HypaCas9 und Cas9-HF1 zeigen langsame beobachtete Spaltraten

Wir beginnen unsere kinetischen Analysen mit der Messung der Konzentration der aktiven Stelle des Enzyms für jede der Cas9-Varianten23,24,25. Die Messung der Produktmenge, die in einer Titration des Enzyms mit ansteigenden DNA-Konzentrationen gebildet wurde, ergab Aktivitätskonzentrationen von 31 nM, 26 nM bzw. 23 nM für SpCas9, HypaCas9 und Cas9-HF1 für Enzymproben mit einer Nennkonzentration von 100 nM, basierend auf der Absorption bei 280 nm (ergänzende Abb. 1a-d). Wir haben auch die Konzentrationen der aktiven Zentren von SpCas9 und HiFiCas925 von Integrated DNA Technologies (IDT) gemessen und ähnliche Konzentrationen an aktivem Enzym festgestellt (ergänzende Abb. 1e-f). Wichtig ist, dass in jedem Fall die für die Sättigung des Signals erforderliche DNA-Konzentration gleich der Konzentration des gebildeten Produkts war, was die Befürchtung ausräumt, dass ein Teil des Enzyms DNA binden, aber nicht reagieren könnte. Alle nachfolgenden Experimente wurden unter Verwendung der bei der Titration der aktiven Stelle ermittelten Konzentration des aktiven Enzyms durchgeführt.

Um die Kinetik der On- oder Off-Target-DNA-Substrate von SpCas9 mit den gentechnisch veränderten Varianten zu vergleichen, untersuchten wir zunächst den Zeitverlauf der Spaltung des Zielstrangs (HNH) für jedes Enzym (Abb. 1 und ergänzende Abb. 2). Die Daten wurden entweder mit einer Einfach- oder Doppelexponentialfunktion unter Verwendung von Gl. (1) bzw. Gl. (2) angepasst.

wobei Y für die Konzentration des Spaltprodukts, A1 für die Amplitude und λ1 für die beobachtete Zerfallsrate (Eigenwert)17 steht.

wobei Y die Konzentration des Spaltprodukts, A1 die Amplitude und λ1 die beobachtete Rate für die erste Phase darstellt. A2 steht für die Amplitude und λ2 für die beobachtete Rate für die zweite Phase.

Der Vergleich der beobachteten Spaltungsabfallraten von On- und Off-Target-Substraten durch SpCas9 zeigt, dass die 3 bp PAM-distale Fehlpaarung das Enzym um das 13-fache verlangsamt (von 1 s-1 auf 0,076 s-1). Beide High-Fidelity-Cas9-Varianten verringern die beobachtete Zerfallsrate für die Spaltung von On-Target-DNA-Substraten im Vergleich zu SpCas9 um das 21- bis 35-fache (0,028 s-1 für HypaCas9 und 0,047 s-1 für Cas9-HF1 gegenüber 1 s-1 für SpCas9). Darüber hinaus reduzieren HypaCas9 und Cas9-HF1 die Zerfallsraten der Off-Target-DNA-Spaltung um das 8- bis 290-fache (Raten von 0,0033 s-1 bzw. 0,00016 s-1) im Vergleich zu ihren jeweiligen Raten mit On-Target-DNA. Diese Daten zeigen dramatische Veränderungen in den beobachteten Spaltraten der manipulierten Varianten mit On- und Off-Target-DNA. Diese Messungen allein definieren jedoch keine Veränderungen in der Spezifität, die eine Funktion der kinetischen Aufteilung der DNA-Spaltung gegenüber der Dissoziation ist und alle Schritte umfasst, die zum ersten irreversiblen Schritt im Signalweg17 führen, einschließlich der reversiblen DNA-Bindung, der R-Schleifenbildung, des Andockens der HNH-Domäne und der DNA-Spaltung.

Die DNA-Abspulung ist bei den Cas9-Varianten weitgehend unverändert

Da unsere frühere Arbeit die R-Loop-Bildung als ratenlimitierend für die On-Target-Spaltung identifiziert hat und andere daraufhin angedeutet haben, dass die R-Loop-Bildungs- und Rückspulraten die Enzymspezifität für SpCas9 und Cas9-HF116 diktieren könnten, haben wir getestet, ob HypaCas9 eine ähnliche Kinetik aufweisen würde. Um die R-Loop-Bildungsraten für alle Enzyme direkt zu messen, verwendeten wir einen Stop-Flow-Assay, der auf der Messung der Fluoreszenz von tCo bei -16 nt basiert, einem fluoreszierenden trizyklischen Cytosin-Analogon, das durch Basenstapelung in dsDNA gelöscht wird, so dass die Öffnung des Duplexes zu einem starken Anstieg der Fluoreszenz führt. Unsere Kontrollexperimente mit unseren tCo- und 2-AP-markierten Basenanalog-Substraten an den Positionen -16, -9 bzw. -1 nt (ergänzende Abb. 3) zeigen, dass keines der Analoga die beobachtete Abklingrate der DNA-Spaltung beeinflusst. Die chemischen Strukturen von tCo und 2AP sind viel weniger sperrig als die größeren Cy3- und Cy5-Markierungen und stören die Enzymkinetik weniger (ergänzende Abb. 4). In Gegenwart von Mg2+ wickeln SpCas9, HypaCas9 und Cas9-HF1 das Ziel-DNA-Substrat mit nahezu identischen Abklingraten (~2 s-1) ab (Abb. 2). Überraschenderweise war die Abklingrate der R-Schleifenbildung für Off-Target-DNA-Substrate für alle Cas9-Varianten ebenfalls weitgehend unverändert (zwischen 0,85 s-1 und 2,59 s-1). Daher ist die DNA-Abspulung nicht ratenlimitierend und korreliert nicht mit den beobachteten Spaltraten für die High-Fidelity-Varianten, im Gegensatz zu SpCas9.

Die Abklingraten der Schleifenbildung wurden durch Beobachtung des Fluoreszenzanstiegs von tCo (Position -16 im Nicht-Target-Strang) als Funktion der Zeit nach dem Mischen von Enzym (28 nM) mit DNA (10 nM) in Gegenwart von 10 mM Mg2+ gemessen. Die Daten wurden an eine Doppelexponentialfunktion angepasst, um die gezeigten Abklingraten zu erhalten. a, b SpCas9 (28 nm) mit On-Target (a) und Off-Target (b) DNA, c, d HypaCas9 mit On-Target (c) und Off-Target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 mit on-target (e) und off-target (f) DNA.

Angesichts der Lage des tCo bei -16 nt ist es wahrscheinlich, dass unsere Messungen einen späten Schritt im Abwicklungsprozess widerspiegeln. Zum Vergleich haben wir die Abklingrate für die R-Schleifenbildung mit tCo gemessen, das an einer Position unmittelbar proximal der PAM (Position -1 nt) markiert war. Nach schnellem Mischen der Cas9-RNA mit dem On-Target-DNA-Substrat beobachteten wir einen deutlichen Anstieg der Fluoreszenz, wenn die DNA das tCo-Basenanalogon abspult. Wir haben die Daten an ein Doppelexponential angepasst, um die Hauptabklingrate von 10 s-1 zu bestimmen (Abb. 3a-f). Interessanterweise deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass, sobald eine PAM-Stelle mit dem Enzym verbunden ist, die anfängliche Entfaltung der DNA schneller erfolgt als bei -16 nt beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass die bei -16 nt beobachtete Netto-Abklingrate der Entfaltung eine Funktion mehrerer schneller Entfaltungsschritte sein könnte, die zur vollständigen Entfaltung führen. Da jedoch keine Verzögerung in der Kinetik beobachtet wurde, scheint es, dass die schnelleren, früheren Teilabwicklungsschritte zu einem letzten geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt der vollständigen Abwicklung führen, der an der Position -16 nt gemessen wurde. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, um die Auswirkungen von Fehlanpassungen in früheren Abwicklungsphasen zu untersuchen, liefert unsere aktuelle Messung die beste Schätzung der Nettorate der R-Schleifenbildung. Die mit dieser Markierung gemessene Abklingrate für die R-Schleifenbildung ist sowohl für SpCas9 als auch für die High-Fidelity-Varianten bei allen getesteten Substraten ununterscheidbar, so dass die Raten für die DNA-Entfaltung durch die manipulierten Cas9-Enzyme unverändert zu sein scheinen.

Die Abklingraten der Schleifenbildung wurden durch Beobachtung des Fluoreszenzanstiegs von tCo (Position -1 im Nicht-Zielstrang) als Funktion der Zeit nach dem Mischen von Enzym (28 nM) mit DNA (10 nM) in Gegenwart von 10 mM Mg2+ gemessen. Die Daten wurden an eine doppelte Exponentialfunktion angepasst, um die dargestellten Abklingraten zu erhalten. a, b SpCas9 (28 nm) mit On-Target- (a) und Off-Target-DNA (b), c, d HypaCas9 mit On-Target- (c) und Off-Target-DNA (d). e, f Cas9-HF1 mit On-Target- (e) und Off-Target-DNA (f). g Cartoon der HNH-Domänenumlagerung. h Das mit Cy3 und Cy5 markierte FRETSpCas9-Paar an C867 bzw. C355 wurde zur Messung der Bewegung der HNH-Domäne während der Spaltung von On-Target-Substraten verwendet.

Um die Raten der R-Loop-Bildung mit den Schritten zu korrelieren, die beim Andocken der HNH-Domäne an den Zielstrang involviert sind, haben wir die Konformationsänderung des Enzyms mit Hilfe der Stop-Flow-Analyse an einem Cas9 gemessen, das wie zuvor beschrieben mit Cy3 und Cy5 markiert war18. Kurz gesagt, eine Cystein-light-Version von Cas9 wurde mit Cy3 an Aminosäure 355 und Cy5 an Aminosäure 867 markiert. Die FRET-Effizienz steigt, wenn sich die HNH-Domäne in den katalytisch aktiven Zustand umlagert (Abb. 3g). Nach schnellem Mischen des FRET-Paar-markierten Cas9 mit einer perfekt angepassten On-Target-DNA beobachteten wir einen Anstieg der FRET-Effizienz, was darauf hindeutet, dass die HNH-Domäne in einen katalytisch aktiven Zustand übergeht. Die von uns gemessene Abklingrate für das Andocken der HNH-Domäne beträgt ~2,5 s-1 (Abb. 3h), was mit den Einzelmolekül-FRET-Messungen vergleichbar ist. Überraschenderweise sind die beobachteten Raten für die Bildung der R-Schleife (1,5 s-1) und das Andocken der HNH-Domäne sehr ähnlich, was darauf hindeutet, dass diese Schritte kinetisch miteinander verbunden sein könnten. Die etwas schnellere beobachtete Abklingrate für die Bewegung der HNH-Domäne könnte auf die umgekehrte Reaktion zurückzuführen sein, da die Domänenbewegung nach oder gleichzeitig mit der Bildung der R-Schleife ins Gleichgewicht kommt.

Die Abklingraten der DNA-Entfaltung wurden auch mit Einzelmolekülmethoden unter Verwendung einer mit FRET-Paaren markierten DNA gemessen, wobei Cy3 und Cy5 an der Position -6 nt des Zielstrangs bzw. -16 nt des Nicht-Zielstrangs markiert wurden16. Daher testeten wir auch die FRET-gepaarten DNA-Substrate, um zu versuchen, das FRET-Signal mit den beobachteten Raten der DNA-Spaltung zu korrelieren. Zunächst testeten wir das zuvor in Einzelmolekülstudien verwendete Substrat ohne die Cy3/Cy5-Markierungen16, das sich durch zwei Nukleotide von unserem Substrat unterscheidet, nämlich durch eine T-Substitution an den Positionen -16 und -18. Die Abklingrate der Spaltung des Zielstrangs (HNH) ist ähnlich wie die unseres Substrats (0,7 s-1 vs. 1 s-1, ergänzende Abb. 5a), so dass der Sequenzkontext an dieser Position keinen wesentlichen Einfluss hat. Wir testeten auch die Spaltung mit Cy3/Cy5-markierter DNA mit dieser anderen Sequenz, und sie zeigte eine ähnliche Abbaugeschwindigkeit wie unsere Sequenz (0,05 s-1 vs. 0,06 s-1, ergänzende Abb. 5b und 6a). Später untersuchten wir den Zeitverlauf der Spaltung des Zielstrangs (HNH) der Cy3/Cy5-markierten DNA mit unserer Sequenz für jedes Enzym (ergänzende Abb. 6). Bei SpCas9 folgt die Reaktion der Cy3/Cy5-markierten DNA einem einfachen Exponentialverlauf mit einer deutlich reduzierten Abklingrate (0,06 s-1 vs. 1 s-1), was eine ~17-fache Verringerung der beobachteten Abklingrate für die DNA-Spaltung im Vergleich zu unmarkiertem Substrat bedeutet. Die manipulierten HypaCas9 und Cas9-HF1 wiesen ebenfalls verringerte DNA-Spaltraten von 0,0046 s-1 bzw. 0,0016 s-1 auf, was 5,9- bzw. 28,75-mal langsamer ist als unmarkierte Substrate, die unter identischen Bedingungen gemessen wurden. Es ist klar, dass die Interferenz durch die Cy3/Cy5-Markierungen die Wirkung der High-Fidelity-Varianten auf die DNA-Spaltraten verändert. Insgesamt hat die Markierung der DNA mit sperrigen Cy3- und Cy5-Markern das Enzym dramatisch beeinträchtigt. Aus diesen Gründen wurden keine weiteren Studien mit der FRET-Paar-markierten DNA durchgeführt.

Cas9-Spezifität wird durch kinetische Partitionierung bestimmt

Da die Enzymspezifität eine Funktion aller Schritte ist, die zum ersten weitgehend irreversiblen Schritt führen, müssen alle Ereignisse vor der DNA-Spaltung berücksichtigt werden17. Um die intrinsische Spaltungsrate zu messen, haben wir den normalerweise ratenbegrenzenden Schritt der R-Schleifenbildung umgangen, indem wir SpCas9 mit Off-Target-DNA in Abwesenheit von Mg2+ vorinkubiert haben, damit die Bindung und die Konformationsänderungen ins Gleichgewicht kommen können, um einen SpCas9-DNA-Komplex zu bilden. Anschließend haben wir die chemische Reaktion durch Zugabe von 10 mM Mg2+ eingeleitet. In unseren früheren Studien war die Bildung der R-Schleife geschwindigkeitsbegrenzend, wenn SpCas9 mit On-Target-DNA reagierte, und die intrinsische Spaltungsabklingrate war schneller, wenn sie mit dem Vorinkubationsprotokoll gemessen wurde. Hier, mit Off-Target-DNA, wurden die Raten der HNH- und RuvC-Spaltung mit 0,12 s-1 bzw. 0,14 s-1 gemessen (ergänzende Abb. 7c, d und ergänzende Abb. 8), die viel langsamer sind als die R-Loop-Bildungsraten. Interessanterweise zeigen diese Ergebnisse, dass der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt im Enzymweg von SpCas9 mit einem Off-Target die DNA-Spaltung ist, da die von uns gemessene Zerfallsrate für die R-Schleifenbildung 0,85 s-1 betrug (Abb. 2b). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Unterscheidung zumindest teilweise auf einer Änderung der Identität des geschwindigkeitsbegrenzenden Schritts beim Vergleich von On- und Off-Target-DNA beruht.

Wir wiederholten diese Experimente mit HypaCas9 und Cas9-HF1 mit On- oder Off-Target-DNA. Diese Ergebnisse definieren beobachtete Raten für die HNH-Spaltung von 0,035 s-1 und 0,0023 s-1 für HypaCas9 mit On- und Off-Target-Substraten (ergänzende Abb. 7g, k). Die beobachteten Spaltraten von Cas9-HF1 für On- und Off-Target-Substrate wurden mit 0,038 s-1 bzw. 0,00014 s-1 gemessen (ergänzende Abb. 7o, q). Diese beobachteten Spaltraten sind etwas schneller als die bei gleichzeitiger Zugabe von DNA und Mg2+ gemessenen, was darauf hindeutet, dass ein anderer Schritt als die Bildung der R-Schleife, der der DNA-Spaltung vorausgeht, die beobachtete Abklingrate verlangsamen kann. Nichtsdestotrotz zeigen diese Ergebnisse, dass die beobachteten Spaltraten für On-Target-DNA sowohl für HypaCas9 als auch für Cas9-HF1 im Vergleich zu SpCas9 um das 100-fache reduziert sind. Bei Off-Target-DNA sind die beobachteten Spaltraten für HypaCas9 bzw. Cas9-HF1 im Vergleich zu SpCas9 um das 50- bzw. 860-fache reduziert.

Die Unterscheidung wird nicht nur durch die relativen Spaltraten der DNA definiert. Da die Bildung der R-Schleife schnell erfolgt, ist die Unterscheidung vielmehr eine Funktion der kinetischen Aufteilung zwischen den Raten der DNA-Freisetzung und der DNA-Spaltung17,26,27. Um die kinetische Aufteilung zu quantifizieren, haben wir das Enzym und die markierte DNA in Abwesenheit von Mg2+ inkubiert, was die Bildung der R-Schleife ins Gleichgewicht bringt, aber die Katalyse verhindert15. Anschließend fügten wir Mg2+ hinzu, um die Reaktion in Gegenwart eines großen Überschusses an identischer, nicht markierter On-Target-DNA zu starten, die als Falle diente. Der Vergleich zwischen parallelen Experimenten, die in Anwesenheit und Abwesenheit der DNA-Falle durchgeführt wurden, liefert eine Schätzung für die fraktionelle kinetische Aufteilung für die Dissoziation gegenüber der Spaltung der gebundenen DNA (Abb. 4a). Sobald SpCas9 an die On-Target-DNA gebunden war, wurde es schnell gespalten, und die DNA-Falle hatte kaum Auswirkungen (Abb. 4b). Im Gegensatz dazu lösten sich 33 % der Off-Target-DNA vom Enzym, während etwa 67 % der DNA der Spaltung unterzogen wurden (Abb. 4c und ergänzende Abb. 9a). Diese Ergebnisse zeigen, dass SpCas9 die PAM-distale fehlangepasste DNA diskriminiert, indem es die Spaltgeschwindigkeit verringert, was den Anteil der DNA erhöht, der freigesetzt und nicht gespalten wird. Der Effekt ist jedoch gering, so dass die Dissoziationsrate langsamer zu sein scheint als die Spaltung.

a Schematische Darstellung des DNA-Fallen-Experiments. b, c SpCas9-Spaltung von On-Target (aus Gong et al.15) (b) oder off-target (c) DNA. d, e HypaCas9-Spaltung von on-target (d) oder off-target (e) DNA. f, g Cas9-HF1-Spaltung von on-target (f) oder off-target (g) DNA. Enzym (28 nM) und markierte DNA (10 nM) wurden in Abwesenheit von Mg2+ inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von Mg2+ in Gegenwart oder Abwesenheit eines Überschusses an unmarkierter DNA-Falle gestartet. A- und A◦ stellen die Amplitude mit (gefüllte Kreise) bzw. ohne Falle (offene Kreise) dar. Der Prozentsatz gibt den Anteil der vorgebundenen DNA an, der im Vergleich zur Reaktion in Abwesenheit der Falle zur Spaltung übergeht.

Als Nächstes untersuchten wir die kinetische Aufteilung für HypaCas9 und Cas9-HF1, die an On-Target-DNA gebunden sind (Abb. 4d, f, ergänzende Abb. 9b, d). Unsere Ergebnisse mit HypaCas9 und Cas9-HF1 zeigen, dass ~75 % bzw. ~92 % der On-Target-DNA in Gegenwart der Falle gespalten wurden. Dieser Prozentsatz ist geringer als bei Wildtyp-SpCas9, da die beobachtete intrinsische Abbaugeschwindigkeit für On-Target-DNA durch HypaCas9 (0,035 s-1) und Cas9-HF1 (0,038 s-1) 100-mal langsamer war als bei SpCas9 (4,3 s-1). Diese langsamere Spaltrate gibt einem kleinen Teil (8 bis 25 %) der On-Target-DNA Zeit, zu dissoziieren, bevor sie gespalten wird.

Die kinetische Verteilung zugunsten der Dissoziation wurde verstärkt, wenn HypaCas9 und Cas9-HF1 mit Off-Target-DNA reagieren, da die Spaltraten weiter auf 0,0023 s-1 bzw. 0,00014 s-1 reduziert wurden (Abb. 4e, g, ergänzende Abb. 9c, e). Diese Raten sind 50- bzw. 860-mal langsamer als die von SpCas9 auf einem Off-Target-Substrat. Dementsprechend wurden nur ~24 % bzw. ~10 % der gebundenen Off-Target-DNA für die Spaltung durch HypaCas9 bzw. Cas9-HF1 in Gegenwart von Trap-DNA verwendet. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die konstruierten High-Fidelity-Varianten eine verbesserte Spezifität gegen die PAM-distale mismatched DNA durch eine deutlich verringerte Rate der Spaltung, die kinetische Partitionierung zu Gunsten der Freisetzung als Spaltung des gebundenen Substrats für beide on- und off-target DNA verändert, aber der Effekt ist größer für off-target DNA erworben. Die Berechnung der scheinbaren Dissoziationsratenkonstanten unter Verwendung von Gleichung (3) zeigt, dass die High-Fidelity-Varianten die scheinbare Rate der DNA-Freisetzung nicht erhöhen (ergänzende Tabelle 1).

Es ist vielmehr so, dass die erhöhte Diskriminierung vollständig auf die Verringerung der scheinbaren Geschwindigkeitskonstante für die Spaltung zurückzuführen ist.

In unseren bisherigen Beschreibungen der Kinetik von Cas9-Enzymen wurden die beobachteten Abklingraten von Reaktionen auf der Grundlage der Anpassung von Daten an Exponentialfunktionen geschätzt, die Eigenwerte ergeben, die in der Regel komplexe Funktionen mehrerer Geschwindigkeitskonstanten sind17. Um die Kinetik und den Mechanismus vollständig zu verstehen, wurden alle Experimente für jedes Enzym und jedes DNA-Substrat auf der Grundlage einer numerischen Integration der Ratengleichungen unter Verwendung eines einzigen, einheitlichen Modells global angepasst (Abb. 5 und ergänzende Abbildungen 10-14). Die globale Datenanpassung zeigt, dass unser Minimalmodell (Abb. 5f, Einschub) unsere Daten berücksichtigt und dass jede der Geschwindigkeitskonstanten gut definiert ist, basierend auf einer Vertrauenskonturanalyse, die prüft, inwieweit die einzelnen Parameter durch die Daten eingeschränkt sind (Abb. 6)17,28. Beachten Sie insbesondere, dass unser Modell die in einigen Experimenten beobachteten biphasischen Verläufe berücksichtigt, ohne dass Heterogenität geltend gemacht werden muss, und dass es intrinsische Geschwindigkeitskonstanten für jeden Schritt im Signalweg liefert, einschließlich der Bildung der R-Schleife und der HNH- und RuvC-Spaltungsereignisse. Obwohl es wahrscheinlich ist, dass zusätzliche, noch nicht aufgeklärte strukturelle Umlagerungen für die Ausrichtung der katalytischen Reste für die DNA-Spaltung erforderlich sind, wurden diese noch nicht als kinetisch unterschiedliche Ereignisse aufgeklärt. Das derzeitige Modell stellt einen minimalen Weg dar, der notwendig und ausreichend ist, um alle verfügbaren Daten zu berücksichtigen, und kann leicht erweitert werden, wenn neue Informationen zur Verfügung stehen, um zusätzliche Schritte im Weg zu definieren.

a DNA- und Mg2+-initiierte Spaltung durch die HNH-Domäne. b DNA- und Mg2+-initiierte Spaltung durch die RuvC-Domäne. c R-Schleifenbildungsrate. d Mg2+-initiierte Spaltung durch die HNH-Domäne. e Mg2+-initiierte Spaltung durch die RuvC-Domäne. f Auswirkung der DNA-Falle auf die kinetische Aufteilung der Cas9-Spaltung. Alle Kurven wurden auf der Grundlage der globalen Anpassung an die Daten gemäß dem kinetischen Modell (Inset) berechnet, wobei die Geschwindigkeitskonstanten in Tabelle 1 aufgeführt sind. Die Fehlerschätzungen basierten auf der Analyse der Vertrauenskontur, wie in Abb. 6 gezeigt. E ist Cas9.gRNA, D ist Ziel-DNA, ED ist Cas9.gRNA.DNA, EDH ist R-Schleifenbildung mit Andocken des Zielstrangs an HNH, EDHR und EDP1R sind R-Schleifenbildung mit Andocken des Nicht-Zielstrangs an RuvC, EDHP2 ist RuvC-Spaltung des Nicht-Zielstrangs, EDP1 ist HNH-Spaltung des Zielstrangs, EDP1P2 ist Spaltung beider Stränge, Dtrap ist überschüssige unmarkierte, perfekt angepasste DNA. EDtrap ist Cas9.gRNA.DNAtrap.

Konfidenzkonturen sind für die Anpassungsdaten in Abb. 5 dargestellt. Die nummerierten Geschwindigkeitskonstanten sind in unserem kinetischen Modell definiert (Abb. 5f, Inset). Der χ2-Schwellenwert (gestrichelte Linie) wurde auf 0,99 gesetzt, um obere und untere Grenzen für jede Geschwindigkeitskonstante zu definieren, wie beschrieben17,32. Da die Konturen symmetrisch und die Parameter gut eingegrenzt waren, geben wir in Tabelle 1 ± Fehlergrenzen an. Für diese Analyse wurde ein χ2-Schwellenwert unter Verwendung einer F-Verteilung berechnet und zur Festlegung der unteren und oberen Grenzen für jeden Parameter verwendet.

Um die Enzymspezifität zu verstehen, müssen die Geschwindigkeitskonstanten im Kontext aller kinetisch relevanten Schritte interpretiert werden, wie im Profil der freien Energie (berechnet unter Verwendung von Gl. (4) aus den Geschwindigkeitskonstanten in Tabelle 1).

Der Transmissionskoeffizient A = 0,001

Da die globale Datenanpassung die Geschwindigkeitskonstanten für jeden relevanten Schritt liefert (Abb. 5 und 6), können wir ein echtes Profil der freien Energie konstruieren (Abb. 7b und ergänzende Abb. 10-14). Die Profile der freien Energie beim Vergleich von SpCas9, HypaCas9 und Cas9-HF1 zeigen eine Änderung der geschwindigkeitslimitierenden und spezifitätsbestimmenden Schritte. Die Enzymspezifität wird durch kcat/Km definiert und ist durch die höchste Gesamtbarriere im Vergleich zum Ausgangszustand gegeben, während die maximale Rate, kcat, durch die höchste lokale Barriere im Vergleich zum vorhergehenden Zustand definiert ist, abgeschwächt durch alle vorangehenden Schritte des schnellen Gleichgewichts. Da sich die Geschwindigkeitskonstanten für die Bildung der R-Schleife bei verschiedenen Substraten und Enzymvarianten nicht signifikant ändern, wird die Spezifität weitgehend durch die kinetische Aufteilung der Cas9-R-Schleife, dem EDH-Zustand in unserem kinetischen Modell (Abb. 5f, Inset), bestimmt, die entweder zu einer irreversiblen Spaltung oder zu einer Freisetzung durch erneutes Annealing der DNA und Ausstoß aus dem Enzym führt. Die höheren Gesamtbarrieren für die Spaltung, die bei den High-Fidelity-Varianten zu beobachten sind, erhöhen die kinetische Verteilungswahrscheinlichkeit zugunsten der Dissoziation der DNA (Abb. 6c).

a Cartoon-Darstellung des Reaktionswegs der Cas9-Enzyme. b Profile der freien Energie für die SpCas9-Spaltung eines On-Target (graue Linie) von Gong et al.15 bzw. Off-Target (rote Linie); HypaCas9-Spaltung eines Off-Targets (blaue Linie); und Cas9-HF1-Spaltung eines Off-Targets (schwarze Linie). Jedes Profil wurde mit Hilfe der Übergangszustandstheorie unter Verwendung von Raten- und Gleichgewichtskonstanten berechnet, die aus der globalen Anpassung der einzelnen Experimente abgeleitet wurden (Tabelle 1). Beachten Sie, dass die höheren Barrieren für die DNA-Spaltung im Vergleich zu den niedrigeren Barrieren für die vorangehende Umkehrreaktion die Wahrscheinlichkeit der DNA-Freisetzung erhöhen. c Zusammenfassendes Balkendiagramm für k2, k3 und die kinetische Aufteilung (P).