Untersuchte Pilze

Escovopsioides-Isolate wurden aus Pilzgärten verschiedener Blattschneider- und Nichtblattschneiderameisenarten gewonnen, die in früheren Studien gesammelt wurden. Diese Sammlung umfasst 20 Isolate aus Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi und Trachymyrmex tucumanus sowie die Typusart von E. nivea aus Acromyrmex subterraneus subterraneus (Tabelle 3). Außerdem wurde ein weiteres Isolat aus einer Kolonie der Nicht-Blattschneiderameise Apterostigma megacephala in Parauapebas, Pará, Brasilien, gewonnen (Tabelle 3). Alle Isolate wiesen die beschriebenen morphologischen Merkmale der Gattung Escovopsioides auf: hyaline Kolonien auf PDA, terminale und interkalare Bläschen mit lagenförmigen Phialiden, hyaline Konidien in langen Ketten, Aleurokonidien und chlamydosporenähnliche Strukturen.

Die Isolate werden als Konidiensuspensionen bei – 80 °C (in Glycerin 10%) und in destilliertem Wasser bei 10 °C in der Sammlung des Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Claro, São Paulo State, Brasilien, aufbewahrt. Alle Isolate wurden aus den Beständen durch Inokulation konservierter Konidien auf PDA-Medium wiederbelebt und 7 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrütet. Alle untersuchten Isolate wurden als Monosporen-Kulturen gewonnen.

Molekulare Charakterisierung von Escovopsioides

Genomische DNA wurde mit der CTAB-Methode aus Kulturen extrahiert, die 5 Tage lang im Dunkeln auf Malzagar 2% (MA2%) gewachsen waren. Die Gene, die für tef1 (Primer: EF6-20F und EF6A-1000R), LSU (Primer: CLA-F und CLA-R) sowie ITS (Primer: ITS5 und ITS4) kodieren, wurden für alle Isolate amplifiziert. Für tef1 wurde 1 μl verdünnte genomische DNA (1:100) als Template für die Amplifikation mit illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) unter folgenden Bedingungen verwendet: ein erster Denaturierungsschritt bei 94 °C für 2 min, gefolgt von 15 Zyklen bei 94 °C für 30 s und einer anfänglichen Annealing-Temperatur von 65 °C, die pro Touchdown-Zyklus um 1 °C abnimmt, und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 1 min. Ein zweiter PCR-Schritt wurde durchgeführt: 94 °C für 30 s, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 30 s, 48 °C für 30 s und einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 °C für 1 min. Für ITS wurden 2 μl der verdünnten genomischen DNA (1:100) als PCR-Template verwendet, wobei die in Schoch et al. beschriebenen Bedingungen galten: 94 °C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 1 min, 55 °C für 1 min und einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 °C für 2 min. Für LSU wurden 2 μl verdünnte genomische DNA (1:100) für die PCR unter den in Augustin et al. beschriebenen Bedingungen verwendet: 95 °C für 2 min, 40 Zyklen von 30 s bei 95 °C, 60 s bei 62 °C, 90 s bei 72 °C und 5 min Verlängerung bei 72 °C. Die PCR-Produkte wurden mit GelRed™ (Biotium) angefärbt und nach der Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel unter UV-Licht sichtbar gemacht.

Amplikons wurden mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die Proben wurden im NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) analysiert und 20 ng DNA wurden mit dem BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Aufgrund des hohen GC-Gehalts in der ITS-Region von Escovopsioides wurde den Sequenzierungsreaktionen 5 % DMSO zugesetzt. Vorwärts- und Rückwärtssequenzen wurden in ABI 3500 (Life Technologies) erstellt und in BioEdit v.7.1.3 zu Contigs assembliert. Die in der vorliegenden Studie erzeugten Sequenzen wurden in der NCBI-GenBank hinterlegt (Additional file 1: Table S1).

Phylogenetische Analyse

Zusätzlich zu den in dieser Studie erzeugten Sequenzen wurden die Sequenzen der Typusart (E. nivea) sowie von sechs beschriebenen Escovopsis-Arten und acht Pilzen, die zu den Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma und Lecanicillium) gehören, aus der NCBI-GenBank wiedergewonnen. Somit umfasste der gesamte in dieser Studie verwendete Datensatz Sequenzen von 37 Pilzen (Additional file 1: Table S1).

Für die phylogenetische Analyse wurden die Sequenzen in MAFFT aligniert. Die Sequenzen von tef1, ITS und LSU wurden in Winclada v.1.00.08 verkettet. Als Rekonstruktionsalgorithmus wurde die Bayes’sche Inferenz verwendet. Das Nukleotid-Substitutionsmodell GTR + G und GTR + I + G wurde für tef1 bzw. ITS/LSU unter Verwendung von AIC in jModeltest2 mit einem Konfidenzintervall von 95 % ausgewählt. Es wurden also partitionierte unabhängige Analysen des Datensatzes in MrBayes mit jeweils drei erhitzten Ketten und einer kalten Kette durchgeführt. Das MCMC-Sampling erfolgte in jeder Analyse mit bis zu einer Million Generationen. Die Konvergenz der erhitzten und kalten Ketten trat ein, wenn die Standardabweichung der Split-Frequenzen unter 0,01 lag; dann wurden die ersten 25 % der Generationen als Burn-in verworfen.

Dual-Kultur-Experimente

Wir führten In-vitro-Tests durch, um das antagonistische Potenzial von Escovopsioides gegenüber dem von Blattschneiderameisen kultivierten Pilz zu überprüfen. Wir wählten 13 von 21 Escovopsioides-Isolaten (Tabelle 3) anhand der folgenden Kriterien aus: i) Polymorphismus im tef1-Gen; ii) verschiedene assoziierte Ameisenarten; iii) geografischer Standort (d. h. verschiedene Städte und Sammelstellen). Zwei der ausgewählten Isolate (LESF 596 und LESF 599) wurden bereits in der Studie von Varanda-Haifig et al. auf ihre Wechselwirkungen mit der Pilzsorte untersucht. Wir haben diesen Test jedoch wiederholt, um ihn mit weiteren Escovopsioides-Isolaten zu vergleichen.

Der Pilz Leucoagaricus gongylophorus FF2006, der von der Ameisenart Atta sexdens rubropilosa kultiviert wird, wurde in den Doppelkulturversuchen verwendet. Dieser Stamm wird auf Agarplatten durch aufeinanderfolgende Transfers alle 24 Tage bei 25 °C gehalten. Die Produktion von Gongylidien durch diesen Stamm wird bei jedem Transferzyklus überprüft. Dieser Pilz wurde auf PDA-Medium gezüchtet und 14 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrütet. Nach dieser Zeit wurden Myzelfragmente (8 mm Durchmesser) auf neue Petriplatten (90 × 15 mm) übertragen, die ebenfalls PDA in einem Abstand von 1,5 cm vom Rand enthielten. Diese Platten wurden 14 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrütet. Dann wurden Myzelfragmente (8 mm Durchmesser) von Escovopsioides, die zuvor auf PDA bebrütet worden waren, in einem Abstand von 3 cm vom mutualistischen Pilz beimpft. Um die Auswirkungen von Escovopsioides auf das Myzelwachstum des Pilzkultivars mit den Auswirkungen anderer Pilze zu vergleichen, verwendeten wir ein Isolat von Escovopsis sp. (LESF 19) aus den Pilzgärten von Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brasilien). Dieses Isolat wurde durch Beimpfen von kleinen Stücken des Pilzgartens auf mit Chloramphenicol angereicherter PDA gewonnen. Die Kontrollplatten wurden mit demselben mutualistischen Pilz beimpft, jedoch wurden keine Escovopsioides oder Escovopsis beimpft. Alle Platten wurden 14 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrütet. Jede Kombination von Escovopsioides, Escovopsis und dem mutualistischen Pilz wurde auf zehn Platten durchgeführt. Die Versuchs- und Kontrollplatten wurden in Abständen von 0, 2, 3, 5, 7 und 10 Tagen mit einem HP Deskjet F2050 Scanner gescannt. Die Bilder wurden verwendet, um die Fläche des Koloniewachstums (cm2) des mutualistischen Pilzes in ImageJ v. 1.38 zu messen.

Die Myzelwachstumsflächen von L. gongylophorus in den Dual-Kultur-Experimenten wurden mit einer gemischten Zwei-Wege-ANOVA analysiert, wobei die Pilzisolate (Escovopsioides und Escovopsis) im Vergleich zur Kontrolle als Variable zwischen den Versuchspersonen und die Zeit (Tage) als Variable innerhalb der Versuchspersonen betrachtet wurden, so dass die wiederholten Messungen der Zeit in den Behandlungen berücksichtigt wurden. Die Daten wurden mit Hilfe des Shapiro-Wilk-Tests und des Levene-Tests auf Normalität und Homogenität der Varianzen geprüft. Da diese Kriterien nicht erfüllt waren, wurden die Daten, falls erforderlich, mit der Logarithmus- oder Quadratwurzelmethode transformiert. Mehrfache Vergleiche mit verschiedenen Fadenpilzen wurden mittels t-Test mit Bonferroni-Korrektur durchgeführt.

Für den Vergleich zwischen den Isolaten wurde die Myzelwachstumsfläche von L. gongylophorus in Kontakt mit Escovopsioides-Isolaten durch die mittlere Fläche der Kontrolle am Tag 10 geteilt. Die Daten wurden auf Normalität und Homogenität der Varianzen geprüft. Eine einseitige ANOVA wurde mit der am Tag 10 erhaltenen Fläche zwischen allen getesteten Pilzen durchgeführt, wobei Vergleiche zwischen den verschiedenen Behandlungen mit dem Tukey-HSD-Test post-hoc durchgeführt wurden. Statistische Analysen wurden in R v. 2.12.1 durchgeführt.

Bioassays auf Pilzgartenfragmenten in Abwesenheit von Arbeiterinnen

Leucoagaricus gongylophorus wird in Ameisenkolonien in Pilzgärten gezüchtet. Um festzustellen, ob sich Escovopsioides auf dem Pilzgarten ohne die mögliche schützende Wirkung der Arbeiterinnen entwickeln kann, haben wir Bioassays mit Fragmenten dieses Substrats ohne Ameisen durchgeführt. Die Fragmente des Pilzgartens stammten von einer reifen und gesunden Kolonie von A. sexdens rubropilosa, die im Zentrum für Studien über soziale Insekten (UNESP, Rio Claro) gehalten wird. Die von Ameisen und Brut befreiten Pilzgartenfragmente von 2 cm3 wurden in sterile Petrischalen mit angefeuchteter Baumwolle an den Rändern gelegt (nach Elizondo-Wallace et al.). Vor der Durchführung der Experimente wurden die Platten einen Tag lang bei 25 °C aufbewahrt, um nach Ameisen zu suchen, die möglicherweise in den Fragmenten verblieben waren.

Wir bereiteten eine 10-mL-Suspension von 0,05 % Tween 80 mit Myzelmasse und Konidien von jedem der 12 Escovopsioides (Isolat LESF 591 wurde in diesem Experiment nicht verwendet) und einem Escovopsis-Isolat vor, das in den Doppelkultur-Experimenten verwendet wurde. Diese Suspension wurde zwei- bis dreimal nach der Methode von Newmeyer filtriert, um die Konidien von den in der Suspension vorhandenen Hyphenfragmenten zu trennen. Anschließend wurde die Suspension auf 105 bis 2,105 Konidien mL-1 verdünnt und in einer Neubauer-Kammer bestimmt. Aliquote Mengen von 100 μl der Konidiensuspensionen wurden mit einer Mikropipette auf die Oberfläche des Gartenfragments beimpft. Die gleiche Menge steriler 0,05%iger Tween 80-Lösung wurde als Negativkontrolle auf die Gartenoberfläche gegeben. Die Petrischalen mit dem Pilzgarten wurden bis zu 10 Tage lang bei 25 °C aufbewahrt, wobei fünf Schalen für jede Behandlung und fünf Schalen für jede entsprechende Kontrolle verwendet wurden. Die mögliche Entwicklung von Hyphen der inokulierten Pilze wurde täglich mit einem Stereomikroskop (EZ4, Leica) beobachtet. Die Konidiation von Escovopsioides auf den Pilzgärten wurde durch die Entnahme von Myzelfragmenten beobachtet, die auf den Gärten wuchsen, in Wasser eingelegt und unter dem Mikroskop (DM500, Leica) beobachtet wurden.

Daten zum Wachstum und zur Konidiation auf den Pilzgärten wurden wie folgt bewertet: kein Wachstum (Punktzahl 0), nur am Stereomikroskop beobachtetes Wachstum (Punktzahl 1), makroskopisches Wachstum (Punktzahl 2) und Konidiation (Punktzahl 3) während der zehntägigen Beobachtungszeit (Additional file 1: Abbildung S1). Wir beobachteten die Konidiation nur nach dem makroskopischen Wachstum der Pilze in den Pilzgärten. Die Gesamtsumme der Punktzahlen von fünf Petrischalen an jedem Tag wurde ermittelt und für direkte Vergleiche in Prozent der maximal möglichen Gesamtsumme umgerechnet.

Auswirkungen von Escovopsioides auf Gärten mit Arbeiterinnen

Antiarbeiterinnen spielen eine wichtige Rolle bei der Kolonieabwehr gegen Pathogene und unerwünschte Mikroben in den Pilzgärten. Daher haben wir Experimente durchgeführt, um den Einfluss von Arbeiterinnen in Pilzgärten zu überprüfen, die mit Konidien derselben Pilze beimpft wurden, die in den Bioassays in Pilzgärten ohne Ameisenarbeiterinnen verwendet wurden (12 Escovopsioides-Isolate und 1 Escovopsis-Isolat).

Bioassays mit queen-rechten Ameisenkolonien sind aufgrund der großen Anzahl von Kolonien, die diese Art von Experiment erfordern würde, schwierig. Daher haben wir Bioassays mit Gartenfragmenten durchgeführt, die Arbeiterinnen enthalten, um die Auswirkungen der Pilzisolate in vivo zu bewerten. Diese Versuchsanordnung entspricht zwar nicht dem, was in natürlichen Bienenvölkern vorkommt, gibt aber Aufschluss über die Abwehrwirkung der Arbeiterinnen gegen die getesteten Pilze. Dieser Bioassay wurde in Anlehnung an die Methode von Elizondo-Wallace et al. angepasst. Um ein Austrocknen der Pilzgärten zu vermeiden, wurden Plastikbehälter mit einer winzigen Gipsschicht im Boden verwendet. In die Plastikbehälter wurden etwa 20 cm3 Pilzgarten aus derselben Kolonie, die im vorherigen Versuch verwendet wurde, gegeben. Der Versuchsaufbau umfasste insgesamt 84 Behälter, so dass die Behandlungen mit Konidien der 13 Pilze und die Kontrolle jeweils sechs Behälter umfassten. Wir wählten Arbeiterinnen mit einem Kopfkapseldurchmesser zwischen 1,0 und 1,6 mm aus und setzten 50 dieser Arbeiterinnen in jeden Behälter. Arbeiterinnen mit weniger als 1,0 mm wurden nicht gezählt, und Arbeiterinnen mit mehr als 1,6 mm wurden ausgeschlossen. Dieses Verfahren wurde gewählt, um die Homogenität zwischen den sechs Behältern jeder Behandlung sowie zwischen den Behandlungen zu gewährleisten, da die Arbeiterinnen im Bereich zwischen 1,0 und 1,6 mm eine signifikante Reinigungsaktivität aufweisen. Die Innenfläche des Behälters wurde mit Teflon® beschichtet, um ein Entweichen der Ameisen zu verhindern.

Die Behälter wurden 3 Tage lang bei 25 °C bebrütet, um die Pilzgärten zu stabilisieren. Die Konidiensuspensionen wurden wie oben beschrieben gewonnen. Insgesamt 1 mL der Konidiensuspension wurde mit einem Sprühgerät auf die Oberfläche der Pilzgärten gesprüht. Die Pilzgärten der Negativkontrolle wurden nur mit 1 ml steriler 0,05%iger Tween 80-Lösung besprüht.

Die Versuche wurden nach 0, 5 und 10 Tagen der Inokulation überwacht, um den Gesundheitszustand der Pilzgärten zu überprüfen. Dieser Parameter basierte auf einem Punktesystem, bei dem gesunde Gärten die Note 0, teilweise degradierte Gärten die Note 1 und vollständig degradierte („infizierte“) Gärten die Note 2 erhielten. Die Entfernung von Pilzgartenstücken durch die Ameisen und die Zuweisung zu den Mülldeponien war das wichtigste von uns untersuchte Zeichen für den Verfall der Gärten (siehe Zusatzdatei 1: Abbildung S2). Die von den sechs Containern jedes Experiments an den drei Beobachtungstagen erhaltenen Punktzahlen wurden mit dem Friedman-Test verglichen.

Um das Vorhandensein der Escovopsioides-Isolate auf den Pilzgärten an den Tagen 0, 5 und 10 nach der Behandlung zu überprüfen, wurden Fragmente aus den Gärten entfernt und auf MA2% mit 150 μg mL- 1 Chloramphenicol beimpft. Die Platten wurden 7 Tage lang bei 25 °C im Dunkeln bebrütet. Für jeden der sechs Behälter jeder Behandlung wurden fünf Platten mit einem Gartenfragment verwendet, insgesamt also 30 Platten pro Behandlung. Fragmente mit positivem Wachstum wurden gezählt, und das langfristige Vorhandensein der inokulierten Pilze in den Pilzgärten wurde mit dem Fisher’s Exact Test getestet. In dieser Analyse verglichen wir den Anteil der mit Pilzkonidien (Escovopsioides und Escovopsis) infizierten Fragmente mit der Kontrolle ohne jegliche Konidien an jedem Versuchstag. Wir haben auch die verschiedenen Behandlungen mit inokulierten Pilzen an jedem Versuchstag miteinander verglichen.