HypaCas9:ssä ja Cas9-HF1:ssä on havaittavissa hitaita havaittavia pilkkoutumisnopeuksia
Aloitamme kineettiset analyysimme mittaamalla entsyymin aktiivisen paikan konsentraatioita kullekin Cas9-varianteille23,24,25. Mittaamalla entsyymin titrauksessa muodostuneen tuotteen määrää kasvavilla DNA-pitoisuuksilla saatiin aktiivisen alueen pitoisuuksiksi 31 nM, 26 nM, 23 nM SpCas9:llä, HypaCas9:llä ja Cas9-HF1:llä vastaavasti entsyyminäytteille, joiden nimellispitoisuus oli 100 nM perustuen absorbanssiin 280 nm:ssä (täydentävät kuvat 1a-d). Mittasimme myös Integrated DNA Technologiesin (IDT) valmistamien SpCas9:n ja HiFiCas925:n aktiivisen alueen pitoisuudet ja havaitsimme samankaltaisia aktiivisen entsyymin pitoisuuksia (lisäyskuva 1e-f). On tärkeää huomata, että kussakin tapauksessa signaalin kyllästymiseen tarvittava DNA-konsentraatio oli yhtä suuri kuin muodostuneen tuotteen konsentraatio, mikä poistaa huolen siitä, että osa entsyymistä saattaisi sitoa DNA:ta, mutta ei reagoi. Kaikissa myöhemmissä kokeissa käytettiin aktiivisen entsyymin pitoisuutta, joka määritettiin aktiivisen alueen titrauksessa.
Vertaillaksemme SpCas9:n ja muokattujen varianttien DNA-substraattien kohdesubstraattien tai kohteen ulkopuolisten DNA-substraattien kinetiikkaa tarkastelimme ensin kunkin entsyymin kohdesäikeen (HNH) pilkkoutumisen ajallista kulkua (Kuva 1 ja Täydentävä kuva 2). Tiedot sovitettiin joko yhden tai kahden eksponentiaalisen funktion avulla käyttäen vastaavasti yhtälöä (1) tai yhtälöä (2).
jossa Y edustaa pilkkoutumistuotteen konsentraatiota, A1 edustaa amplitudia ja λ1 edustaa havaittua hajoamisnopeutta (ominaissuure)17.
jossa Y edustaa pilkkoutumistuotteen konsentraatiota, A1 edustaa amplitudia ja λ1 edustaa havaittua nopeutta ensimmäisessä vaiheessa. A2 edustaa amplitudia ja λ2 edustaa toisen vaiheen havaittua nopeutta.
SpCas9:n havaittujen kohdesubstraattien ja kohteen ulkopuolisten substraattien pilkkoutumisnopeuksien vertailu osoittaa, että 3 bp:n PAM-distaalinen epäsuhta hidastaa entsyymiä 13-kertaisesti (1 s-1:stä 0,076 s-1:een). Molemmat korkean uskollisuuden Cas9-variantit pienentävät havaittua hajoamisnopeutta DNA-substraattien pilkkomisessa kohteeseen 21- 35-kertaisesti SpCas9:ään verrattuna (0,028 s-1 HypaCas9:llä ja 0,047 s-1 Cas9-HF1:llä vs. 1 s-1 SpCas9:llä). Lisäksi HypaCas9 ja Cas9-HF1 pienentävät kohteen ulkopuolisen DNA:n pilkkoutumisnopeutta 8-290-kertaisesti (0,0033 s-1 ja 0,00016 s-1) suhteessa niiden DNA:n pilkkoutumisnopeuteen kohteen sisällä. Nämä tiedot osoittavat dramaattisia muutoksia muunnettujen varianttien havaituissa pilkkoutumisnopeuksissa kohteen DNA:n kanssa ja sen ulkopuolella. Nämä mittaukset eivät kuitenkaan yksinään määritä muutoksia spesifisyydessä, joka on DNA:n pilkkomisen ja dissosioitumisen kineettisen jakautumisen funktio, joka kattaa kaikki vaiheet, jotka johtavat polun ensimmäiseen irreversiibeliin vaiheeseen17 , mukaan lukien reversiibeli DNA:n sitoutuminen, R-silmukan muodostuminen, HNH-domeenin telakoituminen ja DNA:n pilkkominen.
DNA:n purkautuminen on suurelta osin muuttumatonta Cas9-varianttien kanssa
Koska aiemmassa työssämme tunnistimme R-silmukan muodostumisen nopeutta rajoittavaksi kohteessa tapahtuvalle pilkkoutumiselle, ja muut ovat sittemmin ehdottaneet, että R-silmukan muodostumis- ja purkautumisnopeudet saattavat sanella entsyymispesifisyyden SpCas9:lle ja Cas9-HF116, testasimme, näyttäisikö HypaCas9:llä samankaltaista kinetiikkaa. Mittaaksemme suoraan kaikkien entsyymien R-silmukan muodostumisnopeuksia käytimme pysäytettyä virtausmääritystä, joka perustuu tCo:n fluoresenssin mittaamiseen -16 nt:n kohdalla; tCo on fluoresoiva trisyklinen sytosiinianalogi, joka sammuu emästen kasaantuessa dsDNA:ssa niin, että dupleksin avautuminen johtaa fluoresenssin suureen lisääntymiseen. Kontrollikokeemme, joissa käytimme sekä tCo- että 2-AP-leimattuja emäsanalogisubstraatteja -16 nt:n, -9 nt:n ja -1 nt:n paikoissa (lisäyskuva 3), osoittavat, että kumpikaan analogi ei vaikuta havaittuun DNA:n pilkkoutumisnopeuteen. TCo:n ja 2AP:n kemialliset rakenteet ovat paljon vähemmän tilaa vieviä kuin suuremmat Cy3- ja Cy5-merkinnät, ja ne häiritsevät vähemmän todennäköisesti entsyymin kinetiikkaa (Täydentävä kuva 4). Mg2+:n läsnä ollessa SpCas9, HypaCas9 ja Cas9-HF1 purkaavat kohde-DNA-substraattia lähes identtisillä hajoamisnopeuksilla (~2 s-1) (kuva 2). Yllättäen myös kohteen ulkopuolisten DNA-substraattien R-silmukan muodostumisen hajoamisnopeus oli kaikilla Cas9-varianteilla pitkälti muuttumaton (0,85 s-1 ja 2,59 s-1 välillä). Näin ollen DNA:n purkautuminen ei ole nopeutta rajoittava eikä korreloi havaittujen pilkkoutumisnopeuksien kanssa korkean uskottavuuden varianttien kohdalla, toisin kuin SpCas9:n kohdalla.
R-silmukan muodostumisen hajoamisnopeudet mitattiin seuraamalla fluoresenssin lisääntymistä tCo:sta (positio -16 ei-kohde-juosteessa) ajan funktiona sen jälkeen, kun entsyymi (28 nM) oli sekoitettu DNA:n (10 nM) kanssa 10 mM Mg2+:n läsnä ollessa. Tiedot sovitettiin kaksinkertaiseen eksponenttifunktioon, jotta saatiin esitetyt hajoamisnopeudet. a, b SpCas9 (28 nanometriä) ja kohteena oleva (a) ja ei-kohde (b) DNA, c, d HypaCas9 ja kohteena oleva (c) ja ei-kohde (d) DNA. e, f Cas9-HF1 kohteen päällä (e) ja sen ulkopuolella (f) olevan DNA:n kanssa.
Ottaen huomioon tCo:n sijainnin -16 nt:n kohdalla on todennäköistä, että mittauksemme heijastivat askelta, joka on myöhäisessä vaiheessa purkautumisprosessia. Vertailun vuoksi mittasimme R-silmukan muodostumisen hajoamisnopeuden käyttämällä tCo:ta, joka oli leimattu välittömästi PAM:n läheisyydessä olevaan paikkaan (paikka -1 nt). Kun Cas9-RNA oli sekoitettu nopeasti kohde-DNA:n substraatin kanssa, havaitsimme fluoresenssin merkittävän kasvun, kun DNA purkautui tCo:n emäsanalogista. Sovitimme datan kaksoiseksponentiaaliin määrittääksemme tärkeimmän hajoamisnopeuden 10 s-1 (Kuva 3a-f). Mielenkiintoista on, että nämä tulokset osoittavat, että kun PAM-kohta on kytkeytynyt entsyymiin, DNA:n alkuperäinen purkautuminen on nopeampaa kuin -16 nt:n kohdalla havaittu. Nämä tiedot viittaavat siihen, että -16 nt:n kohdalla havaittu purkautumisen nettohäviämisnopeus voi johtua useista nopeista purkautumisvaiheista, jotka johtavat täydelliseen purkautumiseen. Koska kinetiikassa ei kuitenkaan havaittu viivettä, näyttää siltä, että nopeammat, aikaisemmat osittaiset purkautumisvaiheet johtavat -16 nt:n kohdalla mitattuun täydellisen purkautumisen viimeiseen nopeutta rajoittavaan vaiheeseen. Vaikka tarvitaankin lisätutkimuksia, joissa tutkitaan epäsuhtien vaikutuksia purkautumisen aikaisemmissa vaiheissa, nykyinen mittauksemme antaa parhaan arvion R-silmukan muodostumisen nettonopeudesta. Tällä leimalla mitattu R-silmukan muodostumisen hajoamisnopeus on erottamaton sekä SpCas9:llä että high-fidelity-varianteilla kaikilla testatuilla substraateilla, joten DNA:n purkautumisnopeudet näyttävät pysyvän muuttumattomina muokattujen Cas9-entsyymien vaikutuksesta.
R-silmukan muodostumisen hajoamisnopeuksia mitattiin seuraamalla fluoresenssin lisääntymistä tCo:sta (positio -1 ei-kohdejuosteessa) ajan funktiona sen jälkeen, kun entsyymi (28 nM) oli sekoitettu DNA:n (10 nM) kanssa 10 mM Mg2+:n läsnä ollessa. Tiedot sovitettiin kaksinkertaiseen eksponenttifunktioon, jotta saatiin esitetyt hajoamisnopeudet. a, b SpCas9 (28 nanometriä) kohteen (a) ja ei-kohteen (b) DNA:n kanssa, c, d HypaCas9 kohteen (c) ja ei-kohteen (d) DNA:n kanssa. e, f Cas9-HF1 kohteen (e) ja ei-kohteen (f) DNA:n kanssa. g HNH-domeenin uudelleenjärjestäytymisen piirroskuva. h Cy3- ja Cy5-parilla C867- ja C355-kohdassa leimattua FRETSpCas9:ää käytettiin mittaamaan HNH-domeenin liikettä kohdesubstraattien pilkkomisen aikana.
Korreloidaksemme R-silmukan muodostumisnopeuksia vaiheisiin, jotka liittyvät HNH-domeenin telakoitumiseen kohdesäikeeseen, mittasimme entsyymin konformaatiomuutoksen käyttämällä pysäytetyn virtauksen analyysiä Cas9:llä, joka oli leimattu Cy3:lla ja Cy5:llä aiemmin kuvatulla tavalla18. Lyhyesti sanottuna Cas9:n Cysteine-light-versio leimattiin Cy3:lla aminohapolla 355 ja Cy5:llä aminohapolla 867. FRET-tehokkuus kasvaa, kun HNH-domeeni järjestäytyy uudelleen katalyyttisesti aktiiviseen tilaan (kuva 3g). Kun FRET-parilla leimattu Cas9 sekoitettiin nopeasti täysin yhteensopivaan kohde-DNA:han, havaittiin FRET-tehokkuuden kasvavan, mikä osoitti, että HNH-domeeni järjestäytyi uudelleen katalyyttisesti aktiiviseen tilaan. Mittasimme HNH-dokkeutumisen hajoamisnopeudeksi ~2,5 s-1 (kuva 3h), joka on samankaltainen kuin yhden molekyylin FRET-mittauksissa. Yllättäen R-silmukan muodostumisen (1,5 s-1) ja HNH-domeenin telakoitumisen havaitut nopeudet ovat hyvin samankaltaisia, mikä osoittaa, että nämä vaiheet voivat olla kineettisesti yhteydessä toisiinsa. HNH-domeenin liikkeen hieman nopeampi havaittu hajoamisnopeus saattaa johtua käänteisreaktiosta, kun domeenin liike tulee tasapainoon R-silmukan muodostumisen jälkeen tai samanaikaisesti sen kanssa.
DNA:n purkautumisen hajoamisnopeuksia on mitattu myös yhden molekyylin menetelmin käyttäen FRET-parilla leimattua DNA:ta, Cy3 ja Cy5 leimattiin kohdesäikeen asemaan (-6 nt kohdesäikeessä) ja ei-kohteena olevan säikeen asemaan (-16 nt ei-kohteena olevalla säikeellä)16. Tämän vuoksi testasimme myös FRET-parilla varustettuja DNA-substraatteja yrittäessämme korreloida FRET-signaalia havaittujen DNA:n pilkkoutumisnopeuksien kanssa. Ensin testasimme substraattia, jota oli aiemmin käytetty yksimolekyylitutkimuksissa ilman Cy3/Cy5-leimoja16 ja jossa on kahden nukleotidin ero meidän substraattiin nähden, nimittäin T-substituutio paikoissa -16 ja -18. Kohdejuosteen (HNH) pilkkoutumisnopeus on samanlainen kuin substraatillamme (0,7 s-1 vs. 1 s-1, täydentävä kuva 5a), joten sekvenssikontekstilla tässä kohdassa ei ole merkittävää vaikutusta. Testasimme myös pilkkoutumista Cy3/Cy5-merkityllä DNA:lla tällä toisella sekvenssillä, ja se osoitti samanlaista hajoamisnopeutta kuin sekvenssimme (0,05 s-1 vs. 0,06 s-1, täydentävät kuvat 5b ja 6a). Myöhemmin tarkastelimme Cy3/Cy5-merkityn DNA:n Cy3/Cy5-merkityn DNA:n kohdesäikeen (HNH) pilkkoutumisen ajallista kulkua meidän sekvenssillämme kunkin entsyymin osalta (täydentävä kuva 6). SpCas9:llä Cy3/Cy5-merkityn DNA:n reaktio noudattaa yksittäistä eksponentiaalia, jonka hajoamisnopeus on selvästi pienempi (0,06 s-1 vs. 1 s-1), mikä osoittaa, että DNA:n pilkkoutumisen havaittu hajoamisnopeus on ~17-kertainen verrattuna merkitsemättömään substraattiin. Muokattujen HypaCas9:n ja Cas9-HF1:n DNA:n pilkkoutumisnopeus oli myös alentunut (0,0046 s-1 ja 0,0016 s-1), mikä on 5,9-kertaisesti ja 28,75-kertaisesti hitaampi kuin merkitsemättömien substraattien pilkkoutumisnopeus, joka mitattiin samanlaisissa olosuhteissa. On selvää, että Cy3/Cy5-merkintöjen aiheuttama häiriö muuttaa korkean uskollisuuden varianttien vaikutusta DNA:n pilkkoutumisnopeuteen. Kaiken kaikkiaan DNA:n leimaaminen tilaa vievillä Cy3- ja Cy5-merkinnöillä vaikutti dramaattisesti entsyymiin. Näistä syistä FRET-parilla leimatulla DNA:lla ei tehty lisätutkimuksia.
Cas9-spesifisyys määräytyy kineettisen jakautumisen mukaan
Koska entsyymin spesifisyys riippuu kaikista vaiheista, jotka johtavat ensimmäiseen suurelta osin irreversiibeliin vaiheeseen, kaikki DNA:n pilkkoutumista edeltävät tapahtumat on otettava huomioon17. Oman pilkkoutumisnopeuden mittaamiseksi ohitimme normaalisti nopeutta rajoittavan R-silmukan muodostumisvaiheen esi-inkuboimalla SpCas9:ää kohteen ulkopuolisen DNA:n kanssa ilman Mg2+:a, jotta sitoutuminen ja konformaatiomuutokset pääsevät tasapainoon SpCas9.DNA-kompleksin muodostamiseksi. Tämän jälkeen käynnistimme kemiallisen reaktion lisäämällä 10 mM Mg2+. Aiemmissa tutkimuksissamme R-silmukan muodostuminen oli nopeusrajoittava tekijä SpCas9:n reagoidessa kohde-DNA:n kanssa, ja sisäinen pilkkoutumisnopeus oli nopeampi, kun sitä mitattiin käyttämällä esi-inkubointiprotokollaa. Tässä tutkimuksessa kohteen ulkopuolisella DNA:lla HNH:n ja RuvC:n pilkkoutumisnopeudeksi mitattiin 0,12 s-1 ja 0,14 s-1 (lisäyskuva 7c, d ja lisäyskuva 8), jotka ovat paljon hitaampia kuin R-silmukan muodostumisnopeudet. Mielenkiintoista kyllä, nämä tulokset osoittavat, että SpCas9:n entsyymireitin nopeutta rajoittava vaihe off-kohteen kanssa on DNA:n pilkkominen, sillä mittaamamme R-silmukan muodostumisen hajoamisnopeus oli 0,85 s-1 (kuva 2b). Nämä tiedot osoittavat, että erottelukyky perustuu ainakin osittain nopeutta rajoittavan vaiheen identiteetin muutokseen verrattaessa on- ja off-kohteen DNA:ta.
Toistimme nämä kokeet HypaCas9:llä ja Cas9-HF1:llä, joilla oli on- tai off-kohteen DNA. Nämä tulokset määrittävät HNH:n pilkkoutumisnopeudeksi 0,035 s-1 ja 0,0023 s-1 HypaCas9:lle, jolla oli on- ja off-target-substraatteja, vastaavasti (Täydentävä kuva 7g, k). Cas9-HF1:n havaitut pilkkoutumisnopeudet kohdesubstraattien osalta olivat 0,038 s-1 ja 0,00014 s-1 (täydentävät kuvat 7o, q). Nämä havaitut pilkkoutumisnopeudet ovat jonkin verran nopeampia kuin DNA:n ja Mg2+:n samanaikaisen lisäämisen yhteydessä mitatut nopeudet, mikä osoittaa, että jokin muu vaihe kuin R-silmukan muodostuminen, joka edeltää DNA:n pilkkoutumista, voi hidastaa havaittua hajoamisnopeutta. Nämä tulokset osoittavat kuitenkin, että kohde-DNA:n havaitut pilkkoutumisnopeudet ovat ~100-kertaiset sekä HypaCas9:llä että Cas9-HF1:llä verrattuna SpCas9:ään. Kohteen ulkopuolisen DNA:n osalta havaitut pilkkoutumisnopeudet vähenevät 50- tai 860-kertaisiksi HypaCas9:llä tai Cas9-HF1:llä SpCas9:ään verrattuna.
Diskriminaatiota ei määritellä pelkästään DNA:n suhteellisten pilkkoutumisnopeuksien perusteella. Koska R-silmukan muodostuminen on nopeaa, erottelukyky riippuu pikemminkin DNA:n vapautumisnopeuden ja pilkkoutumisnopeuden välisestä kineettisestä jakautumisesta17,26,27. Kineettisen jakautumisen kvantifioimiseksi inkuboimme entsyymiä ja leimattua DNA:ta ilman Mg2+:ta, joka mahdollistaa R-silmukan muodostumisen tasapainoon, mutta estää katalyysin15. Tämän jälkeen lisäsimme Mg2+:a reaktion käynnistämiseksi, kun läsnä oli suuri määrä identtistä, leimaamatonta kohde-DNA:ta, joka toimi ansana. DNA-ansan läsnä ollessa ja ilman sitä tehtyjen rinnakkaisten kokeiden vertailu antaa arvion sidotun DNA:n dissosiaatioon ja pilkkoutumiseen liittyvästä osittaiskineettisestä jakautumisesta (kuva 4a). Kun SpCas9 oli sitoutunut kohde-DNA:han, se pilkkoutui nopeasti, eikä DNA-ansalla ollut juurikaan vaikutusta (kuva 4b). Sitä vastoin 33 % kohteen ulkopuolisesta DNA:sta irrottautui entsyymistä, kun taas ~67 % DNA:sta sitoutui pilkkoutumaan (kuva 4c ja täydentävä kuva 9a). Nämä tulokset osoittavat, että SpCas9 erottaa PAM-distaalisen epäsopivan DNA:n vähentämällä pilkkoutumisnopeutta, mikä lisää sen DNA:n osuutta, joka pikemminkin vapautuu kuin pilkkoutuu. Vaikutus on kuitenkin pieni, joten dissosioitumisnopeus näyttää olevan hitaampi kuin pilkkoutuminen.
a Kaavio DNA-loukkukokeesta. b, c SpCas9:n pilkkominen on-targetissa (lähteestä: Gong ym.15).) (b) tai kohteen ulkopuolisen (c) DNA:n pilkkominen. d, e HypaCas9:n pilkkominen kohteen (d) tai kohteen ulkopuolisen (e) DNA:n pilkkominen. f, g Cas9-HF1:n pilkkominen kohteen (f) tai kohteen (g) DNA:n pilkkominen. Entsyymiä (28 nM) ja leimattua DNA:ta (10 nM) inkuboitiin ilman Mg2+:a, ja reaktio käynnistettiin lisäämällä Mg2+:a merkitsemättömän DNA-ansan läsnäollessa tai poissa ollessa. A- ja A◦ kuvaavat amplitudia ansan kanssa (täytetyt ympyrät) ja ilman ansaa (avoimet ympyrät). Prosenttiosuus ilmaisee sen esisidotun DNA:n osuuden, joka on sitoutunut menemään eteenpäin pilkkomista varten suhteessa reaktioon ilman trappia.
Seuraavaksi tarkasteltiin kohde-DNA:han sidottujen HypaCas9:n ja Cas9-HF1:n kineettistä jakaantumista (Kuva 4d, f, Täydentävä kuva 9b, d). Tuloksemme HypaCas9:n ja Cas9-HF1:n osalta osoittavat, että ~75 % ja ~92 % kohde-DNA:sta pilkottiin vastaavasti ansan läsnä ollessa. Pilkotun DNA:n prosenttiosuus on pienempi kuin villityyppisellä SpCas9:llä, koska HypaCas9:n (0,035 s-1) ja Cas9-HF1:n (0,038 s-1) havaittu kohde-DNA:n sisäinen pilkkoutumisnopeus oli 100-kertaisesti hitaampi kuin SpCas9:llä (4,3 s-1). Tämä hitaampi pilkkoutumisnopeus antaa aikaa pienelle osalle (8-25 %) kohde-DNA:sta dissosioitua ennen kuin se pilkkoutuu.
Kineettinen jakautuminen dissosioitumista suosivaksi tehostui, kun HypaCas9 ja Cas9-HF1 reagoivat kohde-DNA:n ulkopuolisten DNA:n kanssa, koska pilkkoutumisnopeudet pienenivät entisestään 0,0023 s-1:een ja 0,00014 s-1:een (Kuva 4e, g, Täydentävä kuva 9c, e). Nämä nopeudet ovat vastaavasti 50-860-kertaisesti hitaampia kuin SpCas9:llä kohteen ulkopuolisella substraatilla. Vastaavasti vain ~24 % ja ~10 % sidotusta kohteen ulkopuolisesta DNA:sta sitoutui HypaCas9:n ja Cas9-HF1:n pilkottavaksi eteenpäin, kun läsnä oli ansa-DNA:ta. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että kehitetyt korkean uskollisuuden variantit saivat paremman spesifisyyden PAM-distaalista epäsopivaa DNA:ta vastaan vähentämällä selvästi pilkkoutumisnopeutta, mikä muuttaa kineettistä jakautumista siten, että sidotun substraatin vapautuminen suosii sitoutuneen substraatin pilkkoutumisen sijasta sekä kohteen DNA:lla että kohteen ulkopuolisella DNA:lla, mutta vaikutus on suurempi kohteen ulkopuolisella DNA:lla. Näennäisten dissosioitumisnopeusvakioiden laskeminen yhtälön (3) avulla osoittaa, että korkean uskollisuuden variantit eivät lisää DNA:n näennäistä vapautumisnopeutta (lisätaulukko 1).
Pikemminkin lisääntynyt erottelukyky johtuu kokonaan pilkkoutumisen näennäisen nopeusvakion pienenemisestä.
Tähänastisissa Cas9-entsyymien kinetiikkaa koskevissa kuvauksissamme reaktioiden havaitut hajoamisnopeudet arvioitiin sovittamalla dataa eksponentiaalisiin funktioihin, joiden tuloksena saadaan ominaistuloksia, jotka ovat tavallisesti kompleksisia funktioita useammasta nopeusarvovakioidusta17. Jotta kinetiikka ja mekanismi ymmärrettäisiin täysin, kaikki kokeet kunkin entsyymin ja DNA-substraatin osalta sovitettiin globaalisti perustuen nopeusyhtälöiden numeeriseen integrointiin yhden yhtenäisen mallin avulla (kuva 5 ja täydentävät kuvat 10-14). Maailmanlaajuinen datan sovitus osoittaa, että minimimallimme (kuva 5f, sisäkuva) vastaa dataa, ja jokainen nopeusvakio on hyvin määritelty luottamuskontuurianalyysin perusteella, jossa testataan, missä määrin data rajoittaa kutakin parametria (kuva 6)17,28. Huomattakoon erityisesti, että mallimme selittää joissakin kokeissa havaitut kaksivaiheiset jäljet ilman, että heterogeenisuuteen tarvitsee vedota, ja se antaa luontaiset nopeusvakiot jokaiselle polun vaiheelle, mukaan lukien R-silmukan muodostuminen sekä HNH- ja RuvC-halkaisutapahtumat. Vaikka on todennäköistä, että DNA:n pilkkomiseen tarvittavien katalyyttisten jäännösten kohdistaminen saattaa edellyttää muitakin ratkaisemattomia rakenteellisia uudelleenjärjestelyjä, niitä ei ole vielä selvitetty kineettisesti erillisinä tapahtumina. Nykyinen malli edustaa minimaalista reittiä, joka on välttämätön ja riittävä selittämään kaikki saatavilla olevat tiedot, ja sitä voidaan helposti laajentaa, kun uutta tietoa tulee saataville reitin lisävaiheiden määrittelemiseksi.
a DNA:n ja Mg2+:n aikaansaama HNH-domeenin käynnistämä pilkkoutuminen. b DNA:n ja Mg2+:n aikaansaama RuvC-domeenin käynnistämä pilkkoutuminen. c R-silmukan muodostumisnopeus. d Mg2+:n aikaansaama HNH-domeenin aikaansaama pilkkoutuminen. e Mg2+:n aikaansaama RuvC-domeenin aikaansaama pilkkoutuminen. f DNA:n ansan vaikutus Cas9:n pilkkoutumisen kineettiseen jakamiseen. Kaikki käyrät on laskettu kineettisen mallin (sisäkuva) mukaisen datan globaalin sovituksen perusteella, ja nopeusvakiot on esitetty taulukossa 1. Virhearviot perustuivat luottamuskontuurianalyysiin, kuten kuvassa 6 on esitetty. E on Cas9.gRNA, D on kohde-DNA, ED on Cas9.gRNA.DNA, EDH on R-silmukan muodostus, jossa kohdesäie kiinnittyy HNH:hon, EDHR ja EDP1R ovat R-silmukan muodostus, jossa muu kuin kohdesäie kiinnittyy RuvC:hen, EDHP2 on muun kuin kohdesäikeen RuvC:n pilkkominen, EDP1 on kohdesäikeen HNH:n pilkkominen, EDP1P2 on molempien säikeiden pilkkominen, Dtrap on ylimääräinen merkitsemätön, täydellisesti sovitettu DNA. EDtrap on Cas9.gRNA.DNAtrap.
Luotettavuuskontuurit on esitetty kuvassa 5 esitetyn datan sovittamista varten. Numeroidut nopeusvakiot on määritelty kineettisessä mallissamme (kuva 5f, sisäkuva). χ2-kynnysarvo (katkoviiva) asetettiin arvoon 0,99 kunkin nopeusvakion ylä- ja alarajan määrittelemiseksi kuvatulla tavalla17,32. Koska ääriviivat olivat symmetrisiä ja parametrit hyvin rajattuja, ilmoitamme ±virherajat taulukossa 1. Tätä analyysia varten laskettiin χ2-kynnysarvo F-jakauman avulla, ja sitä käytettiin määrittämään ala- ja ylärajat kullekin parametrille.
Ensyymin spesifisyyden ymmärtämiseksi nopeusvakioita on tulkittava kaikkien kineettisesti merkityksellisten vaiheiden yhteydessä, kuten vapaiden energioiden profiilista käy ilmi (laskettu yhtälön avulla. (4) taulukon 1 nopeusvakioista).
Lähetyskerroin A = 0,001
Koska globaalilla datan sovittamisella saadaan nopeusvakiot kullekin merkitykselliselle askeleelle (kuvat 5 ja 6), voimme rakentaa vilpittömän vapaidenergiankehitysenergian profiilin (kuvio 7b, ja täydentävät kuvat 10-14). SpCas9:n, HypaCas9:n ja Cas9-HF1:n vapaiden energioiden profiilit, joissa verrataan SpCas9:ää, HypaCas9:ää ja Cas9-HF1:tä, osoittavat muutosta nopeutta rajoittavissa ja spesifisyyttä määrittävissä vaiheissa. Entsyymin spesifisyys määritellään kcat/Km:n avulla, ja sen määrittää korkein yleinen este suhteessa lähtötilaan, kun taas maksiminopeus, kcat, määritellään korkeimman paikallisen esteen avulla suhteessa edeltävään tilaan, jota edeltävät nopean tasapainon vaiheet vaimentavat. Koska R-silmukan muodostumisen nopeusvakiot eivät muutu merkittävästi eri substraateilla ja entsyymivaihtoehdoilla, spesifisyys määräytyy suurelta osin Cas9:n R-silmukan, joka on kineettisessä mallissamme EDH-tila (kuva 5f, sisäkuva), kineettisen jakautumisen mukaan joko eteenpäin, mikä johtaa irreversiibeliin pilkkoutumiseen, tai vapautumiseen, joka tapahtuu DNA:n uudelleensulautumisen ja entsyymistä poistumisen kautta. Korkean uskottavuuden muunnoksilla havaitut korkeammat kokonaisesteet pilkkoutumiselle lisäävät kineettistä jakautumistodennäköisyyttä siten, että se suosii DNA:n dissosioitumista (kuva 6c).
a Sarjakuvamainen esitys Cas9-entsyymin reaktiopolusta. b Vapaan energian profiilit SpCas9:n pilkkomiselle on-kohteessa (harmaa viiva) Gongin ym. aineistosta.15 ja kohteen ulkopuolella (punainen viiva); HypaCas9:n pilkkominen kohteen ulkopuolella (sininen viiva); ja Cas9-HF1:n pilkkominen kohteen ulkopuolella (musta viiva). Kukin profiili laskettiin siirtymätilateorian avulla käyttäen nopeus- ja tasapainovakioita, jotka johdettiin kunkin koesarjan globaalista sovittamisesta (taulukko 1). Huomaa, että DNA:n pilkkoutumisen korkeammat esteet suhteessa edeltävän käänteisreaktion matalampaan esteeseen lisäävät DNA:n vapautumisen todennäköisyyttä. c Yhteenvetopalkkikaavio k2:lle, k3:lle ja kineettiselle jakautumiselle (P).