Neues Immunmikrolinsen-Imaging zum Nachweis von Antigen und Antikörper

Abstract

Der Nachweis und die Analyse der Antigen-Antikörper-Reaktion ist eine der wichtigsten Nachweistechniken in den Bereichen Medizin, Biologie, Umweltwissenschaften und Lebensmittelsicherheit. Herkömmliche und klassische Methoden zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern stoßen auf viele Probleme, wie z. B. Zeitaufwand, hohe Kosten und geringe Genauigkeit. Ein neuartiges bildgebendes Verfahren für Immunmikrosphären mit Hilfe von Mikrolinsen wird verwendet, um die Änderungen des Brechungsindex vor und nach der Antigen-Antikörper-Reaktion zu testen. Sie ermöglicht eine schnelle qualitative und quantitative Bestimmung der Antigen-Antikörper-Reaktion ohne Markierung, Vormodifizierung, Nachwaschung und teure Enzyme. In diesem Artikel werden das Prinzip und die Vorteile, die Struktur eines Mikrolinsen-Immunoassay-Instruments und das Potenzial für die Messung klinischer Proben vorgestellt und diskutiert. Es ist vielversprechend für die Anwendung bei der Diagnose von klinischen Krankheiten zu entwickeln.

1. Einleitung

Zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern stehen heutzutage folgende Techniken zur Verfügung: Enzymimmunoassay (ELISA), Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), Radioimmunoassay (RIA), kolloidaler Goldimmunchromatographietest (GICT), indirekter Immunfluoreszenztest (IFA), Chemilumineszenzimmunoassay (CLIA) und partikelverstärkter turbidimetrischer Immunoassay (PETIA). ELISA kombiniert die Verstärkung der enzymkatalysierten Reaktion und die spezifische Reaktion von Antigen und Antikörper mit hoher Genauigkeit und geringen Kosten, aber die Verfahren sind kompliziert und erfordern eine strenge Kontrolle der Bedingungen. SPR wurde in den 1990er Jahren entwickelt, um die Wechselwirkung zwischen Biomolekülen und anderen Molekülen nachzuweisen, und es erfordert keine Markierung und kann das Ergebnis schnell erhalten, aber seine Ausrüstung ist teuer und benötigt ein großes Probenvolumen. Der RIA zeichnet sich durch eine hohe Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit aus und benötigt nur ein geringes Probenvolumen. Sie wird häufig für den Nachweis von Proteinen, Enzymen und anderen Molekülen verwendet, aber das Radionuklid ist gesundheitsschädlich und verändert auch die biologischen Aktivitäten der Proben, was zu experimentellen Fehlern führt. Als eine neue Art von Immunoassay-Technik und eine der gängigsten Methoden zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern ist GICT leicht, einfach und schnell und kostengünstig, aber die Probengröße ist begrenzt und die Empfindlichkeit gering. CLIA, IFA und PETIA werden ebenfalls häufig für den Nachweis von Antigenen und Antikörpern verwendet. Ihre gemeinsamen Vorteile sind hohe Genauigkeit, Stabilität, Einfachheit und Schnelligkeit, aber hohe Kosten und ein großes Probenvolumen.

Eine immunologische Mikrolinsen-Bildgebungstechnik zur Prüfung der Änderung des Brechungsindexes kann die Einschränkungen der oben genannten Methoden überwinden. Sie ist schnell, empfindlich, einfach, umweltfreundlich und kostengünstig und wird voraussichtlich in vielen medizinischen Einrichtungen eingesetzt werden. Diese Technik besteht aus einer parallelen Lichtbestrahlung, einer hochauflösenden Kamera, einer intelligenten Analysesoftware, einem Autofokus und einem Temperaturkontrollsystem mit einer Multiwell-Mikrolinsen-Probentestplatte und kann eine Multipass-Detektion von Antigen und Antikörper erreichen. Das hochauflösende Kamerasystem kann die Anforderungen der Mikrolinsenabbildung erfüllen, und die Verwendung von Temperaturregler, Autofokus und automatischen intelligenten Analysesystemen kann die Fehler bei Experimenten für genaue Messungen erheblich reduzieren.

2. Prinzip des Mikrolinsen-Immunoassays

Mikrolinsen sind zylindrische Linsen mit einer sphärischen Oberfläche an einem Ende und einer ebenen Oberfläche am anderen Ende. Sie hat einen starken Verstärkungseffekt und verbessert die Abbildungsleistung eines herkömmlichen optischen Mikroskops erheblich. Wenn eine Mikrolinse mit einem Radius von und einem Brechungsindex (RI) von in eine Lösung von () getaucht und mit flachem Licht beleuchtet wird, ist ihr Bild aufgrund der Brechungswirkung rund mit einem dunklen Ring am Rand. Die Beziehung zwischen dem Radius des hellen Flecks im Bild und anderen Parametern wie , , , und der Zylinderhöhe der Mikrolinse wird wie folgt dargestellt: wobei der Einfallswinkel des Lichts auf die Kugeloberfläche der Mikrolinse und ist. Auf der Grundlage dieser Formel können die momentanen Änderungen des Mediums durch Messung des Radius des hellen Flecks in der Abbildung und des Radius der Mikrolinse bestimmt werden. Da die optische Brechung mit Lichtgeschwindigkeit erfolgt, kann jede momentane RI-Änderung im umgebenden Medium einer Mikrolinse sofort eine Änderung des Radius des zentralen hellen Flecks bewirken. Daher kann die Methode die sofortige RI/Konzentrationsänderung mit einer Hochgeschwindigkeitskamera für die Bildgebung überwachen (Abbildung 1).

(a)
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)

(a)
(a)(b)
(b)(c)
(c)(d)
(d)(e)
(e)(f)
(f)

Abbildung 1
Abbildung von Immunmikrokügelchen in verschiedenen Lösungen durch die Mikrolinse. (a) Grundprinzip der Abbildung von Immunmikrosphären. Bilder einer Mikrolinse werden in Wasser mit der Wellenlänge 532 nm bei 25°C (b), in Wasser mit der Wellenlänge 532 nm bei 37°C (c), in Wasser mit der Wellenlänge 633 nm bei 25°C (d), in Ethanol mit der Wellenlänge 532 nm bei 25°C (e) bzw. in Serum mit der Wellenlänge 633 nm bei 37°C (f) gezeigt.

3. Aufbau und Funktionen eines Mikrolinsen-Immunoassay-Instruments

Wie in Abbildung 2 dargestellt, bilden eine parallele Lichtquelle, eine hochauflösende Bildgebung, eine automatische intelligente Analyse, Autofokus- und Temperaturkontrollsysteme sowie eine Multiwell-Mikrolinsen-Testplatte ein Mikrosphären-Immunoassay-Instrument. Wenn die parallele Lichtquelle paralleles Licht auf die Mikrolinsen abgibt, erhält das hochauflösende Autofokus-Bildgebungssystem innerhalb von Millisekunden ein scharfes Bild. Anschließend wird das Bild der Immunmikrosphären von der intelligenten Analysesoftware ausgewertet, um die Werte von und sowie die Konzentration von Antigen/Antikörper abzuleiten. Das Temperaturkontrollsystem dient dazu, die für die verschiedenen Antigen-Antikörper-Reaktionen erforderlichen Temperaturen einzustellen. Der gesamte Prozess dauert nicht länger als 2 Minuten.

Abbildung 2
Aufbau eines Mikrolinsen-Immunoassay-Instruments. Es umfasst parallele Lichtbestrahlung, Autofokus, hochauflösende Bildgebung, intelligente Analysesoftware, Temperaturkontrollsysteme und eine Multiwell-Mikrolinsen-Testplatte.

3.1. Paralleles Lichtbestrahlungssystem

LED als parallele Lichtquelle erzeugt einen zylindrischen parallelen Beleuchtungsbereich, der einem ursprünglichen Kondensor ähnelt und die Vorteile niedriger Kosten, langer Lebensdauer, perfekter Lichtleistung und geringer Größe aufweist. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kann aufgrund der Brechung der Linse tatsächlich paralleles Licht empfangen werden. Im Bestrahlungsbereich der LED kann die Linse die Richtung und die Verteilung des Lichts ändern, indem die entsprechende Linse so konfiguriert wird, dass das tatsächliche parallele Licht erhalten wird (Abbildung 3).

Abbildung 3
Prinzip des parallelen Lichtbestrahlungssystems. Die Linse 1 und die Linse 2 fokussieren das von der LED emittierte Licht. Dann wird das fokussierte Licht durch einen optischen Tunnel und eine Blende auf die Linse 3 projiziert. Schließlich wird das eigentliche parallele Licht von der Linse erfasst.

3.2. Hochauflösendes Autofokus-Bildgebungssystem

Dieses System besteht aus einer Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera und einem Autofokussystem. Die Abbildungsgeschwindigkeit einiger handelsüblicher Digitalkameras liegt derzeit bei über 10.000 Bildern pro Sekunde. Daher kann das hochauflösende Bildgebungssystem die dynamischen Veränderungen des RI in der Lösung in Echtzeit überwachen. Eine hochauflösende CCD-Kamera spielt eine wichtige Rolle bei der Erzielung einer hochauflösenden Mikrolinsenabbildung. Das Kernstück des Autofokussystems besteht aus Teilen zur Bilderkennung, Bildverarbeitung und Steuerung. Die vom Kamerasystem aufgenommenen Bilder werden analysiert und die Klarheit des Bildes wird bewertet. Entsprechend dieser Bewertung wird das System automatisch in einen geeigneten Bereich oder eine Richtung gesteuert, bis die Auflösung der erfassten Bilder die vorgegebene Anforderung erfüllt.

3.3. Automatisches intelligentes Bilderkennungs- und Analysesystem

Das automatische intelligente Analysesystem führt hauptsächlich Bilderkennung und Datenanalyse auf dem Mikrolinsenbild durch, um die augenblickliche Veränderung des Bildes zu überwachen und dadurch die Änderung des Brechungsindexes der Probenlösung während des Antigen-Antikörper-Reaktionsprozesses abzuleiten. Die Genauigkeit des Verfahrens hängt eng mit der Bildqualität zusammen, und Parameter wie Pixel, Pixelgröße und Auflösung wirken sich direkt auf die Messung des RI aus. Bei Verwendung einer CCD-Digitalkamera mit ≥10 Millionen Pixeln und einer kleinen Pixelgröße von weniger als 3 nm sowie einer Mikrolinse mit einem Radius von 600 μm wird die Änderung des Brechungsindexes durch Änderungen des Verhältnisses zwischen dem hellen Fleck in der Mitte und dem Radius des äußeren Rings bestimmt, so dass die gemessene Änderung des Brechungsindexes 10-6 erreichen kann.

3.4. Temperaturkontrollsystem

Das Temperaturkontrollsystem besteht aus einer transparenten Hartglasplatte mit einem dünnen Film aus Indium-Zinn-Oxid und wird durch einen hochpräzisen PID-Temperaturregler (proportional-integral-derivativ) gesteuert. Es ermöglicht, dass die Temperatur der Probe in der Multiwell-Mikrolinsen-Testplatte innerhalb von 2 Minuten einen bestimmten Wert erreicht und innerhalb eines Änderungsbereichs von 0,1°C gehalten wird, um eine effektive Antigen-Antikörper-Reaktion zu ermöglichen.

3.5. Mikrolinsen-Testplatte

Eine Multiwell-Mikrolinsenplatte ist speziell für ein Mikrolinsen-Immunoassay-Gerät konzipiert. Sie besteht aus Polymethylmethacrylat (PMMA) und wird in der Regel mit 2 oder 16 trapezförmigen Vertiefungen hergestellt, um unterschiedlichen Nachweisanforderungen gerecht zu werden. In jeder Vertiefung befindet sich am Boden eine Mikrolinse mit einem Radius von mehreren hundert Mikrometern. Durch die Verwendung der Mikrolinsenplatte wird eine objektive Bedingung für die Mehrkanaldetektion geschaffen. Da der Durchmesser der Muldenunterseite nur etwa 2 mm beträgt, reichen einige Mikroliter Probenlösung aus, um die Mikrolinse für die Antigen-Antikörper-Detektion zu benetzen.

4. Anwendung des Immune Microsphere Imaging System

4.1. Messung der Antigen-Antikörper-Reaktion

Huang und seine Kollegen wiesen verschiedene Arten von Antigen-Antikörper-Reaktionen nach und fanden deren regelmäßige Merkmale heraus. Erstens änderte sich der Brechungsindex während der Antigen-Antikörper-Reaktion mit der Reaktionszeit. Zweitens gab es drei Phasen bei der Veränderung des RI mit der Reaktionszeit, darunter schnell ansteigende, relativ stabile und langsam abfallende Phasen. Die erste Phase stand im Zusammenhang mit der Kombination von Ag und Ab, so dass der RI mit der schnellen Kombination von Ag und Ab zur Bildung von Komplexen plötzlich anstieg. Das Maximum des RI liegt in der zweiten Phase. Drittens hatte die Konzentration von Ag oder Ab einen großen Einfluss auf den RI. Indem die RI-Änderung als Funktion der Ag- oder Ab-Konzentration ermittelt wird, kann ihr Gehalt in den untersuchten Proben durch eine Anpassungskurve berechnet werden. Viertens würden auch unterschiedliche Antikörper, wie z. B. Capture Ab und Probing Ab, die Variation des RI beeinflussen. Bei Anwendung dieser Technik zur Messung von Antigen-Antikörper-Reaktionen durch verschiedene Ag-Ab-Systeme wurden die Beziehungen zwischen der Änderung des Brechungsindex und den Konzentrationen verschiedener Arten von Antigen-Antikörper-Lösungen (Interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, (Interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, Plazenta alkalische Phosphatase (PAP) Ag-Ab, Kallikrein 6 (KLK6) Ag-Ab, humanes Choriongonadotropin (HCG) Ag-Ab, kardiales Troponin (cTnI) Ag-Ab, Fettsäurebindende Proteine (FABP) Ag-Ab und C-reaktives Protein (CRP) Ag-Ab Lösungen) konnten ermittelt werden (Abbildung 4). Da wir wissen, dass die Assoziation und Dissoziation des Antigen-Antikörper-Komplexes ein dynamischer Prozess ist, wurde auf der Grundlage der Kurve RI vs. Zeit Zeit und der Berechnung der Ableitung nach der Zeit kann man auch Informationen über die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten (Abbildung 4(a)) und andere thermodynamische Parameter erhalten, indem man die folgende Gleichung verwendet:

(a)
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)

(a)
(a)(b)
(b)(c)
(c)

Abbildung 4
Brechungsindexänderungen bei Antigen-Antikörper-Reaktionen. (a) Beziehungen zwischen dem Brechungsindex der IFN-γ- oder PAP-Antigen-Antikörper-Reaktion und ihrer Zeit. (b) Beziehungen zwischen und KLK6- bzw. CRP-Antigenkonzentrationen wurden bestimmt, wenn das monoklonale Ab oder das polyklonale Ab zum entsprechenden Antigen hinzugefügt wurde. (c) Die Beziehungen zwischen den und HCG- und cTnI- bzw. FABP-Antigenkonzentrationen wurden analysiert, wenn das entsprechende Antigen mit seinem Capture-AB oder Sondierungs-AB versetzt wurde. Ag: Antigen; Ab: Antikörper; : Änderung des Brechungsindex; IFN-γ: Interferon-γ; PAP: alkalische Phosphatase der Plazenta; KLK6: Kallikrein 6; HCG: humanes Choriongonadotropin; cTnI: kardiales Troponin; FABP: Fettsäurebindende Proteine; CRP: C-reaktives Protein.

4.2. Messung klinischer Proben

Die Immunmikrosphären-Imaging-Technik wurde weiterhin zur Untersuchung klinischer Proben eingesetzt. 36 klinische Proben wurden auf diese Weise auf ihre CRP-Ag-Konzentration untersucht. Die relative Standardabweichung liegt bei etwa 2-10 % im Vergleich zur Immunochromatographie, und der Korrelationskoeffizient zwischen den auf beiden Wegen gewonnenen Ergebnissen erreicht einen Wert von 0,989 (Abbildung 5). Es ist bekannt, dass klinisch hämolysierte Serumproben die Genauigkeit der mit den herkömmlichen Methoden ermittelten Ergebnisse stark beeinträchtigen können. Im Gegensatz dazu sind die Bilder der Mikrolinsen in hämolysierten Proben mit dieser Technik immer noch klar. Die relativen Fehler zwischen den ermittelten Antigenwerten in den Proben mit Hämolyse und denen ohne Hämolyse betragen nur etwa 2 %, was auf den geringeren Einfluss der hämolysierten Serumproben auf die Genauigkeit der Ergebnisse hinweist.

Abbildung 5
Messung von 36 klinischen Proben auf das C-reaktive Protein-Antigen unter Verwendung der Immunmikrolinsen-Bildgebung im Vergleich zur Immunochromatographie.

5. Machbarkeit des Immunmikrosphären-Imaging für den Antigen- und Antikörpernachweis

Die meisten Antigene sind Proteine, einige wenige sind Polysaccharide, Nukleinsäuren und andere Substanzen, und alle Antikörper sind Proteine. Da das Protein eine große Menge an Amido- und Carboxylgruppen enthält, bewirken diese polaren Gruppen, dass die kolloidalen Teilchen aufgrund der elektrostatischen Wirkung eine elektrische Ladung erzeugen, und die Teilchen mit der gleichen Ladung werden voneinander abgestoßen. Gleichzeitig reagieren die polaren Gruppen, die stark hydrophil sind, mit Wassermolekülen und bilden eine Hydratationsschicht, um ein hydrophiles Kolloid zu erzeugen, das sicherstellt, dass das Protein nicht zu einem Präzipitat agglomeriert, so dass die kolloidalen Teilchen gleichmäßig in einer Lösung dispergiert sind.

Wenn Antigen mit Antikörper kombiniert wird, verringert sich oder verschwindet die elektrische Ladung der kolloidalen Teilchen, und die Hydratationsschicht verschwindet ebenfalls oder wird dünn. Das Protein verwandelt sich von einem hydrophilen in ein hydrophobes Kolloid. In der Elektrolytumgebung agglomerieren die kolloidalen Partikel weiter und bilden die Antigen-Antikörper-Komplexe, die von den Augen wahrgenommen werden können. Die Brechungsindizes des hydrophilen und des hydrophoben Kolloids sind sehr unterschiedlich. Daher können mit dieser Technik dynamische Änderungen des Brechungsindexes überwacht werden, um zu beurteilen, ob in einer Lösung Antigen-Antikörper-Reaktionen stattfinden. Anhand der Beziehung zwischen Antigen- und Antikörperkonzentration und ihrer Reaktionszeit kann eine Standardkurve erstellt werden. Der Komplex wird mit dem Verlauf der Antigen-Antikörper-Reaktion größer, und die Änderung des Brechungsindexes wird ebenfalls deutlicher. Anhand der Standardkurve lässt sich die Konzentration des nachgewiesenen Antikörpers oder Antigens leicht quantifizieren.

Es wurde nachgewiesen, dass ein Antikörper, der zu Epitopen verschiedener Antigene komplementär ist, bei der Ag-Ab-Reaktion mit dem bildgebenden Mikrolinsen-Immunoassay tatsächlich einen ähnlichen RI-Anstieg hervorruft. Wie in den Abbildungen 4(b) und 4(c) dargestellt, wurden Antigenmessungen mit Capture-AB und Probing-AB oder monoklonalem Ab und polyklonalem Ab für ein bestimmtes Antigen durchgeführt. Aus den Kurven ist ersichtlich, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Arten von Antikörpern bei der Induzierung von Veränderungen während der Ag-Ab-Reaktion gab, was darauf hindeutet, dass der bildgebende Mikrolinsen-Immunoassay verschiedene Arten von Antikörpern verwenden kann, entweder Capture oder Probing Ab und monoklonale oder polyklonale Ab für die Detektion. Dennoch werden monoklonale Ab für den Microlens-Imaging-Immunoassay bevorzugt, da sie durch ihre höhere Affinität zum Antigen nicht nur eine stärkere Reaktion hervorrufen, sondern auch die Möglichkeit einer falsch-positiven Kreuzreaktion verringern, so dass Antigene bei niedrigeren Konzentrationen nachgewiesen werden können. Insgesamt ist eine Kreuzreaktion bei dieser Technik theoretisch unvermeidlich, wie auch bei anderen Mitteln des Immunoassays. Mit anderen Worten, die Spezifität des Immunmikrolinsen-Imaging hängt vollständig von derjenigen der ausgewählten Antikörper gegen das Zielantigen ab. Daher ist es sehr wichtig, geeignete Antikörper auszusuchen und das Ag/Ab-Reaktionssystem zu optimieren.

6. Schlussfolgerungen

Dieses Immunmikrolinsen-Imaging-Verfahren kann schnell und genau den RI verschiedener Proben messen und Echtzeitveränderungen des RI im Prozess der Antigen- und Antikörperreaktion überwachen. Der RI ändert sich mit der Konzentration des Ag oder Ab. Anhand der RI-Änderung in Abhängigkeit von der Ag- oder Ab-Konzentration kann der Inhalt der Proben qualitativ und quantitativ berechnet werden, ohne dass eine Markierung, Vormodifizierung, Nachwaschung oder teure Enzyme erforderlich sind. Im Vergleich zu herkömmlichen Nachweismethoden hat diese Methode den Vorteil, dass sie genau, zuverlässig, schnell (innerhalb weniger Minuten) und einfach ist und keine Verschmutzung verursacht. Außerdem liegt die Nachweisgrenze bei nur pg/ml, so dass nur einige μl für den Nachweis erforderlich sind. Sie eignet sich auch für hämolysierte klinische Proben, die mit herkömmlichen Methoden nur schwer nachzuweisen sind. Darüber hinaus werden die Proben nicht beeinträchtigt. Das Mikrosphären-Immunoassay-Instrument besteht aus einem parallelen Lichtbestrahlungssystem, einem hochauflösenden Kamerasystem, einem automatischen intelligenten Analysesystem, einem Autofokussystem, einem Temperaturkontrollsystem und einer porösen Mikrolinsen-Detektionsplatte. Es ist klein und leicht zu transportieren.

Es ist bekannt, dass die Antigen-Antikörper-Reaktion stark von ihrer eigenen Konzentration, der Temperatur, dem pH-Wert und der Elektrolytlösung beeinflusst wird. Aus diesem Grund werden diese Faktoren im Mikrolinsen-Bildgebungssystem berücksichtigt, um die Daten durch Ausgleich ihrer Veränderungen stabil zu halten. Dieses System kann beispielsweise durch die Auswahl geeigneter Materialien für eine Testplatte, die eine Antigen-Antikörper-Reaktionsstelle bietet, und durch eine hydrophile Beschaffenheit der Platte zur Vermeidung hydrophober Störungen optimiert werden. Die Nachweisgenauigkeit kann durch Anpassung des Antigen-Antikörper-Verhältnisses, Auswahl geeigneter Verdünnungsmittel, Modifizierung mit Metallionen usw. weiter verbessert werden.

Der Nachweis von Antigenen und Antikörpern ist in den Bereichen biomedizinische Untersuchung, klinische Diagnose, Arzneimittelanalyse, Lebensmittelsicherheit und Umweltüberwachung relativ wichtig. Mit der Sorge der Menschen um die Gesundheit der Umwelt, die Lebensmittelsicherheit und das Gesundheitswesen ist die Entwicklung eines empfindlichen Instruments mit geringen Kosten, hoher Genauigkeit, geringer Größe, Tragbarkeit und einfacher Bedienung zu einem dringenden gesellschaftlichen Bedürfnis geworden. Daher ist diese immunologische Mikrolinsen-Bildgebungstechnik vielversprechend für eine breite Anwendung in verschiedenen Bereichen und eignet sich besonders für die Verbreitung in der Gemeinde und auf dem Land.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieses Artikels gibt.

Beiträge der Autoren

Jiahui Liang und Xiaotian Ye haben zu gleichen Teilen zu dieser Arbeit beigetragen.

Danksagung

Wir danken dem Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (Zuschussnummer: 201604020146) und der National Natural Science Foundation of China (Zuschussnummern: 81172824 und 30971465) für ihre finanzielle Unterstützung.