3 Amylaasi-inhibiittorit

α-amylaasi (1,4-α-d-glukaaniglukanohydrolaasi, EC3.2.1.1) on endoglukanaasi, joka katalysoi tärkkelyksessä ja siihen liittyvissä polysakkarideissa esiintyvien endo α-(1,4)-glykosidisidosten hydrolyysiä. Tärkkelyksen hydrolyysin katalysoi ensin ihmisen syljessä oleva α-amylaasi ja sen jälkeen haima-amylaasi pohjukaissuolessa. Ihmisen haiman α-amylaasi (HPA) on tärkeä farmakologinen kohde tyypin 2 diabeteksen hoidossa. HPA:n kustannukset ovat kuitenkin suhteellisen korkeat tutkimustarkoituksiin. Sen sijaan sian haiman α-amylaasia (PPA) käytetään vitro-mädätysmittauksissa. PPA koostuu 496 aminohappojäännöksestä, ja se on 83-prosenttisesti identtinen ihmisen vastineensa HPA:n kanssa (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA on endotyyppinen amylaasi, ja se katalysoi amyloosin ja amylopektiinin sisäisten α-(1,4)-glykosidisidosten hydrolyysiä moninkertaisen hyökkäyksen kautta kohti pelkistymätöntä päätä (Robyt & French, 1970). Sian haiman α-amylaasin hydrolyysituotteet ovat pääasiassa maltoosia, maltotrioosia ja maltotetraoosia (Yook & Robyt, 2002). PPA:lla on kaksi isomeeria PPA-isotsyymi-I (PPA-I) ja PPA-II, joilla on sama molekyylipaino, mutta jotka eroavat hieman toisistaan aminohappokoostumuksen ja isoelektrisen pisteen suhteen (Pasero ym., 1986).

Naturaalisesti esiintyviä α-amylaasi-inhibiittoreita ovat mm. proteiinipohjaiset inhibiittorit ja sekundaariset metaboliitit. Ensin mainitut eivät kuulu tämän artikkelin piiriin, koska niillä on taipumus denaturoitua lämpökäsittelyssä tai happamassa (mahalaukun happamuus) käsittelyssä ja ne menettävät aktiivisuutensa joutuessaan ohutsuoleen. Tässä esitetään yhteenveto α-amylaasin estäjiä koskevasta uusimmasta kirjallisuudesta. Myös niiden estoaktiivisuuden mittaamisessa käytetyt menetelmät on lueteltu, koska eri menetelmät voivat johtaa erilaisiin IC50-arvoihin. Verrattuna α-glukosidaasiin α-amylaasista löytyy vähemmän raportteja, ja suurin osa tutkimuksista koskee polyfenoleja.

Isookaniini (57) (Kuva 3.8), joka on eristetty espanjankielisistä neulasista (Bidens bipinnata), osoitti kohtalaista inhibitioaktiivisuutta HPA:lla (IC50-arvo oli 0,447 mg/ml tai 156 μM) jodometrisellä määrityksellä mitattuna (Yang et al., 2012). On huomattava, että isookaniini sisältää kaksi katekolista yksikköä, joten sen oletetaan olevan hyvä pelkistysaine, joka saattaa vähentää jodia aiheuttaen vääriä positiivisia tuloksia.

Kuva 3.8. Kemialliset rakenteet amylaasi-inhibiittoreille, yhdisteille 57-59, 5-kahveoyylikiinihapolle ja 4,5-dikahveoyylikiinihapolle.

Vesihakemuksen (Syzygium aqueum) lehdestä myritsetiini-3-O-ramnosidia (9) ja europetiini-3-O-ramnosidia (10) (kuva 3.3.3). 3.2) eristettiin, ja niiden α-amylaasin estoaktiivisuus mitattiin DNSA-määrityksellä, ja se oli 10 kertaa (EC50 ~ 2,0 μM) vahvempi kuin akarboosin (EC50 19 μM). Näin korkea aktiivisuus on melko harvinaista polyfenolisilla yhdisteillä, ja se vaatii lisätutkimuksia erityisesti sen estomekanismista ja selektiivisyydestä, kun näitä yhdisteitä haastetaan monimutkaisen elintarvikematriisin kanssa. Myriketiini on vahva radikaalinpoistaja, joten myös 9:n ja 10:n stabiilisuus on huolenaihe. Kirjoittajat raportoivat, että kversetiinin EC50-arvo (17 μM) oli verrattavissa akarboosin EC50-arvoon (19 μM). Käyttämällä laboratoriossamme kehitettyä sameusmääritystä emme pystyneet havaitsemaan kversetiinin estoaktiivisuutta haiman α-amylaasia vastaan käyttämällä vertailustandardina akarboosia (Huang ym., julkaisemattomat tulokset). Siksi on tarkistettava, onko ilmoitettu EC50-arvo menetelmästä riippuvainen, jotta mahdollinen artefakti voidaan sulkea pois (Manaharan et al., 2012). Cleistocalyx operculatus kuuluu myös Myrtaceae-heimoon. Hu, Luo, Li, Joshi ja Lu (2012) eristivät ja puhdistivat 2′4′-dihydroksi-6′-metoksi-3′5′-dimetyylikalkonia (DMC) C. operculatusin kuivatuista kukannupuista. Yhdiste osoitti ei-kilpailevaa inhibitiomekanismia PPA:ta kohtaan (Hu ym., 2012).

Tilirosidi (58) (Kuva 3.8), joka on eristetty koiranruusun, Rosa canina L., siemenistä, estää PPA:ta IC50:n ollessa 280 mM, ja kineettinen tutkimus osoittaa, että se on ei-kilpaileva inhibiittori, jonka Ki-arvot ovat 84,2 μM kvantifioimalla käyttäen substraattina p-nitrofenyyli-alfa-da-d-pentaglukosidia. Toisin kuin akarboosilla, tilirosidilla ei ole inhibitioaktiivisuutta α-glukosidaasia vastaan. Ehkä sen heikon α-amylaasin estoaktiivisuuden vuoksi eläinmallissa tarvitaan suuria annoksia tilirosidia (600 mg/kg) vähentämään postprandiaalista plasman glukoosipitoisuutta hiirillä, joita on hoidettu tärkkelyksellä 2 g/kg. Tilirosidilla voi olla antihyperglykemiaa estämällä sekä natriumrieriippuvaisen glukoosin kuljettaja 1:n että glukoosin kuljettaja 2:n välittämää glukoosin ottoa enterosyyteissä (Goto ym., 2012).

Kurkumiinin ja sen johdannaisten on ehdotettu olevan monitekijäisiä yhdisteitä, joilla on hyvin monenlaisia terveysvaikutuksia. Mahdollisena tärkkelyksen sulatusnopeutta lieventävänä aineena Curcuma longa -kasvin juurakosta saatavalla bisdemetoksikurkumiinilla (59) (kuva 3.8) on HPA- ja PPA:n estoaktiivisuus, jonka IC50-arvot ovat noin 25 μM DNSA-määrityksellä. Kineettinen tutkimus osoittaa, että se on HPA:n ei-kompetitiivinen inhibiittori, jonka näennäinen Ki on 3,0 μM (Ponnusamy et al., 2012).

Mono- ja disubstituoidut kofeokiinihapot ovat tärkeimmät polyfenoliset yhdisteet, joita esiintyy vihreissä kahvipavuissa. Koska kiniinihapporenkaassa on kolme sekundaarista hydroksyyliryhmää, monosubstituoiduista kofeoyylikiinihapoista on olemassa kolme keskenään vaihtelevan aseman isomeeriä ja kolme dikafeoyylikiinihappoa, jotka kaikki puhdistettiin vihreistä kahvipavuista. Niiden PPA-I:n (Narita & Inouye, 2011) estoaktiivisuus mitattiin käyttämällä p-nitrofenyylidiglukosidia, joka hydrolyysin yhteydessä tuottaa p-nitrofenolia ja maltoosia. Huomionarvoista on, että inhiboiva aktiivisuus on erittäin riippuvainen kofeoyyliryhmien sijainnista monokofeoyylikiinihapossa. 5-kahveoyylikiinihapolla (tai yleisesti tunnetulla klorogeenihapolla) (kuva 3.8) on korkeampi inhibitioaktiivisuus, jonka IC50-arvo on 80 μM, verrattuna 4-kahveoyylikiinihapon (120 μM) ja 3-kahveoyylikiinihapon (230 μM) inhibitioaktiivisuuteen. Kolmen dikafoeyylikviniinihappo-isomeerin inhiboiva aktiivisuus on paljon suurempi eivätkä ne ole yhtä herkkiä esteriryhmien sijainnille, koska 3,4- ja 4,5-dikafoeyylikviniinihapoilla (kuva 3.8) on samat IC50-arvot (20 mM), ja 4,5-dikafoeyylikviniinihapon IC50-arvo on 30 μM (Narita & Inouye, 2011).