DR. EDWIN B. ASTWOOD war ein Visionär der modernen Endokrinologie. In den biographischen Memoiren von Roy Greep und Monte Greer heißt es abschließend: „Zusätzlich zu seinen spezifischen Forschungsbeiträgen gelang es Dr. Edwin B. Astwood in einem Ausmaß, wie es nur wenigen gelang, das weite Feld zwischen Naturwissenschaften und klinischer Medizin zu überspannen.“ Für mich ist dies die höchste Berufung in der Endokrinologie.

Die späten 1960er und frühen 1970er Jahre waren geprägt von den unglaublichen Leistungen zweier Gruppen, der von Dr. Andrew Schally und Roger Guillemin, die die regulatorischen Hormone des Hypothalamus isolierten, charakterisierten und sequenzierten. Das erste Hypothalamus-Regulationshormon, das sequenziert wurde, war TRH (ein Tripeptid), das zweite war Gonadotropin-Releasing-Hormon (ein Dekapeptid), und das dritte war Somatostatin mit 14 Aminosäuren. Die Existenz des GHRH wurde Anfang der 1960er Jahre durch einige klassische Experimente von Reichlin (1) vermutet; er nahm Läsionen im Hypothalamus vor und zeigte, dass der GH-Gehalt in der Hypophyse abnahm. Aufgrund dieser Daten schlug er vor, dass es ein GHRH im Hypothalamus geben muss.

Ich habe meine medizinische Ausbildung in London, England, absolviert, mit einer endokrinen Ausbildung unter Prof. G. Michael Besser. Eine der unterhaltsamsten Konferenzen, die wir regelmäßig besuchten, war die Präsentation klinischer Fälle bei der Royal Society of Medicine. Mir ist in Erinnerung geblieben, dass Prof. Peter Sonksen jedes Mal, wenn ein Patient mit Akromegalie vorgestellt wurde, die Frage stellte, ob der Patient einen Hinweis auf einen Karzinoid-Tumor hatte oder nicht. Der Eindruck im Publikum war: „Warum stellt dieser Mann immer diese Frage?“, denn solche Fälle gibt es wahrscheinlich nicht oder, wenn doch, nur sehr selten!

Im Jahr 1977 wechselte ich vom St. Bartholomew’s Hospital (London, England) an die Universität von Virginia. Mein Hauptinteresse galt damals den PRL-sezernierenden Hypophysentumoren und ihrer medizinischen Behandlung.

Im Oktober 1980 wurde eine 21-jährige Patientin von Dr. Ann Johanson an mich überwiesen. Diese Patientin hatte Amenorrhoe und Galaktorrhoe, während sie ein orales Kontrazeptivum zur Gonadensteroid-Substitution einnahm. Sie hatte eine gonadale Agenesie aufgrund des Turner-Syndroms.

Ihre Untersuchung ergab eine vergrößerte Hypophysenfossa auf dem Schädelröntgenbild, eine Hypophysenmasse mit mäßiger suprasellarer Ausdehnung auf dem Computertomogramm und einen erhöhten PRL-Serumspiegel von 68 μg/L. Ihr erhöhter GH-Serumspiegel von 95 μg/L wurde durch orale Glukose nicht unterdrückt, stieg durch TRH an und wurde durch eine Dopamininfusion unterdrückt. Ihr Serumspiegel des insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF)-I war mit 11 U/ml erhöht (normal, 0,41-2,2 U/ml).

Auf der Grundlage dieser Ergebnisse war die Diagnose der Akromegalie eindeutig. Interessant ist, dass die Patientin 1,70 m groß war, was für eine Patientin mit Turner-Syndrom sehr groß ist. In dieser Hinsicht war es ein Glücksfall, dass Seren aus den letzten 7 Jahren aufbewahrt worden waren. Ihre Serum-GH-Konzentrationen waren während dieses Zeitraums erhöht gewesen (Tabelle 1).

Die Patientin wurde zur transsphenoidalen Operation überwiesen, die am 15. Januar 1981 durchgeführt wurde. Sieben Wochen nach der Operation wurde festgestellt, dass sie immer noch an Akromegalie litt; der GH-Serumspiegel lag bei 52 μg/L, und der IGF-I-Wert war mit 7,7 U/mL immer noch erhöht.

Im Rahmen einer laufenden Zusammenarbeit wurden die pathologischen Proben der Hypophyse an Dr. Kalman Kovacs (St. Michael’s Hospital, Toronto, Kanada) geschickt. Einige Zeit später rief mich Dr. Kovacs an, um mir die Ergebnisse seiner Untersuchung des Gewebes mitzuteilen. Aus seinem Bericht ging hervor, dass dieser Patient eine somatotrophe Hyperplasie und keinen Hypophysentumor hatte. Die Gründe, die zu dieser Diagnose führten, waren: 1) das Retikulinmuster war erhalten (bei Tumoren wird es zerstört) (Abb. 1); 2) es überwogen die Somatotrophen, obwohl Thyreotrophe, Gonadotrophe und Kortikotrophe dazwischen lagen; und 3) die Elektronenmikroskopie der Somatotrophen zeigte ein gut entwickeltes endoplasmatisches Retikulum und einen Golgi-Apparat, was auf eine aktive Hormonsynthese hindeutet (Abb. 2). Da die Somatotrophe dicht mit sekretorischen Granula gepackt waren, deutete dies für mich darauf hin, dass dies die Hemmung der Hormonausschüttung durch die Rückkopplung von sezerniertem GH widerspiegelt, vermutlich durch die Verstärkung der Somatostatin-Sekretion (und/oder IGF-I).

Auf der Grundlage der Hypophysenhistologie war es klar, dass die Hypophyse durch einen extrinsischen Faktor stimuliert wurde. Es war unwahrscheinlich, dass dies auf eine Mutation im GHRH-Rezeptor oder eine konstitutive Aktivierung des an den GHRH-Rezeptor gekoppelten G-Proteins zurückzuführen war, da dies wahrscheinlich in einer einzigen Zelle geschehen würde, was zur Tumorentwicklung und zum Zusammenbruch des Retikulinmusters führen würde. Daher war es viel wahrscheinlicher, dass die Hypophyse durch einen extrinsischen Faktor stimuliert wurde, entweder durch GHRH aus dem Hypothalamus oder aus der Peripherie. Zweitens machte es die anhaltende Akromegalie zwingend erforderlich, dass wir die Ursache der Akromegalie dieses Patienten herausfinden. Zu dieser Zeit berichtete ein Artikel von Frohman et al. (2) über die teilweise Reinigung und Charakterisierung eines Peptids mit GH-freisetzender Aktivität aus extrahypophysären Tumoren von akromegalen Patienten.

Eine abdominale Computertomographie zeigte einen Tumor von 5 cm Durchmesser im Schwanz der Bauchspeicheldrüse. Am 26. August 1981 wurde der Tumor entfernt. Er war gut eingekapselt, und die histologische Untersuchung ergab, dass es sich um einen Inselzelltumor handelte. Der Tumor war jedoch weder ein β- noch ein α-Zelltumor. Er war stark positiv für neuronenspezifische Enolase, und bei der Immunfärbung war er negativ für GH, Insulin, Glucagon, Calcitonin und ACTH, mit einer mehrdeutigen Färbung für Somatostatin.

Der Tumor enthielt laut Immunzytochemie kein GH. In den ersten 2 Stunden nach der Tumorentfernung kam es zu einem raschen Abfall des GH-Serumspiegels von 70 μg/L auf 3 μg/L (Abb. 3) (3). Die Patientin wird nun seit 18 Jahren beobachtet und ist nach wie vor von ihrer Akromegalie geheilt.

Die nächste Frage war, was mit dem Pankreastumor geschehen sollte. Zu dieser Zeit hatte ich das Glück, den verstorbenen Dr. Michael Cronin als Kollegen an der Universität von Virginia zu haben. Michael kam mit mir in den Operationssaal, um uns bei der Umsetzung unserer sorgfältig ausgearbeiteten Strategie für den Umgang mit dem Tumor zu helfen. Die Hälfte des Tumors wurde in Würfel geschnitten und sofort in flüssigen Stickstoff gelegt, die andere Hälfte wurde für die Gewebekultur vorbereitet. Die andere Hälfte wurde für die Gewebekultur vorbereitet. Letztere wurde an mehrere Gruppen geschickt, die Experten für die Herstellung stabiler Zelllinien waren. Michael Cronin konnte zeigen, dass das Medium, in dem dieser Tumor gebadet wurde, GHRH-Aktivität enthielt und die Adenylatzyklase stimulierte (4). Der Tumor wurde zunächst Dr. Wylie Vale am Salk Institute (La Jolla, CA) zur Verfügung gestellt, der einen Teil davon an Dr. Guillemin weitergab. Die beiden Gruppen stellten unabhängig voneinander fest, dass er eine hohe GHRH-Aktivität enthielt, und konnten das GHRH aus dem Tumor isolieren, charakterisieren und sequenzieren (5-8). GHRH aus diesem Tumor war ein 40-Aminosäuren-Peptid, das Homologie mit Mitgliedern der Glucagon/Sekretin/VIP-Peptidfamilie aufweist.

Ich wählte die Endokrinologie als mein Spezialgebiet, weil meine Mentoren mir die Bedeutung der Anwendung der Physiologie für das Verständnis der Pathophysiologie und der Therapie von Patienten mit endokrinen Erkrankungen einprägten.

Jeder Patient, den man sieht, ist ein Experiment der Natur. Ich hatte das große Glück, dass mir dieser Patient überwiesen wurde, der es mir und meinen Kollegen ermöglichte, den Tumor zwei führenden Gruppen zur Verfügung zu stellen, die dann in der Lage waren, das lange gesuchte GHRH zu isolieren, zu charakterisieren und zu sequenzieren. In der Tat war GHRH eines der ersten Hypothalamus-Hormone, nach denen gesucht wurde, aber es gab viele Fehlversuche.

Es gab mehrere Gründe, warum es 1982 möglich war, GHRH erfolgreich zu charakterisieren und zu sequenzieren. Erstens waren die Methoden zur Bewertung der Aktivität von Tumorextrakten verfeinert worden und waren viel empfindlicher. Zweitens waren die Methoden für die Mikrosequenzierung in den letzten 10 Jahren stark verbessert worden. Der dritte und wahrscheinlich wichtigste Grund war jedoch, dass dieser Tumor hohe Konzentrationen von GHRH und sehr wenig Somatostatin enthielt. Somatostatin hemmt die GH-Freisetzung im Bioassay, so dass seine Anwesenheit die Überwachung der Reinigung von GHRH erschwerte. Der Extrakt aus diesem Tumor vereinfachte den Prozess erheblich (da er hohe Konzentrationen von GHRH und wenig Somatostatin enthielt), verglichen mit früheren Versuchen, bei denen Hunderttausende von tierischen Hypothalamis verwendet wurden, die reich an Somatostatin waren und nur sehr geringe Konzentrationen von GHRH enthielten. Dies war das erste Beispiel dafür, dass ein einzelner menschlicher Tumor zur Identifizierung und Isolierung eines Hormons verwendet wurde. Das PTH-verwandte Protein wurde mit einer ähnlichen Technik unter Verwendung einer menschlichen Tumorzelllinie isoliert.

Als Kliniker haben wir alle die Verantwortung, Experimente der Natur zu erkennen und die Gelegenheit zu nutzen, Fragen zu stellen, die auf andere Weise nur sehr schwer zu beantworten wären. Die Experimente der Natur sind oft einzigartig, und sicherlich lieferten die 15 oder 20 Patienten, die vor diesem einen Patienten kamen, Hinweise darauf, dass ein Tumor von einem Patienten mit ektopischer GHRH-Sekretion die Frage nach der Natur und Struktur von GHRH beantworten könnte. Tatsächlich wurde die Gruppe von Dr. Guillemin später auf einen anderen Tumor von Dr. Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Frankreich) aufmerksam, und da sie mehr Gewebe von diesem Tumor hatten, untersuchten sie ihn intensiver als den aus Charlottesville. Es war jedoch der ursprüngliche Tumor von Charlottesville, der darauf hindeutete, dass ein solcher Tumor der Schlüssel zur Suche nach GHRH sein könnte.

Die anschließende Untersuchung der Physiologie von GHRH und seines therapeutischen Potenzials zur Behandlung von GH-Mangel bei Kindern war in den letzten 17 Jahren der Schwerpunkt der Arbeit unserer Gruppe (9, 10). Zunächst verabreichten wir normalen Freiwilligen GHRH und wiesen seine Wirksamkeit und Spezifität bei der Erhöhung der GH-Konzentrationen im Serum nach (11). Anschließend bestimmten wir die GH-Antwort auf eine akute Injektion von GHRH bei Kindern mit idiopathischem GH-Mangel (Abb. 4). Bei vielen der Kinder kam es zu einem sehr starken Anstieg der GH-Konzentration, während bei einigen ein geringer oder gar kein Anstieg zu verzeichnen war (12); die Reaktion auf GHRH war stärker als auf Arginin und L-Dopa. Aufgrund dieser Ergebnisse vermuteten wir, dass viele Kinder mit idiopathischem GH-Mangel in Wirklichkeit an GHRH-Mangel leiden.

Daraufhin wurde eine multizentrische Studie zur Behandlung mit GHRH eingeleitet. Dies erschien besonders geeignet, da das zur Behandlung des GH-Mangels verwendete GH aus Leichen gewonnen wurde und in die Übertragung der Jacob-Creutzfeld-Krankheit verwickelt war. Insgesamt wurden 24 Kinder behandelt; bei 10 Kindern wurde eine Pumpe verwendet, um alle drei Stunden einen sc GHRH-Bolus zu verabreichen. Dieser Weg und diese Dosis wurden gewählt, um die normale Physiologie von etwa einem GH-Impuls alle drei Stunden bei Kindern im Wachstum nachzuahmen. Darüber hinaus wurden 10 Kinder nur über Nacht alle 3 Stunden mit der Pumpe behandelt, und 4 Kinder erhielten zweimal täglich sc-Injektionen von GHRH. Die Wachstumsgeschwindigkeiten der Kinder vor und nach 6 Monaten unter der Behandlung sind in Abb. 5 dargestellt (13).

Aufgrund der Ergebnisse dieser Studie initiierte Serono Laboratories, Inc. eine 12-monatige multizentrische Studie mit GHRH(1-29)-NH2, das einmal täglich sc verabreicht wurde (14). Bei den Kindern, die am langsamsten wuchsen, war der Anstieg der Wachstumsgeschwindigkeit am größten (Abb. 6). Dies deutet darauf hin, dass GHRH die physiologische GH-Sekretion wiederherstellen kann. GHRH ist von der Food and Drug Administration sowohl für die Diagnose als auch für die Behandlung von GH-Mangel bei Kindern zugelassen. GHRH ist sicher und beschleunigt die Wachstumsgeschwindigkeit bei den meisten Patienten mit GH-Mangel.

Zu der Zeit, als GHRH synthetisiert wurde, gab es ein großes Interesse an der Herunterregulierung der Gonadotropinantwort auf das Gonadotropin-Releasing-Hormon. Wir waren fasziniert von einer Beobachtung bei einem anderen Patienten mit ektopischer GHRH-Sekretion aus einem metastasierenden Karzinoid-Tumor, der zu Akromegalie führte. Trotz anhaltend erhöhter GHRH-Spiegel während des gesamten 24-Stunden-Zeitraums war das Muster der GH-Freisetzung immer noch pulsierend, was darauf hindeutet, dass vermutlich andere Faktoren an der Regulierung des pulsierenden Musters der GH-Sekretion beteiligt sind (15). Es wurde vermutet, dass dies auf den Entzug von Somatostatin zurückzuführen sein könnte. Somit zeigt die ektopische GHRH-Sekretion eindeutig, dass ein lang wirkender GHRH-Agonist die pulsierende GH-Sekretion steigern kann. Studien zur kontinuierlichen intravenösen GHRH-Infusion bei normalen Probanden zeigen dasselbe Phänomen, und somit ist klar, dass ein Depotpräparat von GHRH ein nützliches therapeutisches Mittel sein kann.

Unsere Gruppe (16) und Mayo (17) klonierten den GHRH-Rezeptor. Interessanterweise gehört der GHRH-Rezeptor zur B-Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, zu denen auch die Rezeptoren für die Peptidfamilie Glucagon/Sekretin sowie CRH, Calcitonin und Parathormon gehören. Ihre Struktur ist völlig anders als die der größeren Rhodopsin-Rezeptoren (A-Familie). Allerdings gibt es auch in dieser Rezeptorfamilie sieben transmembranüberspannende Domänen.

Die kritische Rolle von GHRH wird durch die Zwerg-Lit-Maus demonstriert, die eine Punktmutation im GHRH-Rezeptor aufweist (18, 19). Wajnrajch et al. (20) beschrieben eine Nonsense-Mutation (Glu 72stop) im menschlichen GHRH-Rezeptor, die bei zwei Kindern aus derselben indischen muslimischen Familie Wachstumsstörungen und GH-Mangel verursachte. Maheshwari et al. (21) haben eine Verwandtschaft im Sindh-Tal in Pakistan mit der gleichen Mutation beschrieben. Die Mitglieder dieser Verwandtschaft sind extrem kleinwüchsig. Eine weitere Mutation im Rezeptor wurde in einer großen brasilianischen Verwandtschaft beschrieben, die über 110 Personen mit schwerem GH-Mangel und extremer Kleinwüchsigkeit umfasst (22). Diese Naturversuche zeigen, dass ein Defekt im GHRH-Rezeptor das normale Wachstum beeinträchtigt und unterstreichen die lebenswichtige Bedeutung von GHRH.

Eine Karikatur des GHRH-Rezeptors ist in Abb. 7 dargestellt (10). Die Asparaginsäure an Position 60 des Startcodons ist die Stelle der lit-Maus-Mutation. Western Blotting mit einem C-terminalen GHRH-Rezeptor-Antiserum, das gegen ein Peptid, das auf der Sequenz des menschlichen GHRH-Rezeptors basiert, hergestellt wurde, wurde verwendet, um Membranen von HEK293-Zellen zu untersuchen, die mit komplementärer DNA für den GHRH-Rezeptor transfiziert wurden. Die Studien deuten darauf hin, dass der lit-Maus-Rezeptor in Protein übersetzt wird und tatsächlich in der Membran von Hypophysenzellen der lit-Maus vorhanden ist. Wir haben vorgeschlagen, dass diese Mutation zu einer Veränderung in der Tertiärstruktur des Rezeptors führt, die die Bindung verhindert (23). Die Verwendung von Photoaffinitätssonden deutet darauf hin, dass sich andere Stellen in unmittelbarer Nähe zum gebundenen GHRH befinden, was darauf hindeutet, dass für die Signaltransduktion wahrscheinlich mehrere Interaktionsstellen erforderlich sind. Die Verfügbarkeit des rekombinanten Rezeptors macht die Suche nach nicht-peptidischen GHRH-Agonisten möglich.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Wissen, das aus der sorgfältigen Beobachtung eines einzigen Patienten mit Akromegalie gewonnen wurde, zur Isolierung, Charakterisierung und Synthese von GHRH führte. Weitere Studien führten zur Einführung der GHRH-Behandlung des GH-Mangels. Anschließend gelang es uns und anderen, den Rezeptor für GHRH zu klonen. Studien mit GHRH haben bestätigt, dass es für die GH-Synthese und das normale Wachstum unerlässlich ist. Diese Position wird nun durch die Beobachtung bestätigt, dass Mutationen des GHRH-Rezeptors, die zu seiner Inaktivierung führen, zu tiefgreifendem GH-Mangel und schwerem Kleinwuchs führen und den Kreis unseres Verständnisses der GH-Regulation durch GHRH schließen.

Danksagung

Ich danke meinen vielen Kollegen, die wichtige Beiträge zu dieser Arbeit geleistet haben, sowie Frau Suzan Pezzoli für die Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Diese Arbeit wurde teilweise von den NIH Grants HD-13197, DK-32632 und DK-45350 (für M.O.T.) und Grant RR-00847 (für das General Clinical Research Center und das CDMAS Laboratory an der University of Virginia) unterstützt.