Tutkittavat sienet
Escovopsioides-isolaatit saatiin eri lehtileikkurimuurahaislajien ja muiden kuin lehtileikkurimuurahaislajien aiemmissa tutkimuksissa kerätyistä sieni-itiöistä . Tähän kokoelmaan kuuluu 20 isolaattia, jotka on saatu Atta sexdens-, Atta capiguara-, Atta cephalotes-, Acromyrmex balzani-, Acromyrmex heyeri-, Acromyrmex lundi- ja Trachymyrmex tucumanus-sienistä sekä Acromyrmex subterraneus subterraneus -sienestä saadun E. nivea -tyyppilajin lisäksi (taulukko 3). Lisäksi yksi lisäisolaatti saatiin Parauapebasista, Parasta, Brasiliasta, löydetystä muun kuin lehtimuurahaisen Apterostigma megacephala -pesäkkeestä (taulukko 3). Kaikilla isolaateilla oli kuvattuja Escovopsioides-suvun morfologisia ominaisuuksia: hyaliinipitoisia pesäkkeitä PDA:lla, terminaalisia ja interkalaarisia vesikkeleitä, joissa oli lageniformisia phialideja, hyaliinikonidioita pitkissä ketjuissa, aleurokonidioita ja klamydosporeiden kaltaisia rakenteita.
Isolaatit säilytetään konidia-suspensiona – 80 °C:n lämpötilassa (10 %:n glyserolissa) ja 10 °C:n lämpötilassa tislatussa vedessä laboratorion Laboratorio sieniekologian ja systematiikan laitoksella (Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Clarossa, Sao Paulon osavaltiossa Brasiliassa. Kaikki isolaatit elvytettiin varastoista inokuloimalla säilöttyjä konidioita PDA-alustalle ja inkuboimalla 7 päivää 25 °C:ssa pimeässä. Kaikki tutkitut isolaatit saatiin monosporisina viljelminä.
Escovopsioidesin molekulaarinen karakterisointi
Genominen DNA uutettiin CTAB-menetelmällä viljelmistä, joita kasvatettiin 2-prosenttisella mallasagarilla (MA2%) 5 päivän ajan pimeässä. Tef1- (alukkeet: EF6-20F ja EF6A-1000R), LSU- (alukkeet: CLA-F ja CLA-R) sekä ITS- (alukkeet: ITS5 ja ITS4) geenejä koodaavat geenit monistettiin kaikista isolaateista. Tef1:n osalta 1 μl laimennettua genomista DNA:ta (1:100) käytettiin templaattina monistusta varten käyttäen illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads -helmiä (GE Healthcare) seuraavissa olosuhteissa: aluksi denaturoitiin 94 °C:n lämpötilassa 2 minuutin ajan, sitten 15 sykliä 94 °C:n lämpötilassa 30 sekunnin ajan ja alkuhehkutuslämpötila 65 °C:n lämpötilassa, joka laski 1 °C:n verran kosketussykliä kohti, ja lopuksi pidennys 72 °C:n lämpötilassa 1 minuutin ajan. Toinen PCR-vaihe suoritettiin: 94 °C:ssa 30 sekunnin ajan, jonka jälkeen 35 sykliä 94 °C:ssa 30 sekunnin ajan, 48 °C:ssa 30 sekunnin ajan ja viimeinen pidennys 72 °C:ssa 1 minuutin ajan. ITS:n osalta 2 μl laimennettua genomista DNA:ta (1:100) käytettiin templaattina PCR:ää varten Schoch et al.:ssa kuvattujen olosuhteiden mukaisesti: 94 °C 3 minuutin ajan, jonka jälkeen 35 sykliä 94 °C:ssa 1 minuutin ajan, 55 °C:ssa 1 minuutin ajan ja viimeinen pidennysvaihe 72 °C:ssa 2 minuutin ajan. LSU:ta varten käytettiin 2 μl laimennettua genomista DNA:ta (1:100) PCR:ää varten noudattaen Augustin et al. kuvaamia olosuhteita: 95 °C 2 minuutin ajan, 40 sykliä 30 sekuntia 95 °C:ssa, 60 sekuntia 62 °C:ssa, 90 sekuntia 72 °C:ssa ja 5 minuutin pidennys 72 °C:ssa. PCR-tuotteet värjättiin GelRed™:llä (Biotium) ja visualisoitiin UV-valossa sen jälkeen, kun ne oli elektroforeesattu 1-prosenttisella agaroosigeelillä.
Amplikonit puhdistettiin Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kitillä (Promega) valmistajan protokollan mukaisesti. Näytteet analysoitiin NanoDrop™ 2000 -laitteella (Thermo Fisher Scientific) ja 20 ng DNA:ta sekvensoitiin BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kitillä (Thermo Fisher Scientific) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Escovopsioidesin ITS-alueen korkean GC-pitoisuuden vuoksi sekvensointireaktioihin lisättiin 5 % DMSO:ta. Eteenpäin ja taaksepäin suuntautuvat sekvenssit luotiin ABI 3500 -ohjelmalla (Life Technologies) ja koottiin kontigeiksi BioEdit v.7.1.3 -ohjelmalla. Tässä tutkimuksessa tuotetut sekvenssit talletettiin NCBI-GenBankiin (lisätiedosto 1: taulukko S1).
Fylogeneettinen analyysi
Tässä tutkimuksessa tuotettujen sekvenssien lisäksi tyypin lajin (E. nivea) sekä kuuden kuvatun Escovopsis-lajin ja kahdeksan Hypocreales-sukuun kuuluvan sienen (Hypomyces, Trichoderma ja Lecanicillium) sekvenssejä haettiin NCBI-GenBankista. Näin ollen tässä tutkimuksessa käytetty koko aineisto käsitti 37 sienen sekvenssit (lisätiedosto 1: taulukko S1).
Fylogeneettistä analyysia varten sekvenssit linjattiin MAFFT-ohjelmalla. Tef1-, ITS- ja LSU-sekvenssit yhdistettiin Winclada v.1.00.08 -ohjelmalla. Rekonstruktioalgoritmina käytettiin Bayesin päättelyä. Nukleotidisubstituutiomalli GTR + G ja GTR + I + G valittiin tef1:lle ja ITS/LSU:lle jModeltest2:n AIC:n avulla 95 prosentin luottamusvälillä. Näin ollen aineistosta suoritettiin osioituja riippumattomia analyysejä MrBayesissa kussakin kolmella lämmitetyllä ketjulla ja yhdellä kylmällä ketjulla. MCMC-näytteenotto kussakin analyysissä tapahtui miljoonaan sukupolveen asti. Lämmitettyjen ja kylmien ketjujen konvergenssi tapahtui, kun jakautumisfrekvenssien keskihajonta oli alle 0,01; tällöin ensimmäiset 25 % sukupolvista hylättiin sisäänpolttona.
Kaksoiskulttuurikokeet
Toteutimme in vitro -kokeita todentaaksemme Escovopsioidesin antagonistisen potentiaalin lehtileikkurimuurahaisten viljelemää sienilajia kohtaan. Valitsimme 13 Escovopsioides-isolaattia 21:stä (taulukko 3) seuraavien kriteerien perusteella: i) tef1-geenissä havaittu polymorfismi; ii) eri muurahaislajit, joihin se liittyy; iii) maantieteellinen sijainti (eli eri kaupungit ja keräyspaikat). Kaksi valituista isolaateista (LESF 596 ja LESF 599) arvioitiin jo Varanda-Haifigin ym. tutkimuksessa niiden vuorovaikutusten osalta sienilajikkeen kanssa. Toistimme kuitenkin tämän kokeen vertaillaksemme sitä muihin Escovopsioides-isolaatteihin.
Kaksoiskulttuurikokeissa käytettiin muurahaislajin Atta sexdens rubropilosa viljelemää sieniä Leucoagaricus gongylophorus FF2006. Tätä kantaa ylläpidetään agar-levyillä peräkkäisillä siirroilla 24 päivän välein 25 °C:ssa. Tämän kannan gongylidiatuotanto tarkistetaan jokaisessa siirtokierrossa. Tämä sieni kasvatettiin PDA-alustalla ja sitä inkuboitiin 25 °C:ssa 14 päivän ajan pimeässä. Tämän ajanjakson jälkeen sienifragmentit (halkaisijaltaan 8 mm) siirrettiin uusille Petri-levyille (90 × 15 mm), jotka myös sisälsivät PDA:ta, 1,5 cm:n etäisyydelle reunasta. Näitä levyjä inkuboitiin 25 °C:ssa 14 päivän ajan pimeässä. Tämän jälkeen Escovopsioidesin myseelin palasia (halkaisija 8 mm), joita oli aiemmin inkuboitu PDA:lla, inokuloitiin 3 cm:n etäisyydelle mutualistisesta sienestä. Vertaillaksemme Escovopsioidesin vaikutuksia sieniviljelmän myseelin kasvuun muiden sienten aiheuttamiin vaikutuksiin käytimme yhtä Escovopsis sp. -isolaattia (LESF 19), joka oli peräisin Atta sexdens rubropilosan (Botucatu, Brasilia) sienitarhoista. Tämä isolaatti saatiin inokuloimalla pieniä paloja sienipuutarhoista PDA:han, johon oli lisätty kloramfenikolia. Kontrollilevyille inokuloitiin sama mutualistinen sieni, mutta Escovopsioides- tai Escovopsis-sieniä ei inokuloitu. Kaikkia levyjä inkuboitiin 14 päivän ajan 25 °C:ssa pimeässä. Kukin Escovopsioides-, Escovopsis- ja mutualistisen sienen yhdistelmä tehtiin kymmenellä levyllä. Koe- ja kontrollilevyt skannattiin 0, 2, 3, 5, 7 ja 10 päivän välein HP Deskjet F2050 -skannerilla. Kuvia käytettiin mutualistisen sienen pesäkekasvun pinta-alan (cm2) mittaamiseen ImageJ v. 1.38 -ohjelmalla .
L. gongylophorus -sienen myseelikasvun pinta-alat kaksoiskulttuurikokeissa analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista sekamuotoista ANOVA-analyysiä, jossa sieni-isolaatit (Escovopsioides ja Escovopsis) vs. kontrolli olivat muuttujana tutkimuskohteiden välillä (between-subjects variable) ja aika (vrk) muuttujana tutkimuskohteiden sisällä (within-subjects variable), ja jossa otettiin huomioon näin ollen käsittelyjen aikamittauksen toistoasteet. Tietojen normaalisuus ja varianssien homogeenisuus tarkistettiin Shapiro-Wilkin ja Levenen testeillä. Koska näitä kriteerejä rikottiin, tiedot muunnettiin tarvittaessa käyttämällä logaritmia tai neliöjuurta. Moninkertaiset vertailut eri sädesienten kanssa suoritettiin käyttämällä t-testiä ja Bonferronin korjausta.
Isolaattien välistä vertailua varten Escovopsioides-isolaattien kanssa kosketuksissa olleen L. gongylophoruksen myseelikasvun pinta-ala jaettiin sen kontrollin keskimääräisellä pinta-alalla päivänä 10. Tietojen normaalisuus ja varianssien homogeenisuus tarkistettiin. Kaikkien testattujen sienten välillä tehtiin yksisuuntainen ANOVA kaikkien testattujen sienten 10. päivänä saadulla pinta-alalla, ja eri käsittelyjen väliset vertailut tehtiin post-hoc Tukey-HSD-testillä. Tilastolliset analyysit tehtiin R v. 2.12.1 -ohjelmalla.
Bioanalyysit sienipuutarhan palasilla ilman työntekijöitä
Leucoagaricus gongylophorus -sientä viljellään attine-muurahaispesissä sienipuutarhoissa. Määrittääksemme, voiko Escovopsioides kehittyä sienipuutarhassa ilman työläisten mahdollisia suojavaikutuksia, teimme biotestejä käyttäen tämän substraatin fragmentteja ilman muurahaisia. Sienipuutarhan palaset saatiin yhdestä kypsästä ja terveestä A. sexdens rubropilosa -yhdyskunnasta, jota ylläpidettiin sosiaalisten hyönteisten tutkimuskeskuksessa (UNESP, Rio Claro). Sienipuutarhan 2 cm3 :n kokoiset palat, joista oli poistettu muurahaiset ja poikaset, asetettiin steriileihin Petri-maljoihin, joiden reunoille oli laitettu kostutettua puuvillaa (Elizondo-Wallacen ym. mukaan). Ennen kokeiden suorittamista levyjä pidettiin yhden päivän ajan 25 °C:ssa, jotta palasiin mahdollisesti jääneet muurahaiset voitiin etsiä.
Valmistimme 10 ml:n suspensiota 0,05-prosenttisesta Tween 80:stä, jossa oli myseelimassaa ja konidioita kustakin 12:sta Escovopsioides-isolaatista (isolaattia LESF 591 ei käytetty tässä kokeessa) ja yhdestä kaksoiskasvatuskokeissa käytetystä Escovopsis-isolaatista. Tämä suspensio suodatettiin kahdesta kolmeen kertaan Newmeyerin menetelmän mukaisesti konidioiden erottamiseksi suspensiossa olevista hyfofragmenteista. Tämän jälkeen suspensio laimennettiin Neubauer-kammiossa määritettyyn määrään 105-2,105 konidia-mL-1 . 100 μL:n suuruiset konidia-suspension aliquotit inokuloitiin puutarhafragmentin pinnalle mikropipetillä. Sama määrä steriiliä 0,05-prosenttista 0,05-prosenttista Tween 80 -liuosta lisättiin puutarhapinnalle negatiivista kontrollia varten. Sienipuutarhaa sisältäviä petrimaljoja pidettiin 25 °C:ssa enintään 10 päivän ajan, ja kutakin käsittelyä varten käytettiin viisi maljaa ja kutakin kontrollia varten viisi maljaa. Mahdollista inokuloitujen sienten hyfojen kehittymistä tarkkailtiin päivittäin stereomikroskoopilla (EZ4, Leica). Escovopsioides-konidiaatiota sienipuutarhoissa havainnoitiin ottamalla sienipuutarhoissa kasvavia myseelifragmentteja, jotka kiinnitettiin veteen ja havainnoitiin mikroskoopilla (DM500, Leica).
Kasvua ja konidiaatiota koskevat tiedot sienipuutarhoissa pisteytettiin seuraavasti: ei kasvua (pistemäärä 0), kasvua havaittiin vain stereomikroskoopilla (pistemäärä 1), makroskooppista kasvua (pistemäärä 2) ja konidiaatiota (pistemäärä 3) 10 päivän seurannassa (Lisätiedostotiedosto 1: Kuva S1). Havainnoimme konidiaatiota vain sienen makroskooppisen kasvun jälkeen sienipuutarhoissa. Kunkin päivän viiden petrimaljan pisteiden kokonaissumma saatiin ja muunnettiin prosentteina suurimmasta mahdollisesta kokonaissummasta suoraa vertailua varten.
Escovopsioidesin vaikutukset puutarhoissa, joissa on työläisiä
Työläisillä on tärkeä rooli pesäkkeiden puolustuksessa patogeenejä ja ei-toivottuja mikrobeja vastaan sienipuutarhoissa . Niinpä teimme kokeita tarkistaaksemme työntekijöiden vaikutuksen sienipuutarhoissa, jotka oli inokuloitu samojen sienien konidioilla, joita käytettiin biomäärityksissä sienipuutarhoissa ilman muurahais-työläisiä (12 Escovopsioides-isolaattia ja 1 Escovopsis-isolaatti).
Biomääritykset, joissa käytettiin kuningattarena toimivia muurahaiskolonioita, ovat haastavia, koska tämäntyyppinen koe edellyttäisi suurta määrää kolonioita. Niinpä suoritimme biotestejä työntekijöitä sisältävillä puutarhapalasilla arvioidaksemme sieni-isolaattien vaikutuksia in vivo. Vaikka tämä koejärjestely ei edusta sitä, mitä luonnollisissa pesäkkeissä tapahtuu, se antoi suuntaa-antavaa tietoa työläisten puolustusvaikutuksesta testattuja sieniä vastaan. Tämä biotesti mukautettiin Elizondo-Wallacen ym. menetelmän mukaisesti. Käytettiin muovisäiliöitä, joiden pohjalla oli pieni kerros kipsiä, jotta vältettäisiin sienipuutarhojen kuivuminen. Muoviastioihin laitettiin noin 20 cm3 sienipuutarhaa samasta pesäkkeestä, jota käytettiin edellisessä kokeessa. Koejärjestelyssä oli yhteensä 84 astiaa, joten käsittelyissä, joissa käytettiin 13 sienen konidioita, ja vertailussa oli kussakin kuusi astiaa. Valitsimme työläismuurahaisia, joiden pääkapselin halkaisija oli 1,0-1,6 mm, ja 50 työläismuurahaista sijoitettiin kuhunkin astiaan. Työntekijöitä, joiden kapseli oli alle 1,0 mm, ei laskettu, ja työntekijät, joiden kapseli oli yli 1,6 mm, jätettiin pois. Tähän menettelyyn päädyttiin, jotta saavutettaisiin homogeenisuus kunkin käsittelyn kuuden säiliön välillä sekä käsittelyjen välillä, koska 1,0-1,6 mm:n välissä olevilla työntekijöillä on merkittävä puhdistusaktiivisuus . Säiliön sisäpinta päällystettiin Teflon®:lla muurahaisten pakenemisen estämiseksi.
Säiliöitä inkuboitiin 25 °C:ssa 3 päivän ajan sienipuutarhojen vakauttamiseksi. Konidiasuspensioita saatiin edellä kuvatulla tavalla. Sienipuutarhojen pinnalle ruiskutettiin yhteensä 1 ml konidiasuspensiota sumuttimella. Negatiivisen kontrollin sienipuutarhoihin ruiskutettiin vain 1 ml steriiliä 0,05-prosenttista 0,05-prosenttista Tween 80 -liuosta.
Kokeita seurattiin 0, 5 ja 10 päivän kuluttua inokulaatiosta sienipuutarhojen terveyden tarkistamiseksi. Tämä parametri perustui pisteytysjärjestelmään, jossa terveet puutarhat saivat pistemäärän 0, osittain hajonneet puutarhat saivat pistemäärän 1 ja täysin hajonneet (”infektoituneet”) puutarhat saivat pistemäärän 2. Sienipuutarhojen palojen poistaminen muurahaisilta ja sijoittaminen kaatopaikoille oli tärkein tutkimamme puutarhojen huonontumisen merkki (ks. lisätiedosto 1: kuva S2). Kunkin kokeen kuudesta astiasta kolmena havaintopäivänä saatuja pistemääriä verrattiin Friedmanin testillä.
Escovopsioides-isolaattien esiintymisen todentamiseksi sienipuutarhoissa päivinä 0, 5 ja 10 käsittelyn jälkeen puutarhoista poistettiin fragmentteja ja ne inokuloitiin MA2-prosenttiseen aineeseen, jota täydennettiin kloramfenikolilla, jonka pitoisuutena oli 150 μg ml- 1. Levyjä inkuboitiin 25 °C:ssa 7 päivän ajan pimeässä. Jokaiseen kuuteen astiaan kustakin käsittelystä käytettiin viisi levyä, joissa oli yksi puutarhajäänne, eli yhteensä 30 levyä käsittelyä kohti. Positiivista kasvua osoittaneet fragmentit laskettiin ja inokuloitujen sienten pitkäaikainen esiintyminen sienipuutarhoissa testattiin Fisherin eksaktilla testillä. Tässä analyysissä verrattiin sienikonidien (Escovopsioides ja Escovopsis) infektoimien frangementtien osuutta verrattuna kontrolliin, jossa ei ollut konidioita jokaisena koepäivänä. Vertailimme myös eri käsittelyjä, joissa oli inokuloituja sieniä, keskenään jokaisena koepäivänä.