Studiendesign

In dieser zweiarmigen, doppelblinden, randomisierten Studie werden wir 60 schwangere Frauen im Alter von 19 bis 42 Jahren aus Vancouver, BC, Kanada, rekrutieren. Die Teilnehmerinnen werden randomisiert und erhalten 16 Wochen lang täglich entweder 0,6 mg/Tag Folsäure oder eine äquimolare Dosis (0,625 mg/Tag) (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure (Abb. 2). Die Dosis von 0,6 mg entspricht den Werten, die in führenden kommerziellen pränatalen Vitaminmarken (Materna®) gefunden wurden, was die Verallgemeinerbarkeit unserer Ergebnisse erhöht. Die 16-wöchige Intervention basiert auf der geschätzten Halbwertszeit von Folat in den Erythrozyten und soll die Messung des langfristigen Folatstatus in den Erythrozyten (nach 12-16 Wochen) ermöglichen. Alle Teilnehmerinnen erhalten außerdem ein pränatales Multivitaminpräparat, das kein Folat enthält, um die ausreichende Versorgung mit anderen Nährstoffen (z. B. Eisen) während der Schwangerschaft sicherzustellen. Venöse Nüchternblutproben werden zu Beginn und am Ende der Studie entnommen, um die primären Ergebnisgrößen zu messen, darunter Serumfolat, RBC-Folat und Plasma-UMFA; zu den explorativen Messgrößen gehören Plasma-S-Adenosyl-Methionin, S-Adenosyl-Homocystein, Gesamthomocystein, Gesamtcystein, Methionin, Vitamin B12, Pyridoxal-5-phosphat, freies Cholin und Betain. Außerdem wird eine Genotypisierung der MTHFR- (677 C > T, rs1801133, und 1298 A > C, rs1801131) und DHFR-Varianten (rs1643649 und rs70991108) vorgenommen und ein vollständiges Blutbild erstellt. Die Frauen haben die Möglichkeit, die Studie in der postpartalen (explorativen) Phase fortzusetzen, in der sie bei der Enduntersuchung weitere Nahrungsergänzungsmittel erhalten, die sie bis etwa 1 Woche nach der Geburt einnehmen können. An den Tagen 5-7 nach der Geburt werden die Frauen eine kleine (3 ml) Muttermilchprobe und eine nicht nüchterne venöse Blutprobe abgeben. Zu den Ergebnissen, die in der Muttermilch untersucht werden, gehören die Folatformen (UMFA, THF, 5-Methyl-THF, 5-Formyl-THF und 5,10-Methenyl-THF) und das FBP der Milch. Zu den Ergebnissen, die in der Blutprobe nach der Geburt untersucht werden, gehören Folat in den roten Blutkörperchen und UMFA im Plasma. Das Studienprotokoll wurde in Übereinstimmung mit den 2013 Standard Protocol Items entwickelt: Recommendation for Interventional Trials (SPIRIT)-Richtlinien entwickelt (Abb. 3). Weitere Einzelheiten finden Sie in Additional file 1 (SPIRIT Checklist).

Teilnehmerflussdiagramm

Standard Protocol Items: Recommendation for Interventional Trials (SPIRIT) schedule of enrollment, interventions and assessments

Das primäre Ziel dieser Pilotstudie ist es, Schätzungen für die Veränderung von Serumfolat, RBC-Folat und UMFA nach einer Supplementierung mit (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure und Folsäure über 16 Schwangerschaftswochen zu erhalten, um das Design einer angemessenen endgültigen Studie zu informieren. Das sekundäre Ziel besteht darin, die Rekrutierungs- und Teilnahmeraten zu ermitteln, um die Planung und Durchführbarkeit einer endgültigen Studie zu unterstützen. Die explorativen Ziele der postpartalen Phase sind die Quantifizierung des Anteils des Gesamtfolats in der Muttermilch als Folsäure in jeder Gruppe, die Bewertung der Korrelation zwischen mütterlichem Plasma-UMFA und Folsäure in der Muttermilch nach der Geburt und die Bewertung der Folatkonzentrationen in den roten Blutkörperchen nach der Entbindung in jeder Gruppe.

Teilnehmer, Rekrutierung und informierte Zustimmung

Einschlusskriterien: (1) schwangere Frau (Einlingsschwangerschaft); (2) wohnhaft im Großraum Vancouver; (3) ≤ 21 Schwangerschaftswochen zum Zeitpunkt der Einwilligung; (4) 19-42 Jahre alt; und (5) in der Lage, eine informierte Einwilligung zu geben.

Ausschlusskriterien: (1) Vorbestehende Erkrankungen, von denen bekannt ist, dass sie den mütterlichen Folatstatus beeinflussen (malabsorptive und entzündliche Darmerkrankungen, aktive Zöliakie, Magenbypass-Operation, atrophische Gastritis, Epilepsie, fortgeschrittene Lebererkrankung, Nierendialyse, Diabetes mellitus Typ 1 oder 2, Sichelzellenanämie); (2) Lebensstilfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie sich auf den mütterlichen Folatstatus auswirken (aktuelles Rauchen, Alkoholkonsum, Freizeitdrogenkonsum) ; (3) mittleres bis hohes Risiko für die Entwicklung einer Schwangerschaft mit einer NTD (gilt für Frauen oder ihren männlichen Partner: persönliche oder familiäre Vorgeschichte (Eltern oder Geschwister) anderer folatempfindlicher kongenitaler Anomalien, persönliche NTD-Vorgeschichte oder eine frühere NTD-beeinträchtigte Schwangerschaft) ; (4) Medikamente, von denen bekannt ist, dass sie den B-Vitamin-Stoffwechsel beeinträchtigen (Chloramphenicol, Methotrexat, Metformin, Sulfasalazin, Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Triamteren, Barbiturate); (5) Body-Mass-Index (BMI) vor der Schwangerschaft ≥ 30 kg/m2; oder (6) Allergie gegen einen der Inhaltsstoffe der Studienergänzung.

Stichprobenumfang

Der Stichprobenumfang wurde auf der Grundlage des primären Ziels berechnet, die Verteilung (Mittelwert ± Standardabweichung) der Veränderung der primären Ergebnisse (Serumfolat, RBC-Folat und UMFA) nach 16 Wochen Supplementierung zu schätzen. Um dies zu erreichen, benötigen wir 50 Frauen (25 in jeder Gruppe); eine Stichprobe von mindestens n = 50 gilt allgemein als angemessen für Pilotstudien in der klinischen Forschung. Ein Aufschlag von 20 % wird hinzugerechnet, um Teilnehmerinnen zu berücksichtigen, die die Studie abbrechen oder nicht weiterverfolgen, so dass insgesamt 60 Frauen (30 in jeder Gruppe) rekrutiert werden.

Rekrutierung

Plakate werden im BC Women’s Hospital, in medizinischen und pränatalen Kliniken und in Einzelhandelsgeschäften für schwangere Frauen (z. B. Pränatalkurse, Fitnessstudios, Geschäfte für Umstandskleidung) in ganz Vancouver, BC, Kanada, ausgehängt. Die Einzelheiten der Studie werden dem Personal und den Fachleuten des Gesundheitswesens, einschließlich Ärzten, Hebammen, Krankenschwestern und ggf. anderen, mitgeteilt. Werbung in sozialen Medien (Facebook und Instagram) wird eingesetzt und richtet sich an schwangere Frauen im Alter von 19 bis 42 Jahren im Großraum Vancouver, BC.

Einholung der informierten Zustimmung und Bestätigung der Teilnahmeberechtigung

Frauen, die an einer Teilnahme interessiert sind, wenden sich direkt an den Forschungskoordinator (KMC). Zu diesem Zeitpunkt werden die Einzelheiten der Studie, die Teilnahmeberechtigung und die informierte Zustimmung erläutert. Geeignete Teilnehmerinnen, die an der Studie teilnehmen möchten, erhalten eine Studien-ID, und es wird ein Termin für die Erstuntersuchung vereinbart. Die Teilnehmerinnen werden angewiesen, ihre derzeitige pränatale Multivitamin-/Folat-Ergänzung bis zu ihrem Baseline-Besuch fortzusetzen. Die optionale postpartale Phase der Studie wird in der Einverständniserklärung beschrieben; Teilnehmerinnen, die sich dafür entscheiden, die Studie über die ersten 16 Wochen hinaus fortzusetzen, erhalten jedoch eine separate Einverständniserklärung zur Unterzeichnung.

Studienbesuche

Die Studienbesuche werden in Vancouver, BC, Kanada, an der University of British Columbia, Food, Nutrition and Health Building und in der Clinical Research Evaluation Unit am BC Children and Women’s Hospital durchgeführt. Baseline (8-21 Schwangerschaftswochen): Sowohl die Teilnehmerin als auch die Forschungskoordinatorin (KMC) unterschreiben die Einverständniserklärung; eine Kopie wird eingescannt und der Teilnehmerin nach dem Studienbesuch per E-Mail zugeschickt. Die Teilnehmerinnen füllen einen Ausgangsfragebogen aus, um ihre medizinische und ernährungsbezogene Vorgeschichte sowie demografische Daten zu erfassen. Zur Berechnung der DFEs wird ein validierter Fragebogen zur Häufigkeit der Nahrungsaufnahme verwendet. Gewicht und Größe werden mit einer elektronischen Waage und einem Stadiometer gemessen und auf 0,1 kg bzw. 0,10 m genau aufgezeichnet. Es wird eine venöse 12-ml-Nüchternblutprobe über 3 Stunden entnommen. Die Teilnehmer erhalten ihre Studienergänzungsmittel (entweder Folsäure oder (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure) und erhalten ein Tagebuch, in dem sie die tägliche Einnahme eintragen. Halbzeit: Nach 8 Wochen werden alle Frauen kontaktiert, um die Einhaltung der Studie zu überprüfen, eventuelle Fragen oder Bedenken anzusprechen und einen Termin für die Endkontrolle zu vereinbaren. Endpunkt (24-37 Schwangerschaftswochen): Es wird eine venöse 12-ml-Nüchternblutprobe entnommen, das Gewicht wird wie oben beschrieben gemessen, und die Teilnehmerinnen füllen einen Endpunkt-Fragebogen aus, um etwaige Veränderungen des Gesundheitszustands oder der Medikamenteneinnahme seit dem Ausgangswert festzustellen. Die Teilnehmer geben ihr Nahrungsergänzungstagebuch zurück, und alle verbleibenden Kapseln werden gezählt. Nach der Geburt: Bei der Endkontrolle können Teilnehmerinnen, die zu stillen beabsichtigen und einen funktionierenden Haushaltsgefrierschrank haben, die Studie in der Phase nach der Geburt fortsetzen. Nach Einholung einer zweiten Einverständniserklärung erhalten die Teilnehmerinnen Nahrungsergänzungsmittel, die sie bis etwa 1 Woche nach der Geburt einnehmen sollen, sowie ein neues Nahrungsergänzungstagebuch. Die Teilnehmerinnen werden darin geschult, wie sie an den Tagen 5 bis 7 nach der Geburt zu Hause eine kleine Muttermilchprobe (3 ml) entnehmen können, und erhalten alle erforderlichen Materialien (ausführlicher beschrieben im Abschnitt „Entnahme und Verarbeitung der Muttermilch“ weiter unten). Die Teilnehmerinnen bewahren ihre Muttermilchprobe im Gefrierschrank auf und benachrichtigen die Forschungskoordinatorin, wenn die Probe zur Abholung bereit ist. Die Abholung erfolgt innerhalb von 4 Tagen nach der Benachrichtigung, und zu diesem Zeitpunkt wird eine 12-ml-Venenblutprobe entnommen. Die Frauen werden angewiesen, ihr Folsäurepräparat 2 Stunden vor der Entnahme von Muttermilch- und Blutproben einzunehmen, um den Spitzenwert von UMFA im Plasma zu standardisieren (und möglicherweise die Aufnahme von UMFA in die Muttermilch; der Zeitpunkt dieses Prozesses ist jedoch nicht gut beschrieben).

Studienergänzungen

Die Folsäure und (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure werden getrennt von den pränatalen Multivitaminen verabreicht. Diese Entscheidung wurde getroffen, weil einige Frauen über Unverträglichkeiten bei der Einnahme von pränatalen Multivitaminen berichten; diese sind in der Regel auf den hohen Eisengehalt zurückzuführen und verschwinden nach dem ersten Trimester. Sollte es zu einer vorübergehenden Unverträglichkeit kommen, können die Teilnehmerinnen ihr Multivitamin auslassen oder eine halbe Dosis einnehmen, während sie weiterhin die volle Dosis Folsäure zu sich nehmen. Die Grundstoffe für die Folsäure und die pränatalen Multivitamine wurden von Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) zur Verfügung gestellt. (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure (Metafolin®) als Bulkware wurde von Merck & Cie (Schaffhausen, Schweiz) zur Verfügung gestellt. Alle Hauptbestandteile wurden bei Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) zu pflanzlichen Gelkapseln verarbeitet. Die Folsäure- und (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure-Kapseln sehen identisch aus, um eine doppelte Verblindung zu ermöglichen. Das pränatale Multivitaminpräparat enthält dieselbe Mikronährstoffformulierung wie WN Pharmaceuticals Ltd.® Prenatal (NPN 80025456), allerdings wurde die Folsäure entfernt. Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) hat für alle Nahrungsergänzungsmittel der Studie eine Gesamtqualitätszusammenfassung erstellt, die von Health Canada überprüft wurde, wobei die Folsäure- und (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure-Dosen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestätigt wurden. Ein Genehmigungsbescheid für den Antrag auf klinische Prüfung (Einreichungsnummer 244456) wurde vom Direktorat für natürliche und nicht verschreibungspflichtige Gesundheitsprodukte von Health Canada am 26. Juli 2019 erteilt.

Doppelte Verblindung, Randomisierung und Bereitstellung von Ergänzungspackungen

Ein unabhängiger Forschungsassistent von Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) wird den Folsäure- und (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure-Ergänzungen Verblindungscodes (A oder B) zuweisen. Die Flaschen mit den Folsäurepräparaten werden mit „A“ oder „B“ beschriftet und weisen darauf hin, dass „die Kapseln entweder Folsäure oder Folat enthalten“. Sowohl die Teilnehmer als auch das primäre Forschungsteam sind blind für die Zuteilung der Nahrungsergänzungsmittel, die erst nach Abschluss der endgültigen statistischen Analysen dekodiert wird. Die Randomisierungssequenz wird von einem unabhängigen Statistiker computergeneriert, wobei Viererblöcke mit jeweils zwei Teilnehmern pro Supplementgruppe verwendet werden. Das primäre Forschungsteam wird für die Randomisierungssequenz blind sein. Bei der Erstuntersuchung jedes Teilnehmers wird der Forschungskoordinator (KMC) die Zuteilung (A oder B) für die jeweilige Studien-ID aufheben, um die zugewiesenen Studienergänzungen bereitzustellen. Zu Beginn der Studie erhalten die Teilnehmerinnen ein Ergänzungspaket mit allen Kapseln für die 16-wöchige Intervention; wenn die Teilnehmerinnen sich entscheiden, die Studie in der postpartalen Phase fortzusetzen, erhalten sie am Ende der Studie weitere Ergänzungsmittel, die sie bis zu einer Woche nach der Geburt einnehmen können.

Begleitende Medikamente

Während der Intervention gibt es keine Einschränkungen für die Einnahme von Medikamenten; allerdings müssen alle Medikamente angegeben werden. Die einzige Ausnahme bilden folat- und folsäurehaltige Nahrungsergänzungsmittel, die während des gesamten Interventionszeitraums nicht erlaubt sind.

Strategien zur Verbesserung der Adhärenz

Schwangere Frauen sind in der Regel hoch motiviert und haben ein großes Interesse an der Teilnahme an klinischen Forschungsstudien. Nach einer Umfrage der kanadischen Gesundheitsbehörde nehmen 94 % der Frauen in British Columbia während der Schwangerschaft pränatale Multivitamine ein. Daher sind die Teilnehmerinnen zum Zeitpunkt der Teilnahme wahrscheinlich an die tägliche Einnahme gewöhnt. Die Forschungskoordinatorin (KMC) wird sich mit jeder Teilnehmerin zur Halbzeit (8 Wochen nach der Erstuntersuchung) in Verbindung setzen, um etwaige Fragen oder Bedenken zu klären. Darüber hinaus ermöglicht das Ergänzungspaket eine geordnete Aufbewahrung der Nahrungsergänzungsmittel zu Hause, und das Ergänzungstagebuch dient als tägliche Erinnerung, um die Einhaltung der Teilnahme während der 16 Wochen zu verbessern. Aus diesen Gründen gehen wir davon aus, dass das Studienprotokoll in hohem Maße eingehalten wird (> 90%).

Blutprobenentnahme und -verarbeitung

Venöse Blutproben (insgesamt 12 ml) werden in einem 6-mL-Äthylendiamintetraessigsäure

(EDTA)-Röhrchen, einem 2-mL-EDTA-Röhrchen und einem 4-mL-Serumröhrchen (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) zu Beginn, am Ende der Studie und nach der Geburt (falls zutreffend) entnommen. Die Blutentnahmen zu Beginn und am Ende der Studie erfolgen nach einer 3-stündigen Nüchternzeit; diese Zeitspanne ist ausreichend, um den störenden Einfluss einer kürzlichen Folataufnahme auf die Serumkonzentrationen zu reduzieren. Die Blutentnahme nach der Geburt (ca. 1 Woche nach der Geburt) erfolgt nüchtern, da dies die Folatkonzentration in den Erythrozyten nicht beeinflusst und die Belastung der Teilnehmerinnen reduziert. Nach der Entnahme werden die Röhrchen vor Licht geschützt, gemäß den Empfehlungen des Herstellers vorsichtig umgedreht, in eine Kühlbox gestellt und zur sofortigen Verarbeitung (innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme) ins Labor transportiert.

Zur Herstellung des Vollbluthämolysats wird Vollblut (0,3 ml) aus dem 6-mL-EDTA-Röhrchen entnommen und durch Zugabe von 3,0 ml einer 1%igen Ascorbinsäurelösung 1/11 verdünnt und anschließend 30 Minuten lang bei 37 °C bebrütet. Das 6-mL-EDTA-Röhrchen wird dann bei 3000 U/min für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Plasma wird entnommen, und (nur bei Baseline- und Endline-Proben) der verbleibende Inhalt des 6-mL-EDTA-Röhrchens wird mit dem SepMate PBMC-Isolationsprotokoll (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Kanada) zur Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) verarbeitet. Das 2-mL-EDTA-Röhrchen wird für ein vollständiges Blutbild verwendet. Das 4-mL-Serumröhrchen wird bei Raumtemperatur für ca. 30 Minuten (bis zur Gerinnung) stehen gelassen und dann bei 3000 U/min für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert; das Serum wird gesammelt. Alle Aliquots werden bis zur weiteren Analyse bei – 80 °C gelagert.

Muttermilchsammlung und -verarbeitung

Die Frauen werden angewiesen, an den Tagen 5-7 nach der Geburt zwischen 13:00 und 14:50 Uhr Muttermilch zu sammeln (da die mittlere Folatkonzentration zu diesem Zeitpunkt repräsentativ für die mittlere Folatkonzentration über einen Zeitraum von 24 Stunden zu sein scheint), 2-3 Stunden nach dem letzten vollständigen Abpumpen. Die Teilnehmerinnen werden die Muttermilch vollständig (manuell oder mit einer elektrischen Pumpe) aus der rechten Brust abpumpen. Nach dem Abpumpen werden die Frauen angewiesen, die Milch sanft zu schwenken, um sie zu mischen, und dann mit einer sterilen Falcon-Pipette 0,5 ml in zwei bernsteinfarbene Kryogefäße (die jeweils 0,005 g Ascorbinsäure für eine 1%ige Verdünnung enthalten) und 1 ml in zwei bernsteinfarbene Kryogefäße zu füllen. Alle Kryo-Fläschchen werden bei den 0,5- und 1-mL-Flächen deutlich gekennzeichnet. Die Frauen stellen alle Fläschchen in eine Gefrierbox, die bis zu 4 Tage im Gefrierschrank gelagert wird. Die Proben werden gefroren entnommen und ins Labor gebracht, wo sie bis zur weiteren Analyse bei – 80 °C gelagert werden.

Laboranalysen

Serumfolat (nmol/L) und RBC-Folat (nmol/L) werden mittels mikrobiologischem Assay analysiert, wie weltweit empfohlen, unter Verwendung der von Molloy et.al. beschriebenen Mikrotiterplattenmethode. RBC-Folat (nmol/L) wird mit der folgenden Formel berechnet:

Plasma-Biomarker einschließlich UMFA (nmol/L), S-Adenosyl-Methionin (μmol/L), S-Adenosyl-Homocystein (μmol/L), Gesamt-Homocystein (μmol/L), Gesamt-Cystein (μmol/L), Methionin (μmol/L), freies Cholin (μmol/L) und Betain (μmol/L) werden mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie analysiert. Vitamin B12 (pmol/L) wird mit einem Immunoanalyzer analysiert. Pyridoxal-5-phosphat (nmol/L) wird mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Genvarianten werden mit Hilfe von TaqMan SNP-Genotypisierungstests bestimmt. Ein vollständiges Blutbild wird mit einem automatischen Hämatologie-Analysegerät (Sysmex XNL-550) durchgeführt. Die Folatformen in der Muttermilch (einschließlich UMFA, THF, 5-Methyl-THF, 5-Formyl-THF und 5,10-Methenyl-THF) werden mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie quantifiziert; das Gesamtfolat ist die Summe dieser Formen. Die FBP-Konzentrationen in der Muttermilch werden mit einem kompetitiven Bindungs-Radioassay-Verfahren (wie von Selhub et al. beschrieben) gemessen.

Zusammenfassung der zu erhebenden Daten

Demografische, medizinische und Ernährungsdaten mittels strukturierter Fragebögen

Die Erhebung der Basisdaten umfasst Alter, ethnische Zugehörigkeit, Parität, Bildung, Beruf, Haushaltseinkommen, medizinische und medikamentöse Anamnese, berichtetes Gewicht vor der Schwangerschaft, allgemeine Ernährung (einschließlich veganer, vegetarischer, ketogener und glutenfreier Ernährung sowie aller Lebensmittel/Nahrungsmittelgruppen, die aus irgendeinem Grund gemieden werden) und Verwendung von Nahrungsergänzungsmitteln. Die Datenerhebung am Ende der Studie umfasst alle Veränderungen des allgemeinen Gesundheitszustands oder der Medikamenteneinnahme seit der Erstuntersuchung.

Anthropometrie

Der BMI vor der Schwangerschaft wird anhand des selbst angegebenen Gewichts vor der Schwangerschaft und der gemessenen Größe berechnet. Die Teilnehmerinnen werden zu Beginn (Gewicht und Größe) und am Ende (nur Gewicht) gemessen, um die Gewichtszunahme während des gesamten Interventionszeitraums und die Gesamtgewichtszunahme während der Schwangerschaft zu berechnen (anhand des selbstberichteten Gewichts vor der Schwangerschaft und des gemessenen Endgewichts).

Ernährungsbewertung

Die Gesamt-DFEs (μg/Tag) aus Nahrungsfolaten und zusätzlicher Folsäure werden mit dem Block Folic Acid/Dietary Folate Equivalents Screener (NutritionQuest, Berkeley, CA, USA), einem validierten Fragebogen zur Häufigkeit der Nahrungsaufnahme, berechnet.

Postpartale Daten

Die Gesamtzahl der Wochen der Nahrungsergänzung, die Schwangerschaftswoche bei der Entbindung, die Einhaltung des Protokolls zur Entnahme von Muttermilch und der Zeitpunkt der Folsäuresupplementierung vor der Entnahme von Muttermilch und postpartalen Blutproben werden aufgezeichnet.

Ausstiegskriterien

Zu den Ausstiegskriterien gehören spontaner oder geplanter Schwangerschaftsabbruch, die Einnahme zusätzlicher folat- und folsäurehaltiger Nahrungsergänzungsmittel und ein unerwünschtes/schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis im Zusammenhang mit den Nahrungsergänzungsmitteln/der Studienintervention (wie vom qualifizierten Prüfarzt (CM) bestimmt). Die Teilnehmer können sich auch jederzeit selbst aus der Studie zurückziehen, ohne dass weitere Informationen erhoben werden. Unabhängig vom Grund für den Rücktritt werden alle zuvor erhobenen Daten für die Analyse aufbewahrt. Teilnehmerinnen, die vor dem Endtermin entbinden, haben die Möglichkeit, die Studie in der postpartalen Phase fortzusetzen, vorausgesetzt, sie nehmen weiterhin täglich die Nahrungsergänzungsmittel der Studie ein.

Datenverarbeitung und Datenschutz

Alle Daten und biologischen Proben werden anhand der Studien-ID der einzelnen Teilnehmerinnen identifiziert. Daten mit persönlichen Identifikatoren werden auf einem verschlüsselten, passwortgeschützten Computer in einem sicheren Serverraum des BC Children’s Hospital Research Institute gespeichert. Die Daten, bei denen die persönlichen Identifikatoren entfernt wurden, werden bereinigt, und der Forschungskoordinator (KMC) und ein unabhängiger Forschungsassistent führen eine doppelte Eingabe in REDCap (Research Electronic Data Capture) durch, das vom BC Children’s Hospital Research Institute betrieben wird. KMC, JAH und CDK werden Zugang zum endgültigen Datensatz haben. Die Papierdokumente werden in einem verschlossenen Aktenschrank aufbewahrt, und die biologischen Proben werden in einem verschlossenen Gefrierschrank aufbewahrt, der sich im Labor des Studienleiters (CDK) an der Universität von British Columbia befindet. Die Teilnehmerinnen können über ihre Folsäuresupplementierung und ihre Folatergebnisse aus Blut und Muttermilch (falls zutreffend) informiert werden (einschließlich DFEs, Serum- und RBC-Folat zu Studienbeginn, am Ende der Studie und nach der Geburt sowie die Gesamtfolatkonzentration in der Muttermilch), nachdem die endgültigen statistischen Analysen abgeschlossen sind.

Daten und statistische Analyse

Deskriptive Statistiken werden für die Ausgangsdaten der Teilnehmerinnen verwendet. Kontinuierliche Variablen werden als Mittelwert ± Standardabweichung (oder Median und Interquartilsbereich, falls nicht normal verteilt) und kategorische Variablen als absolute Zahlen pro Gruppe und Prozentsatz angegeben. Die Anzahl der Kapseln wird verwendet, um die Adhärenz der Teilnehmer zu berechnen, und das Einnahmetagebuch wird verwendet, um einen deskriptiven Einblick in Adhärenzbarrieren zu geben. Die Daten werden auf Normalität geprüft, und wenn die Daten nicht normalverteilt sind, werden Transformationen oder gleichwertige nichtparametrische Tests in Betracht gezogen. Die statistischen Analysen werden mit Stata (StataCorp, College Station, TX, USA) durchgeführt. Alle Analysen werden zunächst auf einer Intention-to-Treat-Basis entsprechend der ursprünglichen Gruppenzuordnung bei Studienbeginn und ohne Imputation fehlender Daten durchgeführt. Sekundäre Per-Protocol-Analysen werden unter Einbeziehung derjenigen durchgeführt, die die Studie vollständig abgeschlossen und sich an das Studienprotokoll gehalten haben. In Sensitivitätsanalysen werden fehlende Daten gegebenenfalls durch mehrfache Imputation korrigiert.

Primäre Analysen

Wir werden den Mittelwert ± Standardabweichung für die primären Ergebnisse (Serumfolat, RBC-Folat und Plasma-UMFA) in jeder Gruppe zu Beginn und am Ende der Studie sowie den Mittelwert ± Standardabweichung der Veränderung dieser Ergebnisse innerhalb einer Frau in jeder Gruppe berechnen. Diese Schätzungen werden zur Berechnung des Stichprobenumfangs der endgültigen Studie herangezogen.

Sekundäranalysen

Exploratorische Analysen der primären Ergebnisse werden unter Verwendung eines multiplen linearen Regressionsmodells durchgeführt, um zu untersuchen, ob sich die Veränderung vom Ausgangswert bis zum Endwert je nach Behandlungsstatus unterscheidet, wobei die Ausgangswerte und erklärende Variablen (DFEs, explorative Biomarker, Schwangerschaftswochen bei Beginn der Nahrungsergänzung) berücksichtigt werden. Der Anteil der Frauen mit UMFA ≥ 0,2 nmol/L (als nachweisbare Konzentration) bei Studienbeginn und Studienende in jeder Gruppe wird ebenfalls berechnet. Um unser sekundäres Ziel zu erreichen, wird die Gesamtteilnahmerate geschätzt, indem die Gesamtzahl der eingeschriebenen Frauen durch die Gesamtzahl der an einer Teilnahme interessierten Frauen geteilt wird. Die wöchentliche Rekrutierungsrate wird geschätzt, indem die Gesamtzahl der eingeschriebenen Frauen durch die Gesamtzahl der Wochen, die für die Rekrutierung benötigt wurden, geteilt wird. Die Haltequote wird geschätzt, indem die Zahl der Frauen, die die gesamte Studie abschließen, durch die Gesamtzahl der eingeschriebenen Frauen geteilt wird. Für jede Rekrutierungsstrategie (einschließlich Plakate, soziale Medien, Mundpropaganda) werden die Gesamtreichweite (nur soziale Medien), Anfragen, Anmeldungen und Kosten bewertet. Die Wahrscheinlichkeit, dass sich Frauen nach einer Anfrage für jede Strategie anmelden, wird mit einem Odds-Ratio bewertet. Soweit verfügbar, werden die Gründe für die Nichtaufnahme in die Studie erfasst.

Analysen nach der Geburt

Wir berechnen den Mittelwert ± Standardabweichung für den Folsäureanteil in der Muttermilch (indem wir die Folsäurekonzentration in der Muttermilch durch die Summe aller Folatformen in der Muttermilch dividieren) und für das mütterliche postpartale RBC-Folat. Mittels linearer Regression wird der Zusammenhang zwischen der Folsäurekonzentration in der Muttermilch und dem mütterlichen UMFA-Plasma nach der Geburt geschätzt. Die postpartalen Ergebnisse werden mit Hilfe einer multiplen linearen Regression weiter analysiert, wobei die Endwerte und erklärende Variablen (DFEs, Gesamtzahl der Wochen der Supplementierung, Einhaltung des Protokolls der Muttermilchentnahme) berücksichtigt werden.

Sicherheit

Folsäure wird in einer Dosis verabreicht, die den kanadischen Empfehlungen für schwangere Frauen entspricht (0,4-1,0 mg/Tag); sie wird daher als risikoarm angesehen. Das Kalziumsalz der (6S)-5-Methyltetrahydrofolsäure gilt als sicher und ist in kanadischen pränatalen Multivitaminen enthalten, für die keine tolerierbare Obergrenze festgelegt wurde (derzeit ist kein Schadensrisiko bekannt). Die Randomisierung wird zwischen der 8. und 21. Schwangerschaftswoche (nach dem Neuralrohrverschluss) erfolgen. In Anbetracht des geringen Risikos dieser Pilotstudie wurde die Einsetzung eines Datenüberwachungsausschusses nicht für notwendig erachtet. Alle Sicherheitsbedenken und, falls erforderlich, die Entscheidung, die Studie zu beenden, werden von den Hauptprüfern (CDK und JAH) und einem qualifizierten Prüfer (CM) behandelt und dem Ethikausschuss für Forschung und Health Canada gemeldet. Die Verblindung der Interventionscodes kann jederzeit aufgehoben werden, wenn dies zur Überwachung der Sicherheit der Teilnehmer für notwendig erachtet wird.