P38-kinaasin biologia
P38-MAPK-signalointireitti on ollut yksi biologian intensiivisimmin tutkituista aiheista siitä lähtien, kun se tunnistettiin ensimmäisen kerran yli 10 vuotta sitten. Kiinnostus tätä reittiä kohtaan on johtunut pääasiassa kahdesta tekijästä. Ensinnäkin tämä signalointireitti aktivoituu monenlaisten ärsykkeiden vaikutuksesta, ja se on osallisena lukuisissa sairauksissa, erityisesti tulehduksissa. Toiseksi selektiivisten p38:n estäjien varhainen saatavuus tarjosi kriittiset välineet, joita tarvittiin proteiinikinaasien roolin tarkempaan hahmottamiseen signaalireiteissä, sekä keinot p38:n eston terapeuttisten mahdollisuuksien hyödyntämiseen. Viimeisten viiden vuoden aikana suuri määrä p38:n estäjiä onkin tullut kliinisiin tutkimuksiin.
P38 MAP-kinaasin löytämisen aikaan oli jo tunnistettu MAP-kinaasiperheen ensimmäinen jäsen, solunulkoisen signaalin säätelemä kinaasi (ERK). Ei kuitenkaan ymmärretty, että oli olemassa kaksi muuta kaksoispesifisten treoniini/tyrosiinikinaasien alaryhmää (p38 ja JNK). Vuonna 1994 useat tutkimusryhmät tunnistivat toisistaan riippumatta uuden kinaasiaktiivisuuden (Freshney et al., 1994; Han et al., 1994; Rouse et al., 1994;), ja myöhemmin ihmisen cDNA:n kloonaus johti p38 α:n tunnistamiseen (Lee et al., 1994). Pian tämän jälkeen tunnistettiin kolme muuta p38-perheen spliisivarianttia, p38β, P38y ja p38h (Jiang et al., 1996, Jiang et al., 1997, Kumar et al., 1997). Kaksi perheen jäsentä, p38α ja β, ilmentyvät ubikvitaalisesti, mutta niitä säädellään eri tavoin eri solutyypeissä, kun taas kahden muun jakautuminen kudoksiin on rajoitetumpaa. Tähän mennessä p38α, jonka on todettu olevan osallisena monissa sairauksissa, on perheen parhaiten tunnettu jäsen (ks. Kumar ym., 2003 ja Saklatvala, 2004).
P38:n aktivoitumista on havaittu eri organismeissa vastauksena moniin ärsykkeisiin. Hiivan, madon ja sammakon p38α:n ortologit on yhdistetty osmoregulaatioon, stressivasteisiin ja solusyklin säätelyyn. Myös p38α:n säätelyä nisäkässoluissa on tutkittu hyvin (katsaus artikkelissa Zarubin ja Han, 2005). Nyt on selvää, että p38α-signalointireitti on monimutkainen, ja siihen vaikuttavat ärsykkeiden ja solutyypin lisäksi myös erilaiset säätelijät ja ylävirran aktivoivien kinaasien yhdistelmät. Tiedetään hyvin, että p38α:lla on kaksi tärkeintä ylävirran aktivoivaa kinaasia, MKK3 ja MKK6. Lisäksi on olemassa MKK:sta riippumaton p38α:n aktivaatiomekanismi, johon liittyy transformoivan kasvutekijän aktivoima proteiinikinaasi 1:n (TAK1) sitova proteiini (TAB) (Ge ym., 2002). P38α:n aktivoituminen voi tapahtua autofosforylaatiolla vuorovaikutuksen jälkeen TAB1:n kanssa. On myös esitetty, että p38 säätelee negatiivisesti TAK1-signalointia fosforyloimalla TAB1:n (Cheung ym., 2003). TAK1-signalointia alempana on IKK, joka toimii Tpl2-kinaasin ja sen alempana olevien kohteiden, MEK1:n ja ERK:n, olennaisena aktivointivaiheena (Waterfield ym., 2004). Siten p38:n estäminen johtaa TAK1:n ylössäätelyyn, joka johtaa ERK:n aktivoitumiseen. Tämä selittää, miksi ERK:n aktivaatiota havaitaan usein p38α:n estäjillä hoidetuissa soluissa. Tämä havainto korostaa tarvetta ymmärtää mahdollisia epälineaarisia ristikkäisvaikutuksia kinaasien signalointireittien välillä. TAK1:n lisäksi myös muut ylävirran kinaasit (MAP3K) ovat osallisina p38α:n ja sen läheisen naapurin, JNK:n, aktivoinnissa. Aktivointiprosessiin osallistuvat myös pienet GTP:tä sitovat proteiinit, kuten Rac1 ja Cdc42, ja niiden vuorovaikutus PAK:n (p21-aktivoitujen kinaasien) ja MLK1:n kanssa.
P38 MAP-kinaasien alavirran substraatteja ovat MAPKAPK2 (Kotlyarov ym, 2002) ja MAPKAPK3 (McLaughlin ym., 1996), jotka fosforyloivat erilaisia substraatteja – muun muassa pientä lämpösokkiproteiinia 27 (HSP27), lymfosyyttispesifistä proteiinia 1 (LSP1), cAMP-vaste-elementtiä sitovaa proteiinia (CREB), transkriptiotekijää (ATF1), SRF:ää ja tyrosiinihydroksylaasia. Erityisen kiinnostava on MAPKAPK2:n substraatti tritetraproliini, joka on mRNA:ta destabiloiva proteiini (Tchen ym., 2004). MNK on toinen p38:n substraatti, joka näyttää osallistuvan translaation käynnistymiseen, sillä se fosforyloi eIF-4E:tä (Waskewicz ym., 1997). Lisäksi p38α:n tiedetään aktivoivan myös p38-aktivoitunutta kinaasia (PRAK) ja mitogeeni- ja stressiaktivoitunutta proteiinikinaasia (MSK1), vaikka MSK1:tä aktivoi myös ERK (Deak ym., 1998). Ei ole yllättävää, että p38:n säätelemien transkriptiotekijöiden määrä on suuri (katsaus artikkelissa Zarubin ja Han, 2005). Joitakin esimerkkejä ovat aktivoivat transkriptiotekijät 1, 2 ja 6, SRF:n liitännäisproteiini (Sap1), GADD153, p53, c/EBPb, myosyyttejä tehostava tekijä 2C (MEF2C), MEF2A, DIT3, ELK1, NFAT ja high mobility group-box protein (HBP1). Myös muiden toisiinsa liittymättömien proteiinien, kuten cPLA1:n, Na+/H+-vaihtajan isoformi-1:n (NHE-1), taun, keratiini 8:n ja stathminin on osoitettu olevan p38α:n substraatteja.
Mekanismia, jolla p38 MAP-kinaasin estäjät tukahduttavat tulehduksellisten sytokiinien ilmentymistä, ei ole voitu selvittää. Tulehdusgeenien ilmentymistä säädellään voimakkaasti sekä transkriptionaalisella että post-transkriptionaalisella tasolla. Varhaiset tutkimukset, joissa tutkittiin p38-estäjien vaikutuksia ihmisen monosyyteissä, viittasivat siihen, että tulehduksellisten sytokiinien biosynteesin (pääasiassa IL-1 ja TNF) säätely tapahtuu transkription jälkeisellä tasolla. Myöhemmin kävi ilmi, että p38-reitin inhibitio voi vaikuttaa negatiivisesti mRNA:n stabiilisuuteen (Frevel ym., 2003). Tämä havainto johti jatkotutkimuksiin, joissa osoitettiin, että muihin tulehdusreaktioproteiineihin, kuten COX-2:een, vaikutettiin samalla tavalla (Lasa ym., 2000). Muita p38:n stabiloimia mRNA:ita ovat MIP-1a, gm-CSF, VEGF sekä MMP-1 ja -3 (Dean ym., 2004). Mielenkiintoista on, että myös MAPKAPK-2, joka on p38:n substraatti, osallistuu mRNA:n stabilointiin p38:n avulla. MAPKAPK-2:n katalyyttisesti aktiiviset muodot stabiloivat reporterin mRNA:ta, kun taas dominoivasti negatiivinen MAPKAPK-2 estää sen ilmentymisen (Winzen ym., 1999).
Yhteinen piirre mRNA:n vakauteen vaikuttaville rakenteellisille ominaisuuksille on AU-rikas motiivi pidennetyssä 3′UTR:ssä. Tämän motiivin kuvasivat ensimmäisen kerran Shaw ja Kamen (1986). Tällaisia AU-rikkaita elementtejä (ARE) on kolme erillistä luokkaa: yksi sisältää pienen määrän ARE:itä (kuten c-Fos), toinen sisältää suuremman määrän ARE:itä, joilla on useita pentameerejä (kuten TNFα, COX-2 jne.), ja kolmas luokka sisältää ARE:itä, joilla ei ole pentameerejä, mutta jotka sisältävät U-rikkaita alueita. ARE:t kohdistuvat mRNA:han solujen nopeaa deadenylaatiota varten. Yleisesti ottaen p38:n säätelemillä ARE:illä on samanlaisia rakenteellisia motiiveja, joissa on useita päällekkäisiä pentameerejä 3′UTR:ssä. On kuitenkin poikkeuksia, kuten MMP-1 ja -3 (Reunanen ym., 2002) ja tristetraproliini (Mahtani ym., 2001, Tchen ym., 2004), mRNA:t, jotka sisältävät vähintään yhden pentameerisen ja U-rikkaan sekvenssin. Tarkka mekanismi, jolla p38 säätelee mRNA:n vakautta, on edelleen epäselvä. On arveltu, että alempana oleva kinaasi MAPKAPK-2 on osallisena, samoin kuin vaikeasti hahmotettava ARE:tä sitova proteiini. Ehdokkaita on useita (Dean ym., 2004), mutta yksikään niistä ei täytä kaikkia kriteerejä, jotta se olisi proteiini, joka yhdistää p38-reitit ja ARE:tä sisältävän mRNA:n. Näistä tristetraproliini on mielenkiintoinen mahdollisuus, vaikka se toimii lähinnä ”off-kytkimenä” mRNA:n stabiloinnissa.
Lukuiset prekliinisistä tutkimuksista saadut tiedot viittaavat p38:n keskeiseen rooliin immunologisissa ja tulehdusreaktioissa (Dong ym., 2002; Kracht ja Saklatvala, 2002; Kumar ym., 2003). Nyt tiedetään, että p38-reitti aktivoituu selektiivisesti Th1-efektori-T-soluissa vasteena IL-12:lle ja IL-18:lle. Th1-sytokiinien, kuten interferoni gamma, tuotanto estyy p38-estäjillä, kun taas Th2-sytokiiniiniin kuuluvan IL-4:n tuotanto ei esty. Makrofageissa useita tulehdussytokiineja, kuten TNF:ää, IL-1:tä, IL-6:ta ja IL-8:aa, säädellään p38-reittien kautta. MKK3:n knock-out hiiren alkion fibroblastit reagoivat TNF:ään mutta eivät IL-1:een, UV:hen tai sorbitoliin, mikä osoittaa MKK3:n roolin TNF:n mutta ei IL-1:n toiminnassa. P38α knock-out hiiren alkion fibroblasteissa IL-1:n indusoima IL-6:n tuotanto on kuitenkin vakavasti heikentynyt. Nämä tiedot viittaavat siihen, että eri ligandit saavat aikaan eri kinaasien toiminnan p38-reitillä. Yhdessä laajan geneettisen ja in vivo -farmakologisen todistusaineiston kanssa nämä tulokset tukevat p38:aa pätevänä kohteena, jonka estämisestä voisi olla terapeuttista hyötyä monissa tulehdussairauksissa, erityisesti nivelreumassa (Foster ym., 2000). Muita farmakologisen intervention mahdollisuuksia ovat sydämen hypertrofia, Alzheimerin tauti, verisuonivauriot, psoriaasi ja tulehduksellinen suolistosairaus.