Diseño del estudio

En este ensayo de dos brazos, doble ciego y aleatorizado, reclutaremos a 60 mujeres embarazadas de entre 19 y 42 años que viven en Vancouver, BC, Canadá. Las participantes serán aleatorizadas para recibir un suplemento diario durante 16 semanas con 0,6 mg/día de ácido fólico o una dosis equimolar (0,625 mg/día) de ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico (Fig. 2). La dosis de 0,6 mg coincide con los niveles encontrados en las principales marcas comerciales de vitaminas prenatales (Materna®), aumentando así la generalización de nuestros resultados. La intervención de 16 semanas se basó en la vida media estimada del folato en los glóbulos rojos y pretende permitir la medición del estado del folato a largo plazo en los glóbulos rojos (durante las últimas 12-16 semanas). Todas las participantes también recibirán un multivitamínico prenatal que no contenga folato, para asegurar la adecuación de otros nutrientes (por ejemplo, hierro) durante el embarazo. Se recogerán muestras de sangre venosa en ayunas en la línea de base y en la línea final para medir las medidas de resultado primarias, incluyendo el folato sérico, el folato RBC y el UMFA plasmático; las medidas exploratorias incluirán la S-adenosil-metionina, la S-adenosil-homocisteína, la homocisteína total, la cisteína total, la metionina, la vitamina B12, el piridoxal-5-fosfato, la colina libre y la betaína. También se determinará el genotipo de las variantes MTHFR (677 C > T, rs1801133, y 1298 A > C, rs1801131) y DHFR (rs1643649 y rs70991108) y un hemograma completo. Las mujeres tendrán la opción de continuar en la fase posparto (exploratoria) del estudio, donde en su visita final se les darán más suplementos para tomar hasta aproximadamente una semana después del parto. Entre los días 5 y 7 después del parto, las mujeres proporcionarán una pequeña muestra de leche materna (3 ml) y una muestra de sangre venosa sin ayuno. Los resultados evaluados en la leche materna incluirán las formas de folato (UMFA, THF, 5-metil-THF, 5-formyl-THF y 5,10-methenyl-THF) y el FBP de la leche. Los resultados evaluados en la muestra de sangre posparto incluirán el folato de los glóbulos rojos y el UMFA del plasma. El protocolo del estudio se ha desarrollado de acuerdo con los artículos de protocolo estándar de 2013: Recomendación para Ensayos de Intervención (SPIRIT) directrices (Fig. 3) . Véase el archivo adicional 1 (lista de verificación SPIRIT) para más detalles.

Diagrama de flujo de los participantes

Partes del protocolo estándar: Recomendación para Ensayos de Intervención (SPIRIT) cronograma de inscripción, intervenciones y evaluaciones

El objetivo primario de este estudio piloto es obtener estimaciones del cambio en el folato sérico, el folato RBC y el UMFA tras la suplementación con ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico y ácido fólico durante 16 semanas de embarazo para informar el diseño de un ensayo definitivo con potencia adecuada. El objetivo secundario es obtener las tasas de reclutamiento y participación para ayudar en el diseño y la viabilidad de un ensayo definitivo. Los objetivos exploratorios de la fase posparto son cuantificar la proporción del folato total de la leche materna como ácido fólico en cada grupo, evaluar la correlación entre el AGM del plasma materno posparto y el ácido fólico de la leche materna, y evaluar las concentraciones de folato en el RBC después del parto en cada grupo.

Participantes, reclutamiento y consentimiento informado

Criterios de inclusión: (1) mujer embarazada (embarazo único); (2) que viviera en el área metropolitana de Vancouver; (3) ≤ 21 semanas de gestación en el momento del consentimiento; (4) 19-42 años de edad; y (5) que fuera capaz de dar su consentimiento informado.

Criterios de exclusión: (1) condiciones médicas preexistentes que se sabe que afectan al estado del folato materno (enfermedades intestinales malabsortivas e inflamatorias, enfermedad celíaca activa, cirugía de bypass gástrico, gastritis atrófica, epilepsia, enfermedad hepática avanzada, diálisis renal, diabetes mellitus tipo 1 o 2, rasgo de células falciformes/anemia) ; (2) factores de estilo de vida que se sabe que afectan al estado del folato materno (tabaquismo actual, consumo de alcohol, uso de drogas recreativas) ; (3) tener un riesgo medio o alto de desarrollar un embarazo afectado por un DTN (se aplica a las mujeres o a su pareja masculina: antecedentes personales o familiares (padres o hermanos) de otras anomalías congénitas sensibles al folato, antecedentes personales de DTN o un embarazo anterior afectado por DTN) ; (4) medicamentos que se sabe que interfieren con el metabolismo de las vitaminas B (cloranfenicol, metotrexato, metformina, sulfasalazina, fenobarbital, fenitoína, primidona, triamtereno, barbitúricos) ; (5) índice de masa corporal (IMC) previo al embarazo ≥ 30 kg/m2; o (6) alergia a alguno de los ingredientes del suplemento del estudio.

Tamaño de la muestra

El tamaño de la muestra se calculó en base al objetivo primario de estimar la distribución (media ± desviación estándar) del cambio en los resultados primarios (folato sérico, folato RBC y UMFA) tras 16 semanas de suplementación. Para lograrlo, necesitaremos 50 mujeres (25 en cada grupo); una muestra de al menos n = 50 es generalmente reconocida como adecuada para los estudios piloto de investigación clínica . Se añadirá un 20% de inflación para tener en cuenta a las participantes que abandonen o pierdan el seguimiento; así, se reclutará un total de 60 mujeres (30 en cada grupo).

Reclutamiento

Los carteles se expondrán en el BC Women’s Hospital, en clínicas médicas y prenatales y en establecimientos de venta al por menor para mujeres embarazadas (por ejemplo, clases prenatales, estudios de fitness, tiendas de ropa de maternidad) en todo Vancouver, BC, Canadá. Los detalles del estudio se compartirán con el personal y los profesionales de la salud, incluidos los médicos, las matronas, las enfermeras y otros, según corresponda. Se utilizará publicidad en las redes sociales (Facebook e Instagram) y se dirigirá a mujeres embarazadas de entre 19 y 42 años en el área metropolitana de Vancouver, BC.

Obtención del consentimiento informado y confirmación de la elegibilidad

Las mujeres interesadas en participar se pondrán en contacto directamente con el coordinador de la investigación (KMC). En ese momento, se describirán los detalles del estudio, la elegibilidad y el consentimiento informado. Las participantes elegibles que deseen inscribirse recibirán una identificación del estudio y se programará su visita de referencia. Se indicará a las participantes que continúen con cualquier suplemento prenatal de multivitaminas/folatos hasta su visita inicial. La fase posparto opcional del estudio se describirá en el formulario de consentimiento informado; sin embargo, a las participantes que decidan continuar más allá de las 16 semanas primarias se les dará un formulario de consentimiento separado para que lo firmen.

Visitas del estudio

Las visitas del estudio se facilitarán en Vancouver, BC, Canadá, en el Edificio de Alimentación, Nutrición y Salud de la Universidad de British Columbia y en la Unidad de Evaluación de la Investigación Clínica del Hospital de Niños y Mujeres de BC. Línea de base (8-21 semanas de gestación): Tanto el participante como el coordinador de la investigación (KMC) firmarán el formulario de consentimiento informado; se escaneará una copia y se enviará por correo electrónico al participante tras la visita del estudio. Los participantes rellenarán un cuestionario de referencia para recoger los antecedentes médicos y nutricionales y los datos demográficos. Se utilizará un cuestionario validado sobre la frecuencia de los alimentos para calcular los DFE. El peso y la altura se tomarán con una báscula electrónica y un estadiómetro y se registrarán con una precisión de 0,1 kg y 0,10 m, respectivamente. Se tomará una muestra de sangre venosa de 12 ml en ayunas durante 3 horas. Los participantes recibirán los suplementos del estudio (ácido fólico o ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico) y se les proporcionará un diario de suplementos para registrar la ingesta diaria. Punto medio: después de 8 semanas, se contactará con todas las mujeres para comprobar el cumplimiento, abordar cualquier pregunta o preocupación y programar una visita final. Final (24-37 semanas de gestación): se recogerá una muestra de sangre venosa de 12 ml y 3 horas de ayuno, se medirá el peso como se ha descrito anteriormente y las participantes completarán un cuestionario final para determinar cualquier cambio en el estado de salud o en el uso de la medicación desde el inicio. Los participantes devolverán su diario de suplementos y se contarán todas las cápsulas restantes. Posparto: en la visita final, las participantes que planean amamantar y que tienen un congelador doméstico que funciona pueden continuar en la fase posparto del estudio. Una vez obtenido el consentimiento mediante un segundo formulario de consentimiento informado, se les darán suplementos para que los sigan tomando hasta aproximadamente una semana después del parto y un nuevo diario de suplementos. Las participantes recibirán formación sobre cómo recoger una pequeña muestra de leche materna (3 ml) en su casa en los días 5-7 postparto y se les dará todo el material necesario (descrito con más detalle en la sección «Recogida y procesamiento de la leche materna» más adelante). Las participantes guardarán su muestra de leche materna en el congelador y notificarán al coordinador de la investigación cuando esté lista para ser recogida. La recogida se realizará en los 4 días siguientes a la notificación y en ese momento se tomará una muestra de sangre venosa de 12 ml. Se instruirá a las mujeres para que tomen su suplemento de folato 2 h antes de la recogida de las muestras de leche materna y de sangre para normalizar el pico de UMFA en plasma (y potencialmente la captación de UMFA en la leche materna; sin embargo, el momento de este proceso no está bien descrito).

Suplementos del estudio

El ácido fólico y el ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico se proporcionarán por separado de las multivitaminas prenatales. Esta decisión se tomó porque algunas mujeres informan de intolerancia al consumir multivitaminas prenatales; esto se debe normalmente al alto contenido de hierro y se resuelve después del primer trimestre . Si se produce una intolerancia temporal, las participantes pueden omitir o tomar media dosis de su multivitamínico, mientras siguen complementando con la dosis completa de folato. Los ingredientes a granel para el ácido fólico y las multivitaminas prenatales han sido proporcionados por Natural Factors (Coquitlam, BC, Canadá). El ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico a granel (Metafolin®) ha sido proporcionado por Merck & Cie (Schaffhausen, Suiza). Todos los ingredientes a granel han sido compuestos en cápsulas de gel vegetal en Natural Factors (Coquitlam, BC, Canadá). Las cápsulas de ácido fólico y de ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico tienen un aspecto idéntico para facilitar el doble ciego. El multivitamínico prenatal contiene la misma formulación de micronutrientes que WN Pharmaceuticals Ltd.® Prenatal (NPN 80025456), salvo que se ha eliminado el ácido fólico. Natural Factors (Coquitlam, BC, Canadá) completó un resumen general de calidad para todos los suplementos del estudio y lo verificó Health Canada, con la confirmación de las dosis de ácido fólico y de ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. El 26 de julio de 2019, la dirección de productos sanitarios naturales y sin receta del Ministerio de Salud de Canadá proporcionó un aviso de autorización para la solicitud de ensayos clínicos (número de presentación 244456).

Doble cegamiento, aleatorización y suministro de paquetes de suplementos

Un asistente de investigación independiente de Natural Factors (Coquitlam, BC, Canadá) asignará códigos de cegamiento (A o B) a los suplementos de ácido fólico y ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico. Los frascos de suplementos de folato se etiquetarán con «A» o «B» e indicarán que «las cápsulas son de ácido fólico o de folato». Tanto los participantes como el equipo de investigación principal estarán cegados a las asignaciones de los suplementos, que sólo se descodificarán una vez completados los análisis estadísticos finales. La secuencia de aleatorización será generada por ordenador por un estadístico independiente, utilizando bloques de cuatro que contienen cada uno dos participantes por grupo de suplemento. El equipo de investigación principal no conocerá la secuencia de aleatorización. En la visita inicial de cada participante, el coordinador de la investigación (KMC) desvelará la asignación (A o B) para esa identificación del estudio sólo para proporcionar los suplementos del estudio asignados. En la línea de base, los participantes recibirán un paquete de suplementos que contiene todas las cápsulas para la intervención de 16 semanas; si los participantes deciden continuar con la fase posparto del estudio, se les darán más suplementos en su visita final para que continúen tomándolos hasta ~ 1 semana después del parto.

Medicaciones concomitantes

Una vez inscritos, no habrá restricciones en la ingesta de medicamentos a lo largo del período de intervención; sin embargo, todos los medicamentos deben ser informados. La única excepción serán los suplementos nutricionales que contengan folato/ácido fólico, que no se permitirán durante todo el período de intervención.

Estrategias para mejorar la adherencia

Las mujeres embarazadas tienden a estar muy motivadas y, en general, están interesadas en participar en los ensayos de investigación clínica. Según una encuesta de la Agencia de Salud Pública de Canadá, el 94% de las mujeres de la Columbia Británica toman suplementos multivitamínicos prenatales durante el embarazo. Por lo tanto, es probable que las participantes estén acostumbradas a tomar suplementos diarios en el momento de la inscripción. El coordinador de la investigación (KMC) se pondrá en contacto con cada participante a mitad de camino (8 semanas después de su visita inicial) para resolver cualquier duda o preocupación. Además, el paquete de suplementos permitirá el almacenamiento organizado de los suplementos en casa y el diario de suplementos servirá como recordatorio diario para mejorar la adherencia a lo largo de las 16 semanas. Por estas razones, anticipamos una alta adherencia (> 90%) al protocolo del estudio.

Recogida y procesamiento de muestras de sangre

Se recogerán muestras de sangre venosa (12 mL en total) en un tubo de ácido etilendiaminotetraacético

(EDTA) de 6 mL, un tubo de EDTA de 2 mL y un tubo de suero de 4 mL (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) en las visitas inicial, final y posparto (si procede). Las extracciones de sangre de la línea de base y de la línea final se realizarán después de un ayuno de 3 horas; este período de tiempo es suficiente para reducir la influencia de confusión de la ingesta reciente de folato en las concentraciones séricas. La muestra de sangre postparto (~ 1 semana postparto) será sin ayuno, ya que esto no influirá en el folato de los glóbulos rojos y reducirá la carga de los participantes. Después de la recogida, los tubos se protegerán de la luz, se invertirán suavemente según las recomendaciones del fabricante, se colocarán en una nevera y se transportarán al laboratorio para su procesamiento inmediato (dentro de las 2 horas siguientes a la recogida).

Para la preparación del hemolizado de la sangre total, se extraerá la sangre total (0,3 mL) del tubo EDTA de 6 mL y se diluirá 1/11 añadiendo 3,0 mL de una solución de ácido ascórbico al 1% y se incubará posteriormente a 37 °C durante 30 min. El tubo de 6 mL de EDTA se centrifuga entonces a 3000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. Se recogerá el plasma y (sólo para las muestras de la línea de base y de la línea final) el contenido restante del tubo de 6 mL con EDTA se procesará para el aislamiento de las células de la capa mononuclear de la sangre periférica (PBMC) con el protocolo de aislamiento SepMate PBMC (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá). El tubo de 2 ml con EDTA se utilizará para el recuento sanguíneo completo. El tubo de suero de 4 ml se dejará a temperatura ambiente durante unos 30 minutos (hasta que se coagule) y luego se centrifugará a 3000 rpm durante 15 minutos a 4 °C; se recogerá el suero. Todas las alícuotas se almacenarán a – 80 °C hasta su posterior análisis.

Recogida y procesamiento de la leche materna

Se instruirá a las mujeres para que recojan la leche materna en los días 5-7 postparto entre las 13:00 y las 14:50 (ya que la concentración media de folato durante este tiempo parece ser representativa de las concentraciones medias de folato durante un periodo de 24 horas) , 2-3 h después de su última extracción completa. Las participantes se extraerán completamente la leche materna (manualmente o con una bomba eléctrica) del pecho derecho. Una vez extraída la leche materna, se indicará a las mujeres que agiten suavemente la leche para mezclarla y, a continuación, utilizando una pipeta de halcón estéril, transferirán 0,5 mL a dos crioviales de color ámbar (cada uno de ellos con 0,005 g de ácido ascórbico para una dilución del 1%) y 1 mL a dos crioviales de color ámbar. Todos los crioviales estarán claramente marcados en los niveles de 0,5 y 1 mL. Las mujeres colocarán todos los viales en una caja de congelación que se guardará en el congelador durante un máximo de 4 días. Las muestras se recogerán congeladas y se trasladarán al laboratorio para su almacenamiento a – 80 °C hasta su posterior análisis.

Análisis de laboratorio

El folato sérico (nmol/L) y el folato RBC (nmol/L) se analizarán mediante ensayo microbiológico, como se recomienda a nivel mundial, utilizando el método de placa de microtitulación descrito por Molloy et.al . El folato RBC (nmol/L) se calculará con la siguiente fórmula:

Biomarcadores plasmáticos que incluyen UMFA (nmol/L), S-adenosilmetionina (μmol/L), S-adenosilhomocisteína (μmol/L), homocisteína total (μmol/L), cisteína total (μmol/L), metionina (μmol/L), colina libre (μmol/L) y betaína (μmol/L) se analizarán mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida . La vitamina B12 (pmol/L) se analizará mediante un inmunoanalizador. El piridoxal-5-fosfato (nmol/L) se analizará mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem. Las variantes genéticas serán genotipadas mediante ensayos de genotipado TaqMan SNP . Se realizará un recuento sanguíneo completo utilizando un analizador hematológico automatizado (Sysmex XNL-550). Las formas de folato de la leche materna (incluyendo UMFA, THF, 5-metil-THF, 5-formil-THF y 5,10-metenil-THF) se cuantificarán mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem; el folato total representará la suma de estas formas. Las concentraciones de FBP en la leche materna se medirán mediante un procedimiento de radioensayo de unión competitiva (como el descrito por Selhub et al.) .

Resumen de los datos que se recogerán

Datos demográficos, médicos y nutricionales a través de cuestionarios estructurados

La recogida de datos iniciales incluirá la edad, el origen étnico, la paridad, la educación, la ocupación, los ingresos del hogar, los antecedentes médicos y de medicación, el peso declarado antes del embarazo, la dieta general (incluyendo la ingesta de alimentos veganos, vegetarianos, cetogénicos, sin gluten y cualquier alimento/grupo de alimentos evitados por cualquier motivo) y el uso de suplementos. La recopilación de datos finales incluirá cualquier cambio en la salud general o en el uso de medicamentos desde la visita inicial.

Antropometría

El IMC pregestacional se calculará utilizando el peso pregestacional autodeclarado y la altura medida. Se tomarán las medidas de los participantes en la línea de base (peso y altura) y en la línea final (sólo peso) para calcular el aumento de peso gestacional a lo largo del periodo de intervención y el aumento de peso total a lo largo del embarazo (utilizando el peso autoinformado antes del embarazo y el peso medido en la línea final).

Evaluación dietética

Los DFE totales (μg/día) procedentes de los folatos alimentarios y del ácido fólico suplementario se calcularán utilizando el Block Folic Acid/Dietary Folate Equivalents Screener (NutritionQuest, Berkeley, CA, USA), un cuestionario validado de frecuencia de alimentos .

Datos posparto

Se registrarán las semanas totales de suplementación, las semanas de gestación en el momento del parto, el cumplimiento del protocolo de recogida de leche materna y el momento de la suplementación con folatos antes de la recogida de muestras de sangre de leche materna y posparto.

Criterios de retirada

Los criterios de retirada incluyen la interrupción espontánea o planificada del embarazo, el uso de suplementos nutricionales adicionales que contengan folato/ácido fólico y tras un acontecimiento adverso/grave asociado a los suplementos/intervención del ensayo (según determine el investigador cualificado (CM)). Los participantes también pueden retirarse en cualquier momento y no se recogerá más información. Independientemente del motivo de la retirada, todos los datos recogidos previamente se conservarán para el análisis. Las participantes que den a luz antes de su visita final tendrán la opción de continuar en la fase posparto del estudio, siempre que sigan complementándose diariamente con los suplementos del estudio.

Manejo de datos y privacidad

Todos los datos y las muestras biológicas se identificarán utilizando el ID del estudio de cada participante. Los datos con identificadores personales se almacenarán en un ordenador encriptado y protegido por contraseña en un espacio de servidor seguro con el Instituto de Investigación del Hospital Infantil de BC. Los datos con identificadores personales desvinculados se limpiarán y el coordinador de la investigación (KMC) y un asistente de investigación independiente completarán la entrada en REDCap (Research Electronic Data Capture) alojado en el Instituto de Investigación del Hospital Infantil de BC. KMC, JAH y CDK tendrán acceso al conjunto de datos final. Los documentos en papel se guardarán en un archivador cerrado con llave y las muestras biológicas se guardarán en un congelador cerrado dentro del laboratorio del investigador principal (CDK) en la Universidad de British Columbia. Los participantes podrán ser informados de su asignación de suplemento de folato y de los resultados de folato en sangre/leche materna (si procede) (incluyendo DFE, folato en suero y RBC al inicio, al final y después del parto, y las concentraciones totales de folato en la leche materna) después de que se completen los análisis estadísticos finales.

Datos y análisis estadístico

Se utilizarán estadísticas descriptivas para los datos de referencia de los participantes. Las variables continuas se informarán con una media ± desviación estándar (o mediana y rango intercuartil si no tienen una distribución normal) y las variables categóricas como números absolutos por grupo y porcentaje. El recuento de cápsulas se utilizará para calcular la adherencia de los participantes y el diario de suplementos se utilizará para proporcionar una visión descriptiva de las barreras a la adherencia. Se evaluará la normalidad de los datos y se considerarán las transformaciones o el uso de pruebas no paramétricas equivalentes si los datos no siguen una distribución normal. Los análisis estadísticos se realizarán con Stata (StataCorp, College Station, TX, USA). Todos los análisis se completarán inicialmente por intención de tratar según la asignación inicial del grupo en la línea de base y sin ninguna imputación de datos faltantes. Los análisis secundarios por protocolo se llevarán a cabo incluyendo a aquellos que hayan completado el estudio y se hayan adherido al protocolo del estudio. Se utilizará la imputación múltiple para corregir los datos que falten, según proceda, en los análisis de sensibilidad.

Análisis primarios

Calcularemos la media ± desviación estándar de los resultados primarios (folato sérico, folato RBC y UMFA en plasma) en cada grupo al inicio y al final, así como la media ± desviación estándar del cambio dentro de la mujer en estos resultados en cada grupo. Estas estimaciones se utilizarán para calcular el tamaño de la muestra del ensayo definitivo.

Análisis secundarios

Se llevarán a cabo análisis exploratorios de los resultados primarios utilizando un modelo de regresión lineal múltiple para investigar si el cambio desde la línea de base hasta la línea final difiere según el estado del tratamiento, ajustando por los valores de la línea de base y las variables explicativas (DFE, biomarcadores exploratorios, semanas de gestación al inicio del suplemento). También se calculará la proporción de mujeres con UMFA ≥ 0,2 nmol/L (considerada una concentración detectable) al inicio y al final del estudio en cada grupo. Para informar nuestro objetivo secundario, la tasa global de participación en el estudio se estimará dividiendo el número total de mujeres inscritas por el número total de mujeres que estaban interesadas en participar. La tasa de reclutamiento semanal se estimará dividiendo el número total de mujeres inscritas por el número total de semanas que se tardó en reclutarlas. La tasa de retención de participantes se estimará dividiendo el número de mujeres que completan el ensayo completo entre el número total de mujeres inscritas. Para cada estrategia de reclutamiento (incluyendo carteles, medios sociales, boca a boca), se evaluará el alcance total (sólo medios sociales), las consultas, las inscripciones y el coste. Las probabilidades de inscripción después de preguntar por cada estrategia se evaluarán con un odds ratio. Si están disponibles, se registrarán las razones para no inscribirse.

Análisis posparto

Calcularemos la media ± desviación estándar para la proporción de ácido fólico en la leche materna (dividiendo la concentración de ácido fólico en la leche materna por la suma de todas las formas de folato en la leche materna) y para el folato RBC materno posparto. Se utilizará una regresión lineal para estimar la asociación entre la concentración de ácido fólico en la leche materna y el AGM en el plasma materno después del parto. Los resultados posparto se analizarán más a fondo utilizando una regresión lineal múltiple, ajustando los valores finales y las variables explicativas (DFE, total de semanas de suplementación, cumplimiento del protocolo de recogida de leche materna).

Seguridad

El ácido fólico se suministra a una dosis que cumple las recomendaciones canadienses para mujeres embarazadas (0,4-1,0 mg/día); por lo tanto, se considera de bajo riesgo. La sal de calcio del ácido (6S)-5-metiltetrahidrofólico está reconocida como segura y se incluye en los multivitamínicos prenatales canadienses sin que se haya establecido un límite máximo tolerable (no se conoce actualmente ningún riesgo de daño). La aleatorización se realizará entre las 8 y las 21 semanas de gestación (después del cierre del tubo neural). Teniendo en cuenta el bajo riesgo de este estudio piloto, no se consideró necesaria la creación de un comité de supervisión de datos. Los investigadores principales (CDK y JAH) y un investigador cualificado (CM) abordarán todos los problemas de seguridad y, si es necesario, la decisión de finalizar el ensayo, y lo comunicarán al Comité de Ética de la Investigación y al Ministerio de Sanidad de Canadá. El desenmascaramiento de los códigos de intervención puede llevarse a cabo en cualquier momento si se considera necesario para la supervisión de la seguridad de los participantes.