Zellkultur bedeutet im Wesentlichen die Verteilung von Zellen in einer künstlichen Umgebung (in vitro), die aus den notwendigen Nährstoffen, der idealen Temperatur, den Gasen, dem pH-Wert und der Feuchtigkeit besteht, damit die Zellen wachsen und sich vermehren können.

• In vivo – Wenn die Studie lebende biologische Einheiten innerhalb des Organismus einbezieht.

• In vitro – Wenn die Studie mit biologischen Einheiten (Zellen, Gewebe usw.) durchgeführt wird, die aus ihrer natürlichen biologischen Umgebung isoliert wurden. Z.B. Gewebe oder Zellen, die aus der Leber oder Niere isoliert wurden.

Während Gewebestücke in eine geeignete Kultur gegeben werden können, um Zellen zu erzeugen, die dann für die Kultur verwendet werden können (Explantkultur), können Zellen aus Geweben (Weichgewebe) durch enzymatische Reaktionen gewonnen werden. Dabei werden Enzyme wie Trypsin und Proname verwendet, um das Gewebe aufzuspalten und die gewünschten Zellen freizusetzen.

Wenn Zellen durch enzymatische oder mechanische Verfahren direkt aus dem Organismus/tierischen Gewebe (oder auch Pflanzengewebe) gewonnen wurden, werden diese Zellen als Primärzellen bezeichnet. Zellen, die sich (nach der ersten Subkultur) unter speziellen Bedingungen unbegrenzt weiter vermehren, werden dagegen als Zelllinien bezeichnet.

Diese besonderen Zellen wurden über einen langen Zeitraum passagiert, wodurch sie homogene (ähnliche) genotypische und phänotypische Merkmale erhalten.

Morphologie

Aufgrund ihres Aussehens können Zellen in Kultur in drei Hauptgruppen eingeteilt werden:

• Fibroblasten – Dazu gehören Zellen, die eher bipolar/multipolar sind und eine längliche Form haben. Diese Zellen sind mit dem Substrat verbunden, während sie wachsen.

• Epithelial – Epithelähnliche Zellen erreichen eine polygonale Form mit regelmäßigen Abmessungen. Obwohl sie dazu neigen, in diskreten Flecken zu wachsen, wachsen diese Zellen auch an das Substrat angeheftet.

• Lymphoblasten – Diese Zellen haben gewöhnlich eine kugelförmige Gestalt und haften nicht an der Oberfläche des Substrats. Daher werden sie in Suspension gezüchtet.

* Für feste Platten werden Verfestigungsmittel (wie Agar) verwendet, wenn das flüssige Medium mit Agar verwendet wird.

Bedeutung der Zellkultur

Die Zellkultur ist eine wichtige Technik sowohl in der Zell- als auch in der Molekularbiologie, da sie die beste Plattform für die Untersuchung der normalen Physiologie und Biochemie von Zellen bietet. Eine Zelle ist die grundlegende strukturelle, funktionelle und biologische Einheit aller Lebewesen.

Um einen Organismus oder ein bestimmtes Gewebe zu verstehen, ist es wichtig zu wissen, wie seine Zellen funktionieren. Durch die Zellkultur wird dies möglich, vor allem weil die primären Zellen den elterlichen Zellen des Organismus/Gewebes ähneln.

Was immer man über die Zellen in vitro lernt, ist repräsentativ für das, was mit dem Organismus/Gewebe geschieht. Daher ist die Zellkultur für die Entwicklung von Impfstoffen, das Screening (Medikamente usw.) und die Diagnose bestimmter Krankheiten/Zustände von großer Bedeutung.

Da die verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Umgebungen für ihre Vermehrung benötigen, gibt es verschiedene Arten von Kulturmedien wie serumfreie und serumhaltige Medien und andere.

Wenn die richtigen Voraussetzungen gegeben sind, vermehren sich die Zellen und können Kolonien bilden, die dann leicht zu sehen und zu identifizieren sind.

Wenn man weiß, was mit dem Verfahren erreicht werden soll, ist es einfacher, die Kultur mit den richtigen Komponenten vorzubereiten. Wenn der Forscher versteht, worauf das Verfahren abzielt, weiß er, ob er ein Selektivmedium (das das Wachstum bestimmter Zellen ermöglicht) oder ein Differenzialmedium (das das Wachstum verschiedener Zelltypen ermöglicht) vorbereiten soll.

Primäre Zellkultur

Zellkultur ist ein Verfahren, bei dem Zellen (tierische oder pflanzliche Zellen) aus dem Organismus entnommen und in eine künstliche Umgebung mit günstigen Wachstumsbedingungen gebracht werden. Auf diese Weise können Forscher die Zellen untersuchen und mehr über sie erfahren.

Es gibt drei Hauptarten von Zellkulturen:

• Primäre Zellkultur
• Sekundäre Zellkultur und
• Zelllinie

Hier werden wir uns auf die primäre Zellkultur konzentrieren.

Es gibt zwei Arten von Primärzellen:

Adhärente Zellen – Auch als verankerungsabhängige Zellen bezeichnet, handelt es sich dabei um Zellen, die für ihr Wachstum eine Anheftung benötigen. Adhärente Zellen sind unbeweglich und werden aus Organen wie der Niere gewonnen.

Suspensionszellen – Dies sind Zellen, die keine Anheftung benötigen, um zu wachsen. Sie werden daher auch als verankerungsunabhängige Zellen bezeichnet und umfassen Zellen wie die Lymphozyten im Blutsystem.

In der primären Zellkultur werden Zellen, die aus Elterngeweben (lebenden Geweben) wie Leber und Niere gewonnen wurden, in geeignete Wachstumsmedien eingebracht. Sobald die Zellen gewonnen sind, können sie entweder als Explantatkultur, Suspension oder Monolayer kultiviert werden.

* Bei der primären Zellkultur müssen die Zellen aus dem elterlichen/lebenden Gewebe gewonnen worden sein. Das heißt, sie stammen nicht aus einem anderen Kulturverfahren.

Bevor die Zellen kultiviert werden, werden sie zunächst einer enzymatischen Behandlung zur Dissoziation unterzogen. Diese Behandlung muss jedoch so kurz wie möglich sein, um die Zellen nicht zu beschädigen oder abzutöten. Sobald einzelne Zellen gewonnen wurden, werden sie in geeigneten Medien kultiviert, damit sie wachsen (sich teilen) und die gewünschte Anzahl erreichen.

Anfänglich ist die Kultur tendenziell heterogen, da sie aus verschiedenen Zelltypen besteht, die aus dem Gewebe gewonnen wurden.Dies kann zwar durch den In-vitro-Prozess (in einer Kultur in einem geeigneten Medium) beibehalten werden, aber nur für einen begrenzten Zeitraum.

Durch den Transformationsprozess können die primären Zellen über einen langen Zeitraum verwendet werden, wobei sich die Kultur im Laufe der Zeit verändert. Diese Zellen werden als kontinuierliche Zelllinien bezeichnet.

Primärzellen werden jedoch in der Regel gegenüber kontinuierlichen Zelllinien bevorzugt, da sie (physiologisch) invivo-Zellen (Zellen aus dem lebenden Gewebe) ähnlicher sind. Darüber hinaus können kontinuierliche Zelllinien bestimmte Veränderungen erfahren (phänotypische und genotypische Veränderungen), die zu Diskrepanzen bei der Analyse führen würden. Sie können daher nicht dazu verwendet werden, um festzustellen, was mit den In-vivo-Zellen geschieht. Aus diesem Grund werden Primärzellen bevorzugt.

Da die Primärzellen den aus lebendem Gewebe gewonnenen Zellen deutlich ähneln, sind sie für Forschungszwecke wichtig, da sie zur Untersuchung ihrer Funktionen, Stoffwechselregulationen, Zellphysiologie, Entwicklung, Defekte und Bedingungen, die das betreffende Gewebe betreffen, verwendet werden können.

Außerdem werden sie u.a. für die Herstellung von Impfstoffen, für gentechnische Wirkstoffscreenings sowie für Toxizitätstests und die pränatale Diagnostik verwendet.

Zellkulturmedien

In Zellkulturtechniken werden Zellen (oder Gewebe) aus einer Pflanze oder einem Tier entnommen und in eine neue, künstliche Umgebung eingebracht, die ihre Vermehrung (Überleben und Wachstum) unterstützen kann.

Zu den Anforderungen an eine solche Umgebung für die Vermehrung der Zellen gehören unter anderem:

• Ein Substrat (Nährstoffquelle)
• Günstiger Temperaturbereich (kontrolliert)
• Wachstumsmedium, und
• Günstiger pH-Wert unter anderem

Hier, konzentrieren wir uns auf das Medium (Zellkulturmedium)

Obwohl es verschiedene Arten von Kulturmedien (für verschiedene Zelltypen) gibt, bestehen sie typischerweise aus:

• Glucose
• Aminosäuren
• Vitamine
• anorganische Salze
• Anheftungsfaktoren etc.

Es gibt zwei Haupttypen von Nährböden:

Natürliche Nährböden – Natürliche Nährböden bestehen aus biologischen Flüssigkeiten, die natürlich vorkommen. Obwohl dieses Medium für eine Reihe von Zellen verwendet werden kann, besteht sein größter Nachteil darin, dass ihm möglicherweise genau die Komponenten fehlen, die von bestimmten Zellen benötigt werden, was die Reproduzierbarkeit stark beeinträchtigen kann.

Künstliche Medien – Künstliche Medien werden auch als synthetische Medien bezeichnet und beziehen sich auf die Art von Medien, die durch Zugabe von Nährstoffen wie Vitaminen, Gasen (Sauerstoff und Kohlendioxid) und Proteinen hergestellt werden. Diese organischen und anorganischen Nährstoffe werden zugesetzt, um den spezifischen Bedürfnissen bestimmter Zellen gerecht zu werden und so ein ideales Umfeld für ihr Wachstum zu schaffen.

Als solche können sie für eine Reihe von Zwecken verwendet werden, darunter:

• Sofortiges Überleben der Zellen
• Verlängertes Überleben der Zellen
• Unbegrenztes Wachstum der Zellen
• Spezialisierte Funktionen

Auf der anderen Seite kann die Kultur wie folgt kategorisiert werden:

Selektive Medien- Dies ist eine besondere Art von Medien, auf denen nur bestimmte Zellen wachsen können. Zum Beispiel kann Blutagar (zur Isolierung von Streptococcus & Moraxella-Arten) durch Zugabe von Antibiotika in ein selektives Medium umgewandelt werden.

Differenzielle Medien- Diese Art von Medien ermöglicht das Wachstum verschiedener Arten von Zellen/Mikroorganismen in Abhängigkeit von ihrem Stoffwechsel.

Wie oben erwähnt, werden verschiedene Arten von synthetischen Medien so hergestellt, dass sie die ideale Umgebung für die Vermehrung bestimmter Zellen bieten. Aus diesem Grund können synthetische Medien in vier Hauptkategorien eingeteilt werden.

Dazu gehören:

Serumhaltige Medien – Bei diesen Medien wird Serum (fötales Rinderserum) als Träger für Nährstoffe und Wachstumsfaktoren verwendet, die in der Regel wasserunlöslich sind.

Serumfreie Medien – Diese Medien werden in der Regel zur Unterstützung einzelner Zelltypen hergestellt und liefern bestimmte Nährstoffe und andere Faktoren, die der Zelltyp benötigt. In diesen Medien fehlt das Serum, da es einige Nachteile mit sich bringt und zu einer Fehlinterpretation der immunologischen Ergebnisse führen kann.

Chemisch definierte Medien – Wie der Name schon sagt, besteht diese Art von Medien aus kontaminationsfreien reinen organischen und anorganischen Bestandteilen. Die Bestandteile dieses Medientyps werden in der Regel gentechnisch in Bakterien/Hefen erzeugt.

Proteinfreie Medien – Proteinfreie Medien enthalten in der Regel keine Proteine. Sie werden weitgehend verwendet, um ein besseres Wachstum der Zellen sowie die Proteinexpression zu fördern und die Aufreinigung der exprimierten Produkte zu erleichtern.

Zu den wichtigsten Bestandteilen von Zellkulturmedien gehören:

• Nährstoffe – bereitgestellt durch Peptide und Aminosäuren, die die Bausteine der Proteine sind
• Kohlenhydrate zur Energiegewinnung
• Wesentliche Mineralien wie Kalzium, Magnesium, Phosphate und Eisen sowie Puffermittel wie Acetate zur Stabilisierung der Kulturmedien
• Vitamine
• PH-Veränderungsindikatoren wie Phenolrot

Zellkulturmedien werden für die Vermehrung von Zellen verwendet, die dann identifiziert und untersucht werden können. Als solche können sie für verschiedene Zwecke verwendet werden, unter anderem für Bildung, Diagnose und Behandlung einer Krankheit.

Zellsuspension

In Kulturmethoden bezieht sich Zellsuspension auf eine Art von Kultur, bei der Zellen in einem flüssigen Medium suspendiert werden.

Um einzelne Zellen zu erhalten, wird ein brüchiger Kallus (kleines Gewebe, das leicht auseinanderfällt) in ein bewegtes flüssiges Medium gegeben (Bewegung ermöglicht im Gegensatz zu einem festen Medium einen Gasaustausch), wodurch er aufgebrochen wird. Auf diese Weise können einzelne Zellen freigesetzt werden, die dann in ein anderes, frisches Medium überführt werden.

Zellsuspensionskulturen haben gegenüber den stationären Kulturen den großen Vorteil, dass die Zellen gleichmäßig umspült werden können. Da das Medium in der Regel aufgewühlt wird, ist eine Belüftung des Mediums möglich, wodurch die Zellen mit Gasen versorgt werden. Da es sich bei dem Medium um eine Suspension handelt, lässt sich der Inhalt der Kultur auch leicht manipulieren.

Wie jede andere Kultur muss auch die Suspensionszellkultur unter kontrollierten Bedingungen stattfinden, die den Zellen eine ideale Umgebung für ihre Vermehrung bieten. Sobald sie eine Konfluenz von etwa 80 Prozent erreicht haben, ist es an der Zeit, eine Subkultur anzulegen, um ein kontinuierliches Wachstum zu gewährleisten.

* Die 80-prozentige Konfluenz bezieht sich auf den Zustand, bei dem 80 Prozent der Kulturoberfläche mit den wachsenden Zellen bedeckt sind.

In einigen Fällen können die Zellen in Suspension an der Kunststoffoberfläche des Kulturkolbens haften oder sogar Klumpen bilden. In solchen Fällen kann eine Pipette verwendet werden, um diese Zellen zu entnehmen und sie auf die Oberfläche des Kolbens und damit von der Kunststoffoberfläche zu vertreiben. Dies hilft, einzelne Zellen zu erhalten, da sie nicht an der Kunststoffoberfläche haften.

Suspension roter Blutkörperchen

• (links: ohne Hämolyse) Suspension roter Blutkörperchen (0,5% Schafserythrozyten in Kochsalzlösung), erscheint rot und undurchsichtig.
• (Mitte: ohne Hämolyse) Die Erythrozyten sedimentieren spontan für 60 Minuten. Man beachte, dass der Überstand nicht gefärbt ist.
• (rechts: Hämolyse) Erythrozytensuspension, die mit dem Hämolysin von S. pyogenes bei 37C für 30 min behandelt wurde, wird durch Hämolyse transparent.

Siehe mehr über rote Blutkörperchen

Zählen von Zellen

Die Anzahl der Zellen in einer Suspension zu zählen, ist ein Prozess, der die Verwendung einer Färbung erfordert. Wenn beispielsweise Trypanblau verwendet wird, durchdringt es die Zellmembran der toten Zellen, aber nicht die der lebenden Zellen.

Die Zellen werden dann vorsichtig in ein Hämozytometer (das die Zählkammer enthält) unter dem Deckglas ausgestoßen und unter dem Mikroskop beobachtet. Die Zellen werden dann innerhalb einer bestimmten Anzahl von Quadraten für die Berechnungen gezählt.

Bedeutung

Diese Methode wird weitgehend bevorzugt, da die Zellen in einer Lösung suspendiert werden können, anstatt in einem festen Medium gehalten zu werden. Hier ist es daher einfacher, den Inhalt zu manipulieren und zu verhindern, dass er sich verklumpt. Mit Zellsuspensionen ist es auch einfacher, einzelne Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten.

In diesem Fall ist es nicht nur möglich, die Struktur der Zellen zu untersuchen, sondern auch zu beobachten, wie gut sie sich differenziert haben; tote und lebende Zellen werden unter dem Mikroskop betrachtet.

Zellkulturprotokoll

Zellkulturprotokolle sollen sicherstellen, dass die Kulturverfahren nach den erforderlichen Standards durchgeführt werden. Damit soll nicht nur die Kontamination der Zellen verhindert werden, sondern auch sichergestellt werden, dass die Forscher selbst vor jeglicher Form der Kontamination geschützt sind.

Darüber hinaus wird erwartet, dass die Art der Arbeit den entsprechenden ethischen Richtlinien entspricht. Daher muss vor allem sichergestellt werden, dass das gesamte Verfahren sowohl mit den medizinisch-ethischen als auch mit den tierexperimentellen Richtlinien übereinstimmt. Denn Verstöße gegen diese Gesetze und Richtlinien können schwere Strafen und sogar die Schließung des Labors nach sich ziehen.

Vor Beginn der Arbeiten ist folgendes Verfahren durchzuführen:

• Sicherstellen, dass der Arbeitsbereich desinfiziert ist (mit 70 % Ethanol)
• Immer ein neues Paar Handschuhe verwenden. Wenn ein Paar Handschuhe für ein anderes Zellkulturverfahren verwendet werden muss, sollten sie mit 70-prozentigem Ethanol desinfiziert werden und an der Luft trocknen können.
• Alle Geräte, die aus dem Schrank genommen wurden, sollten ebenfalls desinfiziert werden, um eine Kontamination zu verhindern
• Solche Geräte wie Pipetten, Glasgefäße und Kunststoffe, die für das Verfahren verwendet werden sollen, sollten autoklaviert werden

Obwohl es eine große Auswahl an Kulturmedien für Zellen gibt, ist es wichtig zu bedenken, dass Zellkulturen und insbesondere primäre Zellkulturen leicht kontaminiert werden können und das Risiko besteht, dass sie unentdeckte Viren enthalten. Aus diesem Grund sollte das gesamte Material als potentiell infektiös behandelt werden, um Infektionen zu vermeiden.

Außerdem sollte die Arbeit an Zellkulturen aus Sicherheitsgründen in einer geeigneten Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, in der die Luft vom Forscher weggeleitet wird.

Protokolle für die Vorbereitung von Zellkulturen

Überprüfen Sie immer die Angaben auf dem Behälter, um sicherzustellen, dass das Medium für die zu kultivierenden Zellen geeignet ist,

nach der Vorbereitung,

Nach der Zubereitung sollte die Zellkultur im empfohlenen Temperaturbereich gehalten werden,

Überwachen Sie die Kultur alle 30 bis 48 Stunden und prüfen Sie die Konfluenz (wenn die Zellen die Oberfläche der Kultur vollständig bedecken) – dies hängt jedoch weitgehend von der Art der Zellen ab.

Nach Beendigung des Verfahrens und der Analyse der Zellen sollte die Kultur in geeigneter Weise verworfen werden. Hier ist große Vorsicht geboten, denn zu diesem Zeitpunkt haben sich die Zellen bereits vermehrt und ihre Anzahl erhöht. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass die Probe verunreinigt wurde, was bei unsachgemäßer Handhabung das Risiko von Infektionen für den Forscher erhöht.

Entsorgung

• Bei Gegenständen wie Skalpellen, Objektträgern und Deckgläsern kann die Dekontamination durch Autoklavieren bei 121 Grad Celsius und 15 psi (Druck) für mindestens 30 Minuten erfolgen. Wenn sie jedoch entsorgt werden sollen, ist es wichtig, dass sie in einen Plastikbeutel und in den entsprechenden Behälter gegeben werden, um später verbrannt zu werden.
• Bei flüssigen Abfällen ist die chemische Desinfektion eine der besten Methoden, um das Abfallprodukt zu inaktivieren. Zu diesem Zweck können Chemikalien wie Bleichmittel verwendet werden, bevor die Flüssigkeit in den Abfluss des Waschbeckens gegossen wird.
• Feste Abfälle werden zur Verbrennung in einem Plastiksack gesammelt. Andererseits können sie zunächst autoklaviert werden, bevor sie verbrannt werden.

Schlussfolgerung

Im Allgemeinen beinhaltet die Zellkultur, unabhängig davon, ob sie eine Suspension oder ein stationäres Medium verwendet, das Wachstum von Zellen in einer künstlichen Umgebung mit günstigen Bedingungen. Während enzymatische Maßnahmen zur Gewinnung von Zellen für die Kultur verwendet werden können, wird die mechanische Zerlegung am meisten bevorzugt, da sie eine einfachere und weniger traumatische Methode zur Gewinnung von Zellen darstellt.

Bei dieser Methode wird ein Gewebe einfach in kleinere Stücke geschnitten, aus denen dann die austretenden Zellen gesammelt werden. Auch die Technik der Primärexplantate kann zur Gewinnung der Zellen verwendet werden. Diese Methode eignet sich jedoch vor allem für die Aufspaltung kleinerer Gewebemengen.

Während alle Zellen in Kulturen verwendet werden können, um ihr Verhalten zu beobachten, wird embryonales Gewebe (für Primärzellen) im Vergleich zu adulten Zellen bevorzugt, da es lebensfähigere Zellen liefert, die sich schnell vermehren können.

Hier ist es auch wichtig sicherzustellen, dass die Zellen in größerer Menge vorhanden sind, da ihre Überlebensrate im Vergleich zu den Subkulturen tendenziell geringer ist. I

Um den Erfolg der Kulturen zu steigern, ist es außerdem wichtig, dass die Zellen sowohl bei der Entnahme als auch bei der Verarbeitung so wenig wie möglich beschädigt werden. Dazu gehört auch die Verwendung eines geeigneten Mediums für die betreffenden Zellen.

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Siehe auch Mikroskopiekultur und Empfindlichkeitsprüfung

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