Abstract
Krooninen aktiivinen Epstein-Barr-virusinfektio (CAEBV) on vakava sairaus, johon liittyy epätavallinen EBV-aktivoituminen, joka jatkuu vuosia, ja sen patogeneesi on suurelta osin tuntematon. Sen jälkeen kun oli luotu tarkka ja toistettavissa oleva polymeraasiketjureaktiojärjestelmä EBV:n DNA:n kvantifioimiseksi, määritettiin viruskuormat perifeerisen veren lymfosyyteissä (PBL) 54:ltä lapselta: 15:ltä CAEBV:tä sairastavalta lapselta, 16:lta tarttuvaa mononukleoosia sairastavalta lapselta ja 23:lta terveeltä lapselta. CAEBV:tä sairastavien ja IM:ää sairastavien lasten viruskuormitus oli suuri. Seropositiivisista terveistä luovuttajista 47 prosentilla todettiin alhaisempi viruskuorma. CAEBV:tä sairastavien ja IM:ää sairastavien lasten välillä oli kaksi selvää eroa: Ensin mainituilla oli suurempi viruksen replikaatio (103-107 kopiota/PBL)2,5 × 105 PBL) kuin IM:ää sairastavilla, ja viruksen replikaatio väheni IM:ää sairastavilla lapsilla, kun taas CAEBV:tä sairastavilla aktiivinen replikaatio jatkui vuosia. Jatkuva korkea viruskuormitus on mahdollinen CAEBV:n diagnostinen kriteeri. EBV-kuormat voivat mahdollistaa EBV-infektioiden luokittelun ja ennusteen.
Epstein-Barr-virus (EBV) on tarttuvan mononukleoosin (IM) ja kroonisen aktiivisen EBV-infektion (CAEBV) aiheuttaja. CAEBV on vakava sairaus, johon liittyy epätavallinen EBV-aktivoituminen, joka voi olla kohtalokas useiden elinten vajaatoimintaan, ja se liittyy pahanlaatuiseen lymfoomaan ilman edeltävää immunosuppressiota . CAEBV:n kliiniset oireet ja aktiivista EBV:n replikaatiota vastaavat serologiset poikkeavuudet, kuten selvästi kohonnut anti-EA-DR-vasta-aine ja Epstein-Barrin ydinantigeenin (EBNA) vasta-aineen puuttuminen, jatkuvat kuukausista vuosiin. EBV replikoituu NK- , T- ja B-soluissa.
Kun infektio on vakiintunut, EBV pysyy yleensä B-lymfosyyteissä isännän eliniän ajan aiheuttamatta mitään kliinisiä oireita (kutsutaan latentiksi infektioksi). Siksi EBV:n havaitsemisen lisäksi myös EBV:n kvantifiointi sairastuneissa kudoksissa on olennaista EBV-taudin tutkimiseksi.
Ebv:n replikaation tilan selvittämiseksi CAEBV:tä sairastavilla henkilöillä käytimme puolikvantitatiivista DNA:n polymeraasiketjureaktiota (PCR) arvioidaksemme ja vertaillaksemme viruskuormitusta perifeerisen veren lymfosyyteissä (PBL:ssä) kolmessa lapsiryhmässä: yksi sairasti CAEBV:tä, yksi sairasti IM:n ja yksi sairasti IM:ää ja yksi sairasti IM:ää ja yksi sairasti IM:ää ja yksi sairasti IM:ää ja yksi sairasti IM:ää. Tunnistusjärjestelmämme katsottiin tarkaksi ja luotettavaksi EBV:n kvantifioinnissa, koska monistimme EBV:n yhden kopion alueen. Useimmat aiemmat tutkimukset kohdistuivat BamHI-W-alueeseen, jonka tandemtoistumisfrekvenssi on epätasainen. Uskomme, että tämä tutkimus on ensimmäinen ja laajin skaalattu tutkimus viruskuormista CAEBV:tä sairastavien lasten PBL:ssä.
Materiaalit ja menetelmät
Potilaat ja kontrollit
Tutkimme 16 IM-tautia sairastavaa lasta (11 poikaa, 5 tyttöä; iät 0-8 vuotta), 15 CAEBV-tautia sairastavaa lasta (11 poikaa, 4 tyttöä; iät 4-19 vuotta), 19 immuuniyhteensopivaa EBV-sairautta sairastavaa tervettä ihmistä (10 poikaa, 9 tyttöä; iät 1-19 vuotta) ja 4 seronegatiivista terveeseen lapseen sairastunutta lasta (3 poikaa, 1 tyttö; iät, 1-10 vuotta). Kaikilla IM-tautia sairastavilla oli tyypillisiä kliinisiä oireita (esim. kuume, tonsilliitti, lymfadenopatia, hepatosplenomegalia, maksan toimintahäiriö ja epätyypillinen lymfosytoosi). IM-diagnoosi tehtiin serologisten löydösten perusteella, joissa todettiin IgM-vasta-aine viruskapsidiantigeenille (VCA) tai VCA IgG:n ja/tai EA:n serokonversio ja negatiivinen EBNA-vasta-aine . Kaksikymmentäkaksi verinäytettä kerättiin 16:lta IM-tautia sairastavalta lapselta 8 päivästä 8 kuukauteen taudin puhkeamisen jälkeen (alkuoireena oli kuume kaikilla potilailla). CAEBV diagnosoitiin Rickinsonin kriteerien mukaisesti. CAEBV:tä sairastavilla lapsilla oli ajoittaista tai jatkuvaa kuumetta >16 kuukauden ajan ja hepatosplenomegaliaa, lymfadenopatiaa ja/tai ihottumaa. Laboratoriolöydökset osoittivat kohonneita transaminaasiarvoja, anemiaa, trombosytopeniaa ja/tai polyklonaalista hypergammaglobulinemiaa. Serologinen tutkimus osoitti selvästi kohonneita VCA:n ja EA:n vasta-ainetittereitä. Ihmisen immuunikatovirusinfektio ja reumasairaudet suljettiin pois. Kenellekään tutkittavalle ei ollut tehty elinsiirtoa eikä hän ollut saanut syöpähoitoa.
Näytteet
Heparinisoidut 2 ml:n perifeeriset verinäytteet otettiin. PBL eristettiin fikoll-hyppelyllä ja lysoitiin 0,15 μg/μL proteinaasi K:lla (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); DNA uutettiin fenoli-kloroformietanoli-saostuksella. Uutettu DNA kvantifioitiin spektrofotometrillä, säädettiin 0,25 μg/μL DNA:ta ja käytettiin PCR-malleina.
PCR-herkkyys
EBV-DNA oli peräisin kolmesta lähteestä: Raji, joka sisälsi 50 EBV-kopiota solua kohti ; Akata, joka sisälsi 20 kopiota solua kohti; ja kloonatut BamHI-L-fragmentit, jotka sekoitettiin napanuoraverisoluista saatuun DNA:han ja joita käytettiin positiivisena standardina. PCR-järjestelmän herkkyyden määrittämiseksi uutetun DNA:n 10-kertaiset sarjalaimennokset (10°-104 EBV-kopiota) tehtiin PCR:llä.
PCR
Sisäistetty kaksinkertainen PCR suunniteltiin monistamaan konservoitunutta aluetta, joka koodaa gp220:ta (BamHI-L-fragmentin sisällä) . Ulompi alukepari monistaa 302-bp:n fragmentin käyttämällä oligonukleotideja 5′-GCGAACTGGTGGACACATGA ja 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, jotka vastaavat B95-8:n (GenBank M10593) positioita 2870-3171. Sisempi pari monistaa 239-bp:n fragmentin. PCR suoritettiin 50 μl:n reaktiossa, joka sisälsi 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP:tä, 0,5 μM kutakin aluketta, 2,5 U Taq DNA-polymeraasia (Boehringer-Mannheim) ja 4 μl näyte-DNA:ta. Monistetut tuotteet ajettiin 2-prosenttiselle agaroosille ja värjättiin etidiumbromidilla, ja spesifisyys varmistettiin Southern blotting -menetelmällä käyttäen koettimena BamHI-L-fragmenttia. Kukin PCR-reaktio tehtiin kolmena kappaleena, ja siihen sisältyi negatiivinen kontrolli ristikontaminaation estämiseksi. PCR:n spesifisyyden vahvistamiseksi analysoitiin DNA:ta herpes simplex -virustyypeistä 1 ja 2, varicella-zoster-viruksesta, ihmisen sytomegaloviruksesta sekä ihmisen herpesviruksista 6 ja -7. Spesifistä monistumista ei havaittu.
Ebv-genomin kvantitatiivinen määritys
Ebv-dna:n määrä PBL:ssä määritettiin rajoittavilla laimennuskokeilla. Kustakin DNA-näytteestä uutetun genomisen DNA:n 10-kertaiset sarjalaimennokset (1-10-6μg) tehtiin edellä kuvatulla tavalla pesäkkeellisellä PCR:llä, ja positiivisen tuloksen minimiraja muutettiin viruskuormaksi (kopiot/2,5 × 105 solua).
Tulokset
PCR-järjestelmän herkkyys määritettiin huolellisesti kolmesta EBV-dna:n lähteestä tehdyillä 10-kertaisilla laimennuksilla: Raji ja Akata, jotka molemmat sisälsivät vakiot kopioluvut EBV-DNA:ta solua kohti, ja kloonattu BamHI-L-fragmentti. Raji sisältää 50 kopiota EBV-genomia solua kohti, ja 1 μg Raji-soluista saatua genomista DNA:ta vastaa 2,5 × 105 solusta uutettua DNA:ta: siis 1,25 × 107 kopiota EBV-DNA:ta. Rajista saatu DNA laimennettiin asianmukaisesti, ja DNA, joka sisälsi 10n kopiota (sarjalaimennokset, joissa oli 10°-104 viruskopiota), monistettiin. Positiivisen PCR-tuloksen minimiraja tutkittiin. Toistetut tutkimukset osoittivat, että herkkyys oli 100 kopiota reaktiota kohti ja että se oli toistettavissa. Tulokset olivat samat, kun käytettiin Akatan DNA:ta ja laimennuskokeessa, jossa käytettiin 10n kopiota BamHI-L-fragmenttia sekoitettuna 105μg, 102μg ja ei lainkaan napanuoraverisolujen DNA:ta.
Kaikki IM:ää ja CAEBV:tä sairastaneiden henkilöiden PBL:t olivat positiivisia EBV-genomin suhteen. EBV-seropositiivisten terveiden henkilöiden 19 näytteestä yhdeksän (47 %) oli positiivisia. Kaikki seronegatiivisten henkilöiden PBL:t olivat negatiivisia.
EBV-DNA:ta PBL:ssä kvantifioitiin ja sitä verrattiin EBV-seropositiivisten terveiden kontrollihenkilöiden, IM:ää sairastavien lasten ja CAEBV:tä sairastavien lasten osalta (kuva 1). Terveillä EBV-seropositiivisilla lapsilla viruskuormat olivat 100-1000 kopiota 2,5 × 105 PBL:ää kohti. IM:ää sairastavien lasten PBL:ssä positiivisten PCR-tulosten alarajat vaihtelivat 10 μg:sta (2,5 × 105 PBL) 10 μg:aan (2,5 × 102/PBL) genomista DNA:ta, mikä osoitti, että viruskuormitus oli 100-100 000 kopiota/2,5 × 105 PBL. Kolmessa verinäytteessä, jotka otettiin kuukauden kuluessa taudin puhkeamisesta, oli korkeampi viruskuorma (1000-100 000 kopiota/2,5 × 105 PBL). >11 kuukautta IM:n puhkeamisen jälkeen kerätyssä PBL:ssä oli yleensä vähemmän virusta. Seurasimme viruskuormia neljällä IM-potilaalla (kuva 2A). Kaikilla neljällä viruskuormat pienenivät kliinisen kulun aikana, mutta olivat suurempia (100-10 000 kopiota/2,5 × 105 PBL) kuin seropositiivisilla terveillä isännillä.
EBV-DNA:ta perifeerisen veren lymfosyyteissä (PBL) diagnoosin toteamishetkellä terveillä kontrolleilla (4 EBV-seronegatiivista, 19 seropositiivista), 16:lla lapsella, joilla oli infektioivia mononukleoositauteja (IM) ja 15:llä potilailla, joilla oli Caibv-tartunta. EBV-DNA:ta oli havaittavissa 9:ssä 19:stä terveestä EBV-seropositiivisesta lapsesta (100-1000 kopiota/2,5 × 105 PBL). EBV-genomia havaittiin suurempia määriä EBV-tautia sairastavien potilaiden PBL:ssä.
EBV-DNA:ta perifeerisen veren lymfosyyteissä (PBL) diagnoosin toteamishetkellä terveillä kontrolleilla (4 EBV-seronegatiivista, 19 seropositiivista), 16:lla lapsella, joilla oli infektioperäinen mononukleoosi (IM), ja 15:llä potilaalla, joilla oli CAEBV-tartunta. EBV-DNA:ta oli havaittavissa 9:ssä 19:stä terveestä EBV-seropositiivisesta lapsesta (100-1000 kopiota/2,5 × 105 PBL). EBV-genomia havaittiin suurempia määriä EBV-tautia sairastavien potilaiden PBL:ssä.
A, EBV-kuormitukset ja ajat taudin puhkeamisesta verinäytteenottoon. 12:ssa verinäytteessä, jotka otettiin kuukauden kuluessa tarttuvan mononukleoosin (IM) puhkeamisesta, oli suuria määriä EBV:tä (1000-100 000 kopiota/2,5 × 105 solua). Perifeerisen veren lymfosyyteissä (PBL), jotka oli kerätty ⩾1 kuukausi IM:n puhkeamisen jälkeen, oli yleensä vähemmän virusta. Neljää IM-potilasta seurattiin viruskuormituksen testaamiseksi. Kaikilla neljällä EBV-DNA väheni taudin kliinisen kulun aikana. B, EBV-kuormituksen ajallinen muutos kahden CAEBV-potilaan (UT, YK) PBL:ssä. PBL:ssä havaittiin jatkuvasti suuria määriä EBV-DNA:ta.
A, EBV-kuormat ja ajat taudin puhkeamisesta verinäytteenottoon. 12:ssa verinäytteessä, jotka otettiin kuukauden kuluessa tarttuvan mononukleoosin (IM) puhkeamisesta, oli suuria määriä EBV:tä (1000-100 000 kopiota/2,5 × 105 solua). Perifeerisen veren lymfosyyteissä (PBL), jotka oli kerätty ⩾1 kuukausi IM:n puhkeamisen jälkeen, oli yleensä vähemmän virusta. Neljää IM-potilasta seurattiin viruskuormituksen testaamiseksi. Kaikilla neljällä EBV-DNA väheni taudin kliinisen kulun aikana. B, EBV-kuormituksen ajallinen muutos kahden CAEBV-potilaan (UT, YK) PBL:ssä. PBL:ssä havaittiin jatkuvasti suuria määriä EBV-DNA:ta.
CAEBV:tä sairastavien lasten PBL:ssä oli enemmän EBV-DNA:ta kuin IM:ää sairastavien lasten näytteissä. Neljää CAEBV-potilasta seurattiin >16 kuukauden ajan (kuvassa 2B esitetään kahden potilaan löydökset). Kahdella muulla potilaalla viruskuormitus pysyi muuttumattomana 2-3 vuoden ajan (105 ja 106 kopiota/2,5 × 105 PBL). Kaikilla näillä potilailla oli pysyvästi korkea viruskuorma, toisin kuin IM:n yhteydessä todettiin. Kun tarkastelimme kliinisten oireiden ja EBV-kuormituksen välistä yhteyttä, vain kuume korreloi viruskuorman kanssa. Korrelaatiota ei ollut hepatosplenomegalian, lymfadenopatian, eksanteeman, hyttynenallergian, maksan toimintahäiriön, anemian, trombosytopenian tai seerumin vasta-ainetitterien VCA:ta, EA-DR:ää ja EBNA:ta vastaan.
Keskustelu
Ebv-dna:ta kvantitatiivisesti määrittävästä PCR:stä kävi ilmi, että CAEBV:tä tai IM:ää sairastavilta lapselta peräisin olevan PBL-verenvuodon viruskuormat olivat korkeat, mikä osoitti EBV:n aktiivista replikaatiota lymfosyyteissä. Viruksen replikaatiota pidettiin aktiivisempana CAEBV:ssä kuin IM:ssä; IM-ryhmässä replikaatio vähitellen väheni, kun taas CAEBV-potilailla aktiivinen replikaatio säilyi vuosia.
Meidän PCR-järjestelmämme monistaa EBV-spesifisiä sekvenssejä, jotka koodaavat gp220:aa, joka on viruksen yksikopioinen geeni, kun taas aiemmat tutkimukset kohdistuivat sisäiseen toistuvaan pitkään kohtaan, joka sijaitsi BamHI-W-alueella. Koska polyklonaalisessa EBV:n lisääntymisessä tämän alueen toistoluku ei ole vakio, järjestelmäämme pidetään tarkempana EBV:n kvantifioinnissa, vaikkakin vähemmän herkkänä havaitsemisessa. Alhaisen herkkyyden puute korjattiin käyttämällä nested PCR:ää. Herkkyys oli 100 kopiota reaktiota kohti, kun se edellisessä raportissa oli 10 kopiota . Määritimme EBV:n genomit PBL:ssä uutetun DNA:n sarjalaimennoksen avulla. EBV:n DNA:n määrittäminen uutetun DNA:n sarjalaimennosten avulla osoittautui toistettavaksi ja luotettavaksi.
IM:ää ja CAEBV:tä sairastavilta lapsilta kerätyssä PBL:ssä oli suurempia määriä EBV-genomia kuin terveiltä seropositiivisilta kontrolleilta kerätyssä PBL:ssä. Jälkimmäisistä 47 %:lla oli havaittavaa EBV-DNA:ta (100-1000/2,5 × 105 PBL). EBV:tä havaittiin kahdella koehenkilöllä enemmän kuin aiemmissa tutkimuksissa (1-50/106 PBL). Koska tutkimme lapsia, lyhyemmät ajanjaksot primaari-infektion jälkeen voivat osaltaan vaikuttaa suurempiin EBV-kuormituksiin kuin aiemmissa aikuisia koskevissa tutkimuksissa on havaittu, mikä muistuttaa meitä siitä, että erityisesti lapsilla positiivisiin PCR-tuloksiin sisältyy myös oireeton latentti EBV-infektio.
IM-tautia sairastavilla lapsilla oli suuria määriä EBV:tä. EBV-kuormitus saavutti huippunsa kuukauden kuluessa puhkeamisesta (1000-100 000 kopiota/2,5 × 105 PBL) ja väheni sitten vähitellen, mutta pysyi korkeana useita kuukausia (⩽8) puhkeamisen jälkeen verrattuna terveiden kontrollien tasoihin. Jopa silloin, kun kliiniset oireet hävisivät, EBV:n suhteellisen korkea replikaatio jatkui PBL:ssä.
CAEBV-potilailla oli pysyvästi suuria määriä EBV:tä, mikä viittaa siihen, että EBV:n krooninen sääntelemätön aktiivinen replikaatio PBL:ssä johtaa vakavaan sairauteen, jonka ennuste on huono. Yllättävän aktiiviseen viruksen replikaatioon johtavat tekijät ja mekanismit ovat edelleen epäselviä. Erilaisia heterogeenisiä puutteita isännän puolustusjärjestelmissä sekä humoraalisessa että soluvälitteisessä immuniteetissa on kuvattu, ja ne saattavat mahdollistaa aktiivisen viruksen replikaation. EBV:hen liittyvässä elinsiirron jälkeisessä lymfoproliferatiivisessa taudissa (postransplant lymphoproliferative disease, PTLD), joka on elinsiirtojen jälkeinen komplikaatio, on todettu korkea viruskuormitus PBL:ssä (>1300 000 EBV/105 PBL), vaikkakin viruskuormitukset pienenivät vuoden kuluessa immunosuppressiosta toipumisen myötä. Kvantitatiivinen ero kiertävässä EBV-kuormassa korreloi EBNA-vasta-ainetason kanssa PTLD:ssä mutta ei CAEBV:ssä. Siksi EBV:n käyttäytymistä PTLD:ssä pidettiin sekä samanlaisena että erilaisena kuin CAEBV:ssä. Kliinisten ilmenemismuotojen perusteella CAEBV vaikuttaa samankaltaiselta kuin X-sidonnainen lymfoproliferatiivinen oireyhtymä (XLP) , jonka vastuullinen geeni on äskettäin tunnistettu. Toisin kuin XLP-oireyhtymä, CAEBV ei kuitenkaan ole perinnöllinen sairaus, ja siihen voi sairastua myös naisia. CAEBV:n immunologisia lisäanalyysejä tarvitaan viruksen aktivoitumiselle altistavien tekijöiden selvittämiseksi.
Asykloviiria, interferoni-α:ta ja interleukiini-2:ta on käytetty CAEBV:n hoitoon – epätyydyttävin tuloksin . Tuloksemme osoittavat, että immunosuppressiota aiheuttavat ja virusaktivaatiota lisäävät sytotoksiset lääkkeet olisi valittava huolellisesti, vaikka kliiniset piirteet ovat samanlaiset kuin hematologisissa pahanlaatuisissa sairauksissa. Pysyvät korkeat EBV-kuormat PBL:ssä ovat CAEBV:n mahdollinen diagnostinen kriteeri, ja niistä voi olla hyötyä taudin aktiivisuuden seurannassa, taudin luokittelussa ja ennusteen ennustamisessa.
Kiitokset
Kiitämme George Kleinia (Mikrobiologian ja kasvainbiologian keskus, Karolinska-instituutti, Tukholma) käsikirjoituksen arvostelusta sekä Sachi Takemotoa ja Ai Kitamuraa taitavasta teknisestä avustuksesta.
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
, ym.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
, et al.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.