Der Limulus-Amebozyten-Lysat-Test (LAL) ist eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung bakterieller Endotoxine, die in der pharmazeutischen und biotechnologischen Industrie weit verbreitet ist. Das biochemische Prinzip des Tests basiert auf der Gerinnungsreaktion der Hämolymphe des Limulus polyphemus, allgemein bekannt als Atlantische Hufeisenkrabbe, in Gegenwart von Antigenen mit mikrobieller Oberfläche, wie Lipopolysacchariden oder bakteriellen Endotoxinen.

Das Unternehmen „Wako Chemicals“ gehört zu den Unternehmen, die LAL-Reagenzien auf internationaler Ebene herstellen, da es eine einzigartige Formel für ein LAL-Reagenz entwickelt hat, das spezifisch für bakterielle Endotoxine ist, ohne dass Beta-Glucane in den Proben stören, dank des Zusatzes von carboximethyliertem Curdlan (CMC), das mit LAL koliophilisiert wurde. Unter der Marke PYROSTAR™ produziert und vertreibt dieses Vertriebsunternehmen für Forschungsreagenzien LAL-Reagenzien und -Zubehör, die alle von der FDA in den USA festgelegten Normen, Vorschriften und Qualitätsstandards erfüllen.

Wir werden nun über die verschiedenen Reagenzien und Zubehörteile sprechen, mit denen Wako zur Untersuchung von bakteriellen Endotoxinen beiträgt:

Zunächst haben wir das Limulus PS Simple Test Kit, das den Nachweis und die Quantifizierung von Endotoxinen ohne die Interferenz anderer koexistierender Substanzen durch die Verwendung eines Affinitätsadsorptionsmittels für Endotoxine namens Pyrosep™ ermöglicht. Mit dieser Methode können wir das Endotoxin in einer lipophilen Probe messen, sofern diese in Ethanol gelöst werden kann, wie z. B. fettlösliche Vitamine, Öle und Fette, Albumine usw., die normalerweise nicht mit einem herkömmlichen Limulus-Test gemessen werden können. Außerdem wird kein LAL-Reagenz verschwendet, da es einzeln in den Fläschchen des einfachen Tests aufgetragen wird und in genau der Menge verwendet werden kann, die für die Messung benötigt wird.

Die PYROSTAR™ ES-F-Serie ist eine einzigartige Formulierung, die carboximethyliertes Curdlan (CMC) enthält, das mit LAL kolophiliert wurde, um die Interferenz mit β-Glucanen zu beseitigen. Der von Wako entwickelte ES-Puffer enthält hohe CMC-Konzentrationen, die zu einem endotoxinspezifischen LAL-Reagenz werden. Dieses Reagenz ist sowohl für den qualitativen Nachweis von Endotoxinen durch die Gel-Klumpen-Methode als auch für ihren quantitativen Nachweis durch die kinetisch-turbidimetrische Methode (KTA) vorgesehen. Zur Messung der Geschwindigkeit der Trübungsänderung wird ein von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. entwickeltes photometrisches Instrument namens Toxinometer® verwendet. Die Kits PYROSTAR™ ES-F sind mit und ohne Standardkontroll-Endotoxin (SCE) erhältlich: ein lyophilisiertes Reagenz, das aus E.coli gewonnen wird und zur Bestätigung der Empfindlichkeit des LAL-Reagenzes, zur Validierung der Produkttestmethoden und zur Vorbereitung von Hemmungskontrollen verwendet wird.

Zur Unterstützung dieser Reagenzien entwickelt Wako außerdem eine Endotoxin-Extraktionslösung, mit der Endotoxine von Oberflächen extrahiert werden können, auf denen sie mit Wasser oder Salz nicht extrahiert werden können. Seine Verwendung wird für Endotoxinproben auf Geräten und Vorrichtungen empfohlen, die mit blut- oder proteinhaltigen Flüssigkeiten in Berührung kommen könnten.

Toxinometer® ET-6000 ist ein computergestütztes kinetisches Inkubationslesegerät, das drei Testmethoden umfassen kann: Gel-Klumpen, KTA und KCA (kinetischer chromogener Test). Dieses Gerät ermöglicht es uns, Gel-Klotz- und KTA-Ergebnisse von derselben Probe zu erhalten. Es misst gleichzeitig bis zu 16 Proben mit einem Kontaminationsrisiko, das viel geringer ist als bei der Mikroplatte, und ermöglicht die Archivierung der Standardkurven. Toximaster® QC7 ist die Software, die alle Funktionen für die Datenverarbeitung und Berichtserstellung für den LAL-Test mit dem Toxinometer® ET-6000 bereitstellt.

Außerdem finden sich unter dem Zubehör aus den LAL-Katalogen von Wako auch Reagenzgläser mit und ohne Aluminiumdeckel. Diese Röhrchen werden endotoxinfrei hergestellt, bestehen aus Borosilikatglas und sind für die Gel-Klotz-Methode ausgelegt. Die Glasstärke kann speziell auf das Toxinometer kalibriert werden, um eine stabile Lichtintensität und Durchlässigkeit zu gewährleisten.

Ein weiteres LAL-Reagenz, das von Wako vertrieben wird, ist das KY Color Limulus Kit. Dieses Reagenz wurde für die KCA-Methode entwickelt und kann sowohl im kinetischen Reader als auch in einem Mikroplatten-Reader verwendet werden. Es umfasst ein Multitest-Kit und ein einfaches Test-Kit, die jeweils für eine kolorimetrische Analyse auf Zeitbasis konzipiert sind und ein synthetisches Substrat verwenden, das eine gelbe Farbe erzeugt und das Endotoxin mit hoher Empfindlichkeit spezifisch nachweisen kann.

Bibliographie:

1) Iwanaga, S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, Dezember (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Auszug 44 (1994), 21st Annual Meeting of the Society for Antibacterial and Antifungal Agents.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discrimination between endotoxin and (1-3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

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