Hongos examinados
Los aislados de Escovopsioides se obtuvieron de jardines de hongos de diferentes especies de hormigas cortadoras y no cortadoras de hojas recogidas en estudios anteriores . Esta colección comprende 20 aislados obtenidos de Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi y Trachymyrmex tucumanus, además de la especie tipo de E. nivea obtenida de Acromyrmex subterraneus subterraneus (Tabla 3). También se obtuvo un aislado adicional de una colonia de la hormiga no cortadora de hojas Apterostigma megacephala encontrada en Parauapebas, Pará, Brasil (Tabla 3). Todos los aislados presentaban las características morfológicas descritas del género Escovopsioides: colonias hialinas en PDA, vesículas terminales e intercalares con fialidas lageniformes, conidios hialinos en cadenas largas, aleuroconidios y estructuras similares a clamidosporas .
Los aislados se mantienen como suspensiones de conidios a – 80 °C (en glicerol 10%) y en agua destilada a 10 °C en la colección del Laboratorio de Ecología y Sistemática Fúngica (LESF), Río Claro, Estado de São Paulo, Brasil. Todos los aislados fueron revividos a partir de stocks inoculando conidios preservados en medio PDA e incubados durante 7 días a 25 °C, en la oscuridad. Todos los aislados examinados se obtuvieron como cultivos monospóricos.
Caracterización molecular de Escovopsioides
El ADN genómico se extrajo por el método CTAB de cultivos realizados en agar malta 2% (MA2%) durante 5 días, en oscuridad. Se amplificaron los genes que codifican para tef1 (cebadores: EF6-20F y EF6A-1000R), LSU (cebadores: CLA-F y CLA-R) así como ITS (cebadores: ITS5 e ITS4) para todos los aislados. Para tef1, se utilizó 1 μL de ADN genómico diluido (1:100) como plantilla para la amplificación utilizando illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) en las siguientes condiciones: un paso inicial de desnaturalización a 94 °C durante 2 min, seguido de 15 ciclos a 94 °C durante 30 s y temperatura inicial de recocido a 65 °C disminuyendo 1 °C por ciclo de anotación y extensión final a 72 °C durante 1 min. Se realizó un segundo paso de PCR: 94 °C durante 30 s, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante 30 s, 48 °C durante 30 s y un paso de extensión final a 72 °C durante 1 min. Para el ITS, se utilizaron 2 μL del ADN genómico diluido (1:100) como plantilla para la PCR, siguiendo las condiciones descritas en Schoch et al. : 94 °C durante 3 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 1 min, 55 °C durante 1 min y un paso de extensión final a 72 °C durante 2 min. Para la LSU, se utilizaron 2 μL de ADN genómico diluido (1:100) para la PCR, siguiendo las condiciones descritas en Augustin et al. : 95 °C durante 2 min, 40 ciclos de 30 s a 95 °C, 60 s a 62 °C, 90 s a 72 °C y 5 min de extensión a 72 °C. Los productos de la PCR se tiñeron con GelRed™ (Biotium) y se visualizaron bajo luz ultravioleta tras la electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Los amplicones se purificaron con el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System (Promega) siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras se analizaron en NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) y se secuenciaron 20 ng de ADN con BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Debido al alto contenido de GC en la región ITS de Escovopsioides, se añadió un 5% de DMSO a las reacciones de secuenciación. Las secuencias directas e inversas se generaron en ABI 3500 (Life Technologies) y se ensamblaron en contigs en BioEdit v.7.1.3 . Las secuencias generadas en el presente estudio se depositaron en el NCBI-GenBank (Archivo adicional 1: Tabla S1).
Análisis filogenético
Además de las secuencias generadas en este estudio, se recuperaron del NCBI-GenBank las secuencias de la especie tipo (E. nivea) junto con las de seis especies descritas de Escovopsis y ocho hongos pertenecientes a los Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma y Lecanicillium). Así, el conjunto de datos utilizado en este estudio comprendía secuencias de 37 hongos (Archivo adicional 1: Tabla S1).
Para el análisis filogenético, las secuencias se alinearon en MAFFT . Las secuencias de tef1, ITS y LSU se concatenaron en Winclada v.1.00.08. Se utilizó la inferencia bayesiana como algoritmo de reconstrucción. Se seleccionó el modelo de sustitución de nucleótidos GTR + G y GTR + I + G para tef1 e ITS/LSU, respectivamente, utilizando AIC en jModeltest2 con un intervalo de confianza del 95%. Por lo tanto, se realizaron análisis independientes particionados del conjunto de datos en MrBayes, cada uno con tres cadenas calentadas y una cadena fría. El muestreo MCMC en cada análisis se realizó hasta un millón de generaciones. La convergencia de las cadenas calentadas y frías se produjo cuando la desviación estándar de las frecuencias de división fue inferior a 0,01; entonces el primer 25% de las generaciones se descartó como burn-in.
Experimentos de doble cultivo
Realizamos pruebas in vitro para verificar el potencial antagónico de Escovopsioides hacia el hongo cultivado por las hormigas cortadoras de hojas. Seleccionamos 13 de los 21 aislados de Escovopsioides (Tabla 3), basándonos en los siguientes criterios: i) cualquier polimorfismo encontrado en el gen tef1; ii) diferentes especies de hormigas asociadas; iii) localización geográfica (es decir, diferentes ciudades y lugares de recolección). Dos de los aislados seleccionados (LESF 596 y LESF 599) ya fueron evaluados por sus interacciones con el hongo cultivador en el estudio de Varanda-Haifig et al. . Sin embargo, replicamos este ensayo para comparar con otros aislados de Escovopsioides.
En los experimentos de doble cultivo se utilizó el hongo Leucoagaricus gongylophorus FF2006 cultivado por la especie de hormiga Atta sexdens rubropilosa. Esta cepa se mantiene en slants de agar mediante transferencias sucesivas cada 24 días a 25 °C. La producción de gongilidios por parte de esta cepa se comprueba en cada ciclo de transferencia. Este hongo se cultivó en medio PDA y se incubó a 25 °C durante 14 días, en la oscuridad. Tras este periodo, se transfirieron fragmentos de micelio (8 mm de diámetro) a nuevas placas de Petri (90 × 15 mm) que también contenían PDA a una distancia de 1,5 cm del borde. Estas placas se incubaron a 25 °C durante 14 días, en la oscuridad. A continuación, se inocularon fragmentos de micelio (8 mm de diámetro) de Escovopsioides, previamente incubados en PDA, a una distancia de 3 cm del hongo mutualista. Para comparar los efectos de Escovopsioides sobre el crecimiento del micelio del hongo cultivador con los efectos causados por otros hongos, utilizamos un aislado de Escovopsis sp. (LESF 19) procedente de los jardines de hongos de Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brasil). Este aislado se obtuvo inoculando pequeños trozos de los jardines de hongos en PDA suplementado con cloranfenicol. Las placas de control se inocularon con el mismo hongo mutualista, sin embargo, no se inocularon Escovopsioides ni Escovopsis. Todas las placas se incubaron durante 14 días a 25 °C, en la oscuridad. Cada combinación de Escovopsioides, Escovopsis y el hongo mutualista se realizó en diez placas. Las placas experimentales y de control se escanearon a intervalos de 0, 2, 3, 5, 7 y 10 días en un escáner HP Deskjet F2050. Las imágenes se utilizaron para medir el área de crecimiento de la colonia (cm2) del hongo mutualista en ImageJ v. 1.38 .
Las áreas de crecimiento del micelio de L. gongylophorus en los experimentos de doble cultivo se analizaron mediante ANOVA mixto de dos vías, con los aislamientos fúngicos (Escovopsioides y Escovopsis) frente al control como variable entre sujetos, y el tiempo (días) como variable dentro de los sujetos, considerando así las medidas de repetición del tiempo en los tratamientos. Se comprobó la normalidad y la homogeneidad de las varianzas de los datos mediante las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente. Debido a las violaciones de estos criterios, los datos se transformaron utilizando el logaritmo o la raíz cuadrada cuando fue necesario. Las comparaciones múltiples con diferentes hongos filamentosos se realizaron utilizando la prueba t con la corrección de Bonferroni.
Para la comparación entre aislados, el área de crecimiento micelial de L. gongylophorus en contacto con los aislados de Escovopsioides se dividió por el área media de su control en el día 10. Se comprobó la normalidad de los datos y la homogeneidad de las varianzas. Se realizó un ANOVA de una vía con el área obtenida al día 10 entre todos los hongos ensayados, con comparaciones entre los diferentes tratamientos realizadas mediante el test post-hoc Tukey-HSD. Los análisis estadísticos se realizaron en R v. 2.12.1 .
Bioensayos en fragmentos de jardines de hongos en ausencia de obreras
Leucoagaricus gongylophorus se cultiva en colonias de hormigas attinas en jardines de hongos. Para determinar si Escovopsioides puede desarrollarse en el jardín de hongos sin los posibles efectos protectores de las obreras, realizamos bioensayos utilizando fragmentos de este sustrato libres de hormigas. Los fragmentos de jardín de hongos se obtuvieron de una colonia madura y sana de A. sexdens rubropilosa mantenida en el Centro de Estudios de Insectos Sociales (UNESP, Río Claro). Se colocaron fragmentos de jardín de hongos de 2 cm3 desprovistos de hormigas y crías en placas de Petri estériles con algodón humedecido en los bordes (siguiendo a Elizondo-Wallace et al. ). Antes de realizar los experimentos, las placas se mantuvieron durante 1 día a 25 °C para buscar hormigas que posiblemente permanecieran en los fragmentos.
Preparamos una suspensión de 10 mL de Tween 80 al 0,05% con masa micelial y conidios de cada uno de los 12 Escovopsioides (el aislado LESF 591 no se utilizó en este experimento) y un aislado de Escovopsis utilizado en los experimentos de doble cultivo. Esta suspensión se filtró dos o tres veces siguiendo el método de Newmeyer para separar los conidios de los fragmentos de hifas presentes en la suspensión. A continuación, la suspensión se diluyó hasta 105 a 2,105 conidios mL-1determinados en una cámara de Neubauer. Se inocularon alícuotas de 100 μL de suspensiones de conidios en la superficie del fragmento de jardín utilizando una micropipeta. Se añadió la misma cantidad de solución estéril de Tween 80 al 0,05% sobre la superficie del jardín en el control negativo. Las placas de Petri con el jardín de hongos se mantuvieron a 25 °C durante un máximo de 10 días, utilizándose cinco placas para cada tratamiento y cinco placas para cada control respectivo. El posible desarrollo de hifas de los hongos inoculados se observó diariamente en un estereomicroscopio (EZ4, Leica). La conidiación de Escovopsioides en los jardines de hongos se observó tomando fragmentos de micelio que crecían en los jardines y se montaron en agua y se observaron al microscopio (DM500, Leica).
Los datos de crecimiento y conidiación en los jardines de hongos se puntuaron como: sin crecimiento (puntuación 0), crecimiento observado sólo en el estereomicroscopio (puntuación 1), crecimiento macroscópico (puntuación 2) y conidiación (puntuación 3) a lo largo de 10 días de seguimiento (Archivo adicional 1: Figura S1). Observamos la conidiación sólo después del crecimiento macroscópico del hongo en los jardines de hongos. Se obtuvo la suma total de las puntuaciones de cinco placas de Petri en cada día y se transformó en términos de porcentaje del total máximo posible para realizar comparaciones directas.
Efectos de Escovopsioides en jardines con obreras
Las obreras tienen un papel importante en la defensa de la colonia contra patógenos y microbios no deseados en los jardines de hongos . Por lo tanto, realizamos experimentos para comprobar la influencia de las obreras en jardines de hongos inoculados con conidios de los mismos hongos utilizados en los bioensayos en jardines de hongos en ausencia de obreras (12 aislados de Escovopsioides y 1 aislado de Escovopsis).
Los bioensayos utilizando colonias de hormigas en posición vertical son un reto debido al gran número de colonias que este tipo de experimento exigiría. Por lo tanto, realizamos bioensayos con fragmentos de jardines que contienen obreras para evaluar los efectos de los aislados fúngicos in vivo. Aunque este montaje experimental no representa lo que ocurre en las colonias naturales, mostró información indicativa sobre la acción defensiva de las obreras contra los hongos probados. Este bioensayo se adaptó siguiendo el método de Elizondo-Wallace et al. Se utilizaron recipientes de plástico con una pequeña capa de yeso en el fondo para evitar la desecación de los jardines de hongos. En los recipientes de plástico se colocaron unos 20 cm3 de jardín de hongos de la misma colonia utilizada en el experimento anterior. El montaje experimental comprendía un total de 84 contenedores, de modo que los tratamientos con conidios de los 13 hongos y el control tenían seis contenedores cada uno. Se seleccionaron hormigas obreras con un diámetro de la cápsula cefálica entre 1,0 y 1,6 mm, y se colocaron 50 de estas obreras en cada contenedor. Las obreras con menos de 1,0 mm no se contaron, y las obreras con más de 1,6 mm se excluyeron. Este procedimiento se adoptó para permitir la homogeneidad entre los seis contenedores de cada tratamiento, así como entre los tratamientos, porque las obreras en el intervalo entre 1,0 y 1,6 mm tienen una actividad de limpieza significativa . La superficie interior del contenedor se recubrió con Teflon® para evitar que las hormigas se escaparan.
Los contenedores se incubaron a 25 °C durante 3 días para estabilizar los jardines de hongos. Las suspensiones de conidios se obtuvieron como se ha descrito anteriormente. Se pulverizó un total de 1 mL de suspensión de conidios sobre la superficie de los jardines de hongos utilizando un pulverizador. Los huertos de hongos del control negativo se rociaron con sólo 1 mL de solución estéril de Tween 80 al 0,05%.
Los experimentos se supervisaron después de 0, 5 y 10 días de inoculación para comprobar la salud de los huertos de hongos. Este parámetro se basó en un sistema de puntuación, en el que los jardines sanos recibieron la puntuación 0, los jardines parcialmente degradados recibieron la puntuación 1 y los jardines completamente degradados («infectados») recibieron la puntuación 2. La eliminación por parte de las hormigas de las piezas de los jardines infectados y su asignación a los vertederos fue el principal signo de deterioro de los jardines que examinamos (véase el archivo adicional 1: Figura S2). Las puntuaciones obtenidas en los seis contenedores de cada experimento, en los 3 días de observación, se compararon mediante el test de Friedman.
Para verificar la presencia de los aislados de Escovopsioides en los jardines de hongos en los días 0, 5 y 10 después del tratamiento, se extrajeron fragmentos de los jardines y se inocularon en MA2% suplementado con 150 μg mL- 1 de cloranfenicol. Las placas se incubaron a 25 °C durante 7 días, en la oscuridad. Se utilizaron cinco placas con un fragmento de jardín para cada uno de los seis contenedores de cada tratamiento, con un total de 30 placas por tratamiento. Se contaron los fragmentos con crecimiento positivo y se comprobó la presencia a largo plazo de los hongos inoculados en los jardines de hongos mediante la prueba exacta de Fisher. En este análisis se comparó la proporción de franjas infectadas con conidios de hongos (Escovopsioides y Escovopsis) frente al control sin conidios en cada día de experimento. También comparamos los diferentes tratamientos con hongos inoculados entre sí en cada día de experimento.