaisesti.11 Toinen näkökohta on se, että fluorokinolonit saattaisivat olla hyödyllisiä välittömässä hoidossa tai ennaltaehkäisyssä henkilöille, joiden tiedetään altistuneen melioidoosille tai joilla on suuri altistumisriski, varsinkin kun nykyisin ei ole olemassa keinoja immunoprofylaksiaan.

Räkätaudin vähäinen esiintyminen tämän vuosisadan jälkipuoliskolla merkitsee sitä, että B. mallei -bakteerin mikrobilääkeherkkyydestä, erityisesti nykyaikaisille mikrobilääkkeille, on niukasti tietoa, ja viimeaikaisessa mikrobiologisessa kirjallisuudessa olevat harvat viittaukset ovat pääasiassa venäläisistä lähteistä.12-18 Myöskään nykyaikaisten mikrobilääkkeiden tehoa in vivo ei tunneta hyvin. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että B. mallei -bakteerin herkkyys siprofloksasiinille on samankaltainen kuin B. pseudomallei -bakteerin herkkyys in vitro.19 Lisäksi B. pseudomallei -bakteeri ja B. mallei -bakteeri ovat hyvin samankaltaisia antigeenisyytensä, biokemiansa ja hyvin todennäköisesti myös patogeenisyytensä, erityisesti solunsisäisen eloonjäämisen osalta.20 Perustelut, jotka puoltavat siprofloksasiinin käyttöä melioidoosin hoidossa, soveltuisivat näin ollen myös räkätautiin, mutta samalla olisi otettava huomioon sen heikko teho kliinisissä tutkimuksissa.

Doksisykliiniä käytetään yksinään paikallisen melioidoosin hoidossa ja yhdessä muiden mikrobilääkkeiden5 kanssa systeemisen taudin hoidossa, joten siitä voi olla jonkinlaista hyötyä melioidoosin ennaltaehkäisevänä tai välittömänä hoitona. Lisäksi se voi siprofloksasiinin tavoin tunkeutua solunsisäisesti ja tehoaa monenlaisiin solunsisäisiin patogeeneihin.21 Aiemmissa kokeissa doksisykliini osoitti hyvää in vitro -aktiivisuutta B. mallei -bakteeria vastaan.19

Siprofloksasiinin ja doksisykliinin profylaksian ja välittömän hoidon tehoa mitattiin kokeellista melioidoosia vastaan hiirimallissa ja kokeellista räkätautia vastaan hamsterimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Haastekannat, säilytys ja viljely

Kummatkin organismit on luokiteltu vaarallisia taudinaiheuttajia käsittelevässä neuvoa-antavassa komiteassa (ACDP, Advisory Committee on Dangerous Pathogens) luokkaan 3 kuuluviksi taudinaiheuttajiksi, minkä vuoksi kaikki bakteriologiset toimenpiteet suoritettiin luokan 3 turvakaapeissa, jotka olivat BS5726:n mukaisia.

B. pseudomallei NCTC 4845 ja B. mallei ATCC 23344 käytettiin melioidoosin ja räkätaudin haastekantoina. Molemmat lajit säilytettiin -80 °C:ssa Protect-helmisäilytysjärjestelmässä (TSC Ltd, Heywood, Lancashire, Yhdistynyt kuningaskunta), kunnes niitä tarvittiin. Haasteviljelmät ja laskennat kasvatettiin ravintoagarilla tai ravintoaineliemellä, ja in vitro mikrobilääkeherkkyystutkimukset tehtiin Mueller-Hinton-liemellä.

Antimikrobilääkkeiden valmistelu

In vitro-kokeita varten doksisykliini- (Sigma, Poole, Iso-Britannia) ja siprofloksasiinijauheet (Bayer, Newbury, Iso-Britannia) liuotettiin ionivaihdettuun veteen niin, että saatiin kantaliuoksia, joiden pitoisuudet olivat 10 mg/l. Annosteluliuokset valmistettiin joka päivä tuoreeltaan liuottamalla doksisykliinijauhe fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen ja siproksiinitabletit (Bayer) ionivaihdettuun veteen ja steriloimalla liuokset suodattimella.

In vitro mikrobilääkeherkkyystestaus

Bakteerit otettiin talteen asettamalla viisi-kuusi ”Protect”-helmiä Mueller-Hinton-liemeen (Oxoid, Basingstoke, Iso-Britannia) ja inkuboimalla viljelmiä staattisesti 37 °C:n lämpötilassa 24 tuntia B. pseudomallei -bakteerin ja 48 tuntia B. mallei -bakteerin osalta. Käytettiin NCCLS:n ohjeiden mukaista mikrotitiitterilevyjen laimennusmenetelmää.22 Lyhyesti sanottuna 96-kuoppaiset mikrotitiitterilevyt, jotka sisälsivät kutakin mikrobilääkettä laimennettuna 0,063 mg/l:stä 64 mg/l:iin, valmistettiin etukäteen ja säilytettiin -20 °C:ssa. Noin 5 × 105 cfu/ml:n inokulaatio (määritetty käyttäen McFarlandin standardia 5) 100 μl:ssä valmistettiin yön yli tai 48 tuntia kestäneistä viljelmistä Mueller-Hinton-liemessä, ja se lisättiin kaikkiin kuoppiin. Levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa 18-20 tuntia. Koska B. mallei -bakteeri kasvaa hitaasti, levyjä oli inkuboitava 36 tuntia ennen MIC-arvon lukemista.

Laadunvalvontastandardeina käytettiin Escherichia coli ATCC 25922:ta ja Staphylococcus aureus ATCC 29213:ta (NCIMB, Aberdeen, UK).

eläinmallit

Kaikki eläinkokeet tehtiin vuoden 1986 Scientific Procedures Act (Animals) -lain (eläimiä koskeva laki) ja tieteellisissä toimenpiteissä käytettävien eläinten pitoa ja hoitoa koskevien käytännesääntöjen (Codes of Practice for the Housing and Care of Animals used in Scientific Procedures), 1989, mukaisesti.

Naaraspuolisia Porton-ulkojalostettuja hiiriä (sisäisesti kasvatettuja) ja syyrialaisia hamstereita Lakeview-kannasta (Charles River, Margate, Iso-Britannia) käytettiin melioidoosin ja räkätaudin koekokeisiin. Hiiriä pidettiin viiden eläimen häkeissä ja hamstereita pareittain BS5726-standardin mukaisessa jäykkiseinäisessä puolikiinteässä eristyksessä. Niihin sovellettiin 12 tunnin valo- ja 12 tunnin pimeäjaksoa, ja niillä oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Sekä hiirille että hamstereille annettiin kaupallista jyrsijöiden ruokavaliota, ja hamstereille annettiin lisäksi auringonkukansiemeniä kerran viikossa.

Aiemmissa tutkimuksissa nitriilikumihansikkaat, joita käytettiin puolipuvun kanssa, ovat tarjonneet riittävän suojan hiirien vahingossa aiheuttamilta puremilta kotieläinten hoidon ja toimenpiteiden aikana. Vaikka Lakeview-kantainen syyrialainen hamsteri on tunnettu tottelevaisuudestaan, nitriilikumihansikkaiden päällä käytettiin varotoimenpiteenä teollisia pistosuojakestäviä Kevlar-käsineitä, kun käsiteltiin tartunnan saaneita hamstereita.

Mikrobilääkkeiden anto

Kahta mikrobilääkettä käytettiin annoksella 40 mg/kg ruumiinpainoa, joka annettiin kahdesti vuorokaudessa kahdentoista tunnin välein injektiona sc-ruiskeena 0,1 ml:n painoisina 0,1 ml:n injektioina hiirille ja 0,1 ml:n injektioina 0,1 ml:n injektioina hiirille.2 ml:aan hamstereissa jommankumman kolmesta hoitomuodosta mukaisesti: profylaksiahoito, jossa mikrobilääkkeet aloitettiin 48 h ennen haasteeseen joutumista ja sitä jatkettiin 5 päivää haasteeseen joutumisen jälkeen; välitön tai suppressiivinen hoito, jossa mikrobilääkkeet annettiin välittömästi haasteeseen joutumisen jälkeen ja sitä jatkettiin 5 päivää; ja terapeuttinen hoitomuoto, joka koostui mikrobilääkkeistä, joita annettiin 5 päivän ajan 24 h haasteeseen joutumisen jälkeen alkaen.

Kahdelle muulle hiiriryhmälle, jotka haastettiin B. pseudomallei -bakteerilla, annettiin ennaltaehkäisevää hoitoa kuvatulla tavalla, paitsi että antibioottien antoa jatkettiin 10 päivän ajan haasteesta.

Eläinten haastaminen ja virulenssin arviointi

Kunkin patogeenin virulenssi määritettiin mittaamalla mediaaninen tappava annos (MLD), joka määritellään annokseksi, joka tarvitaan tappamaan 50 % pienestä eläinpopulaatiosta (25-30) laskettuna Reedin & Muenchin & menetelmän mukaisesti.23 Mikrobilääkkeen teho mitattiin vertaamalla käsiteltyjen eläinten MLD:tä käsittelemättömien kontrollien MLD:hen.

B. pseudomallei:n ja B. mallei:n haasteviljelmät valmistettiin ottamalla talteen sopivia ”Protect”-helmiä ravintoaineliemeen ja inkuboimalla 24 tuntia ja 48 tuntia.

Hiiret haastettiin viiden hengen ryhmissä 0,1 ml:lla B. pseudomallei -suspension sarjalaimennoksia ip-injektiona ja niitä tarkkailtiin 35 päivän ajan haastamisen jälkeen. Hamsterit, neljän hengen ryhmissä, haastettiin 0,2 ml:lla B. mallei -suspension sarjalaimennoksia ip-injektiona ja niitä tarkkailtiin 23 päivän ajan haasteen jälkeen. Kahdeksan hamsteria, joille annettiin välitöntä doksisykliinihoitoa, ja kahdeksan hamsteria, jotka saivat 24 tunnin doksisykliinihoitoa, pidettiin 5 viikkoa tartunnan jälkeen jatkotutkimuksia varten. Molemmissa eläinmalleissa profylaksiaryhmät haastettiin noin puolivälissä mikrobilääkeannosten välillä.

Kun kunkin infektion merkit ja oireet oli luonnehdittu, inhimilliset päätetapahtumat havainnoitiin aina, kun se oli käytännössä mahdollista. Ruumiinavaukset suoritettiin eristyksessä. Elimet puolitettiin ja levitettiin ravintoagarille, jota inkuboitiin 24 tuntia 37 °C:ssa B. pseudomallei:n osalta ja 48 tuntia 37 °C:ssa B. mallei:n osalta. Levyillä kasvavien pesäkkeiden tunnistaminen varmistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR).

PCR

Yksittäiset pesäkkeet poimittiin 200 μl deionisoituun veteen ja keitettiin 5 minuuttia. DNA monistettiin B. pseudomallei:n ja B. mallei:n 16S rRNA:ta koodaaville geeneille komplementaarisilla oligonukleotidi-alkuaineilla. PCR-monistaminen suoritettiin lisäämällä 18 μl seuraavaa seosta: 1 × PCR-puskuri (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Saksa); 0. PCR-puskuri (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Saksa); 0. PCR-puskuri (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Saksa).2 mM PCR-nukleotidiseosta (Boehringer-Mannheim), 180 ng sekä 3′- että 5′-oligonukleotidialukkeita, 5 % (v/v) dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja 0,5 U Taq-polymeraasia (Boehringer-Mannheim) 2 μL:aan pesäkesuspensiota. Amplifiointi suoritettiin Perkin-Elmerin lämpösyklerissä (Perkin-Elmer Cetus, Warrington, UK) seuraavissa olosuhteissa: 30 sykliä 95 °C:ssa 30 sekuntia, 50 °C:ssa 1 minuutti ja 72 °C:ssa 1 minuutti, jota seurasi 10 minuutin pidennysaika 72 °C:ssa. PCR-tuotteet analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla ja tuotekaistat visualisoitiin etidiumbromidivärjäyksellä 2-prosenttisella TAE-geelillä (40 mM tris-asetaatti, 1 mM EDTA).

Tulokset

In vitro -herkkyys

Kumpikin B. pseudomallei 4845 ja B. mallei 23344 olivat herkkiä tai kohtalaisen herkkiä siprofloksasiinille ja doksisykliinille in vitro; B. pseudomallei esti 2.0 mg/l siprofloksasiinia ja 1,0 mg/l doksisykliiniä ja B. mallei inhiboitui 1,0 mg/l siprofloksasiinilla ja 0,25 mg/l doksisykliinillä.

In vivo herkkyys B. pseudomallei

Kontrollihiiret altistettiin vatsansisäisesti B. pseudomallei -bakteerin log-laimennossarjalle, jonka log-laimennokset vaihtelivat 0,3 cfu:sta 2,9 × 103 cfu:iin, mikä johti levinneeseen ja nopeasti kuolemaan johtavaan infektioon. Eläimet sairastuivat 24-48 tunnin kuluessa haasteesta, mikä ilmeni epäspesifisinä oireina, kuten piloereaktiona, ja eläimet, joille annettiin korkeampia B. pseudomallei -pitoisuuksia, menehtyivät 96 tunnin kuluessa haasteesta. Ruumiinavauksessa havaittiin hyvin vähän karkeat muutokset, vaikka bakteereja voitiin eristää maksasta, pernasta, keuhkoista ja verestä. Myöhemmin menehtyneissä eläimissä esiintyi merkittävää pernomegaliaa ja toisinaan hepatomegaliaa. Pernaan ja haimaan ja harvemmin maksaan kehittyi lukuisia pieniä paiseita. MLD-arvo laski 111 cfu:hun 7 päivän kuluessa haasteesta, ja se laski edelleen kolmen viikon kuluessa lopulliseen MLD-arvoon 20 cfu:ta (kuvat 1 ja 2). Eloonjääneiden eläinten ruumiinavauksessa ei havaittu mitään karkeaa muutosta, ja elimet olivat vapaita B. pseudomallei -bakteerista.

Käsitellyille hiirille annettiin sarja log-laimennoksia, joiden log-laimennokset vaihtelivat 180 cfu:sta 1,8 × 107 cfu:n B. pseudomallei -bakteeriin. Kahden mikrobilääkkeen tehossa ei ollut juurikaan eroa. Kummankin aineen ennaltaehkäisevä tai välitön käyttö suojasi 1 × 107 cfu:n bakteereilta, kun mikrobilääkettä annettiin. Muutamat eläimet sairastuivat uudelleen viiden viikon aikana, ja dramaattisimmin tämä tapahtui doksisykliiniprofylaksia käyttäneessä ryhmässä 11 ja 21 vuorokauden välisenä aikana tartunnan jälkeen. Kokeen lopussa MLD-arvot olivat kuitenkin huomattavasti korkeammat kuin kontrolleissa, vaihdellen 1,4 × 106 cfu:n ja 4,6 × 106 cfu:n välillä (kuvat 1 ja 2). Eloonjääneiden eläinten ruumiinavauksessa havaittiin splenomegaliaa vähemmistössä eläimistä, vaikkakaan ei siinä määrin kuin kontrolleissa, ja joissakin tapauksissa esiintyi paiseja. B. pseudomallei -bakteeri voitiin eristää joidenkin eläinten elimistä, myös sellaisten eläinten, joilla ei ollut mitään ilmeisiä karkeamuodostumia.

Jommankumman mikrobilääkkeen terapeuttinen käyttö viivästytti infektion kulkua, mutta viiden viikon aikana se tarjosi vain minimaalisen suojan, sillä lopullinen MLD-arvo oli siprofloksasiinilla 180 cfu:ta ja doksisykliinillä 640 cfu:ta (Kuvat 1 ja 2).

B. mallei -bakteerin herkkyys in vivo

Hamstereita haastettiin vatsansisäisesti sarjalla log-laimennoksia, joiden log-laimennokset vaihtelivat 0,3 cfu:sta 2,9 × 107 cfu:n B. mallei -bakteeriin. Infektio eteni hyvin nopeasti, ja sille olivat ominaisia tunnusomaiset oireet. 24-48 tunnin kuluessa eläimet muuttuivat alistuneiksi ja vähemmän aktiivisiksi. Ensimmäisenä taudin merkkinä oli vetinen vuoto silmistä, jotka muuttuivat märkiviksi. Myöhempiä oireita olivat raajojen turvotus ja keuhkopussin tuntuva kitinä. Kaikki kuolemantapaukset / inhimilliset päätetapahtumat tapahtuivat 7 päivän kuluessa tartunnasta (kuva 3). Ruumiinavauksessa havaittiin vain vähän muutoksia, ja vallitsevana piirteenä oli splenomegalia, ja toisinaan sekä pernassa että haimassa esiintyi abskesseja.

Profylaktinen siprofloksasiinihoito ja välitön siprofloksasiinihoito suojasivat eläimiä jopa 2,9 × 107 cfu:n aiheuttamilta haasteilta 18 vuorokauden ajan, minkä jälkeen eläimet sai äkillisen relapsin, jonka seurauksena MLD-arvo laski 4,6 × 105 cfu:iin ja 7 × 104 cfu:iin kokeilun päättyessä (kuva 3). Kuolleiden eläinten ruumiinavauksessa havaittiin laajentunut perna, jossa oli yksi tai kaksi suurta paiseumaa. Eloonjääneiden eläinten ruumiinavauksessa paljastui yleensä pernomegalia, jossa oli satunnaisesti paise, josta B. mallei voitiin eristää.

Kun siprofloksasiinihoito aloitettiin, kahdeksalla eläimellä, joille annettiin suurimmat haasteet, ilmeni taudin oireita. Kahden eläimen tila huononi hoidosta huolimatta, kolmen eläimen tila pysyi vakaana, eikä se enää huonontunut, mutta ei myöskään selvästi parantunut, ja kolmen eläimen tila parani. Kahta alkuvaiheen tapausta lukuun ottamatta eläimet selvisivät jopa 2,9 × 107 cfu:n haasteista 11 päivän ajan. Uusiutumisia esiintyi aluksi 11-18 päivän välillä niillä eläimillä, joilla oli ollut oireinen tauti. Alempien haastatteluryhmien relapseja esiintyi 18 päivän jälkeen kokeen loppuun asti, ja lopullinen MLD-arvo 23 päivän kuluttua haastattelusta oli 1,6 × 103 cfu:ta (kuva 3). Kuolleiden ja eloonjääneiden eläinten ruumiinavauslöydökset olivat identtiset muiden hoitomuotojen kanssa.

Kaikki doksisykliinihoitomuodot suojasivat hamstereita jopa 2,9 × 107 cfu:n haasteilta, eikä relapseja havaittu 23 vuorokauden pituisen koejakson aikana, mukaan lukien kahdeksan oireilevan hamsterin paraneminen terapeuttisessa ryhmässä. Eloonjääneiden eläinten ruumiinavauksessa havaittiin splenomegaliaa joissakin eläimissä, vaikka B. mallei -bakteeria ei saatu talteen.

Relapseja esiintyi kuitenkin eläimissä, jotka jäivät eloon, ja tauti ilmaantui uudelleen neljällä kahdeksasta hamsterista, joille annettiin välitöntä hoitoa, ja yhdellä eläimistä, jotka saivat terapeuttista hoito-ohjelmaa 28-31 päivän kuluttua haasteesta. Ruumiinavauksissa paljastui lukuisia pernan, maksan ja haiman paiseet, joista B. mallei eristettiin.

Keskustelu

Kumpikin B. pseudomallei ja B. mallei, joita annettiin vatsaontelonsisäisesti, aiheuttivat nopeasti invasiivisen ja kuolemaan johtavan infektion vastaavissa eläinmalleissa, jotka toistivat fulminantin systeemisen infektion, joka on samanlainen kuin ihmisen melioidoosissa ja räkätaudissa. Melioidoosilla ja räkätaudilla on kuitenkin muita kliinisiä ilmenemismuotoja, kuten krooninen abskessi-infektio tai rauhallinen infektio, jonka oireiden ilmaantuminen voi kestää useita vuosia.2,24,25 Tässä raportoituja eläinmalleja voidaan manipuloida kroonisten infektioiden toistamiseksi. Kokeellisessa melioidoosissa hiirten krooninen abskessi-infektio voidaan saada aikaan joillakin eläimillä ihonalaisella altistuksella tai käyttämällä erilaisia hiirikantoja, kuten C57B6-sisäsiittiöitä tai Swiss-Webster-ulkosukuja (julkaisemattomat tiedot). B. mallei -infektio Balb/C-, C57B6- ja Swiss-Webster-ulkoistettuihin hiiriin johtaa krooniseen, ei-tappavaan tautiin ja krooniseen, kuolemaan johtavaan tautiin, jolla on korkea MLD Porton-ulkoistetuissa hiirissä (julkaisemattomat tiedot). Näissä kokeissa akuutti malli oli kiinnostava, koska se edustaa luultavasti ”huonompaa tapausta” eli infektiota, joka siprofloksasiinilla tai doksisykliinillä estettynä saattaa myös estää kroonisen taudin syntymisen. Lisäksi monet melioidoositapaukset ilmenevät akuuttina tautina, vaikka voi olla epäselvää, onko infektio tuore vai onko se akuutti ”kriisi” potilailla, joilla on saattanut olla subkliinisiä infektioita pitkän aikaa.

Kiinnostava piirre taudissa eläinmalleissa oli haiman osallistuminen abskessien syntypaikkana, mikä oli erityisen huomattavaa hamsterimallissa. Sekä B. pseudomallein että B. cepacian on raportoitu sitoutuvan insuliiniin26 , mikä saattaa viitata kykyyn sitoutua insuliinireseptoreihin, mikä selittäisi haiman osallistumisen. Lisäksi diabetes mellitus on yleinen altistava tekijä ihmisen taudille, vaikka joissakin kroonisissa tautitapauksissa ei olekaan selvää, aiheuttaako B. pseudomallei diabeteksen vai aiheuttaako diabeteksen taustalla oleva diabetes oireisen taudin. Haimatauti ihmisen melioidoosissa on kuitenkin harvinainen5 , eikä sen merkitystä räkätaudissa tunneta.

Siprofloksasiinin ja doksisykliinin on raportoitu olevan huonompia kuin muut mikrobilääkkeet yksinään tai yhdistelmänä melioidoosin hoidossa ihmisillä, ja niihin liittyy korkea uusiutumisaste.7,8 Kliiniset havainnot heijastivat näissä tutkimuksissa hoitoryhmissä havaittuja tuloksia, vaikka kokeellinen kanta oli herkkä tai kohtalaisen herkkä kullekin mikrobilääkkeelle ja mikrobilääkkeen seerumin ja kudosten pitoisuudet ylittivät in vitro MIC-arvon. Siprofloksasiinin MIC-arvo B. pseudomallei 4845:tä vastaan oli tyypillinen 50 prosentille laboratoriossamme tehdyssä laajemmassa tutkimuksessa19 testatuista B. pseudomallei -kannoista, mutta alhainen verrattuna muihin tutkimuksiin.3,4 Doksisykliinin MIC-arvo oli korkein mitattu kaikille laboratoriossamme testatuille B. pseudomallei -kannoille19 , mutta jälleen alhainen verrattuna muihin tutkimuksiin.5 Siprofloksasiinin tai doksisykliinin profylaktinen ja välitön altistumisen jälkeinen käyttö tarjosi hyvän suojan, vaikka mahdollisuus profylaksian tai välittömän hoidon antamiseen kliinisissä tapauksissa rajoittuu tilanteisiin, kuten laboratoriotapaturmiin tai välittömään ennaltaehkäisevään hoitoon traumaattisen vamman jälkeen endeemisillä alueilla. Kokeet osoittivat, että ”tilaisuusikkuna” eli aika, joka kuluu taudinaiheuttajalle altistumisen ja infektion onnistuneen estämisen välillä mikrobilääkkeillä, oli alle 24 tuntia haasteesta.

Profylaktisen ja välittömän hoidon ryhmissä esiintyi jonkin verran relapseja, mikä saattoi johtua useista tekijöistä; pääasiassa siitä, että mikrobilääkkeen antamisen kesto oli lyhytaikainen, vaikkakin kliinisessä tilanteessa hoitoa pidennettäisiin, jos käytettäisiin profylaksiaa. Tärkeää olisi myös kunkin mikrobilääkkeen vertaileva farmakokinetiikka suhteessa in vitro MIC-arvoon ja bakteerien kyky asua etuoikeutetuissa solunsisäisissä paikoissa, joihin mikrobilääkkeet eivät ehkä pääse käsiksi.

Doksisykliinin annostelun pidentäminen kymmeneen vuorokauteen haasteen jälkeen esti uusiutumisen (kuolemantapauksia esiintyi edelleen annostelun aikana), mutta siprofloksasiinin annostelun pidentäminen lisäsi uusiutumisten määrää. Doksisykliinin farmakokinetiikka oli parempi B. pseudomallei -bakteerin hävittämisessä kuin siprofloksasiinin. Doksisykliinin huippupitoisuus seerumissa oli 3,7 mg/l, ja seerumipitoisuus ylitti MIC-arvon 24 tunnin ajan annostelun jälkeen. Pernan huippupitoisuus oli 4,1 mg/kg, ja pitoisuus ylitti 1 mg/kg 9 tunnin ajan. Siprofloksasiinin seerumin huippupitoisuus oli 2,9 mg/l, ja MIC-arvo ylittyi vain 1 tunnin ajan annostelusta, ja pernan huippupitoisuus oli 10,3 mg/kg, ja se pysyi yli 2 mg/kg:ssa 3 tunnin ajan (julkaisemattomat tiedot). Suotuisasta farmakokinetiikasta huolimatta B. pseudomallei -bakteeria saatiin talteen kaikkien ryhmien eloonjääneistä eläimistä, myös niistä, jotka saivat mikrobilääkkeitä 10 päivän ajan. Näiden eloonjääneiden bakteerien aiheuttamaa uusiutumismahdollisuutta on vaikea ennustaa näiden kokeiden perusteella.

Kahden mikrobilääkkeen farmakokinetiikan samankaltaisuudet hamstereissa selittivät doksisykliinin ja siprofloksasiinin tehoerot B. malleia vastaan. Käytetty kanta oli herkkä molemmille mikrobilääkkeille, siprofloksasiinin MIC-arvo oli tyypillinen 50 prosentille testatuista kannoista, vaikka doksisykliinin MIC-arvo oli yksi alhaisimmista. Siprofloksasiinin huippupitoisuudet hamsterin seerumissa olivat 2,3 mg/l, ja MIC-arvo ylittyi vain 1 tunnin ajan. Pernan pitoisuudet olivat enimmillään 20 mg/kg, ja ne pysyivät yli 1 mg/kg vähintään 12 tunnin ajan. Doksisykliinin pitoisuudet seerumissa olivat 2,6 mg/l, ja ne pysyivät yli 0,25 mg/l:n tasolla vähintään 12 tunnin ajan, ja pernan pitoisuudet olivat 8,7 mg/l, ja ne pysyivät yli 0,25 mg/l:n tasolla vähintään 12 tunnin ajan (julkaisemattomat tiedot). Koska räkätauti on niin harvinainen tauti, B. mallei -bakteerin patogeneettisiä mekanismeja ja virulenssitekijöitä ei ole tutkittu yhtä perusteellisesti kuin B. pseudomallei -bakteerin. Näiden kahden organismin väliset yhtäläisyydet ulottuvat kuitenkin todennäköisesti solunsisäiseen tunkeutumiseen ja eloonjäämiseen, mikä selittäisi uusiutumisen. Näiden yhtäläisyyksien vuoksi melioidoosin hoidosta saadut kliiniset kokemukset toimivat varoituksena räkätaudin mahdollisille mikrobilääkehoidoille, erityisesti siitä, että suotuisasta farmakokinetiikasta ja näennäisestä herkkyydestä huolimatta toistuvia infektioita voi silti esiintyä.

Näissä kokeissa kumpikin mikrobilääkeaine osoittautui jossain määrin käyttökelpoiseksi melioidoosin ennaltaehkäisyssä, mutta ne olivat kliinisten havaintojen perusteella sopimattomia terapeuttiseen käyttöön. Mahdollisesti doksisykliiniä voitaisiin käyttää räkätaudin ennaltaehkäisyyn ja hoitoon, vaikka melioidoosin hoidossa kohdatut ongelmat saattavat koskea myös räkätautia.

Yhteenveto luettiin ensimmäisen kerran Bangkokissa, Thaimaassa, 22.-25.11.1998 pidetyssä kansainvälisessä melioidoosikongressissa.

.