Einfache unbalancierte Translokationen und Inversionen (Klassen A und C): Entstehungsmechanismen

Das eindeutige Ergebnis dieser Studie ist, dass in 20 von 37 der de novo unbalancierten Translokationen die Duplikation einen mütterlichen Ursprung hat (Abb. 1, Online Ressource 1: Tabelle S2). Da die Untersuchung des elterlichen Ursprungs in sechs Fällen nicht informativ oder nicht möglich war (Fälle 7, 14, 23, 24, 33 und 35), stellen die de novo unbalancierten Translokationen, bei denen die duplizierte Region mütterlichen Ursprungs ist, 64,5 % (20/31) der vollständig informativen Fälle dar. Kombiniert man diese Daten mit der Feststellung, dass in acht dieser Fälle (Fälle 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 und 32) drei Allele (Abb. 1, Online-Ressource 1: Tabelle S2), zwei mütterliche und ein väterliches, zumindest in einem Teil der Duplikationsregion vorhanden waren, ergibt sich das Szenario, dass in nicht weniger als 25 % (8 von 31) eine mütterliche meiotische Nicht-Disjunktion, gefolgt von einer partiellen Trisomie-Rettung des überzähligen mütterlichen Chromosoms, der Hauptgrund für das Auftreten von de novo unbalancierten Translokationen ist (Abb. 1a). Die wahrscheinlichste Erklärung für das Vorhandensein von drei Allelen innerhalb der duplizierten Region, zwei mütterliche und ein väterliches, wäre eine Nicht-Disjunktion in der mütterlichen Meiose I (mat-MI) (Abb. 1A.I). Alternativ muss eine meiotische Rekombination proximal zum oder am Translokationsbruchpunkt einer Nicht-Disjunktion in der mütterlichen Meiose II (mat-MII) vorausgegangen sein. Im Gegensatz dazu können in den 12 Fällen (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 und 37) mit demselben mütterlichen duplizierten Haplotyp andere Mechanismen nicht ausgeschlossen werden (Abb. 1b), obwohl sie auch entweder aus einer mat-MI-Nicht-Disjunktion (Abb. 1A.I), nach einem telomeren Crossover, entsprechend dem bevorzugten Auftreten von telomeren Crossovers, das für einige nicht disjoinierte Chromosomen nachgewiesen wurde (Oliver et al. 2014) oder einer maternalen MII (mat-MII)-Nicht-Disjunktion (Abb. 1A.II), wie sie in einer Reihe von Fällen von Trisomie-Rettung berichtet wurde (besprochen in Chantot-Bastaraud et al. 2017).

Es ist bekannt, dass die Anaphase-Verzögerung des überzähligen Chromosoms, gefolgt von seinem Einfangen in einem Mikronukleus, die Grundlage vieler Chromothripsis-Ereignisse ist (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Infolgedessen wird in einer Tochterzelle das überzählige Chromosom eliminiert, während in der anderen Zelle die Zertrümmerung des mikronukleären Genommaterials, gefolgt von der Wiedereinbettung aller oder einiger Fragmente in den Hauptkern, zu einer massiven Reorganisation des ursprünglichen Chromosoms führen kann, das entweder den Großteil seines Materials beibehält, wenn auch in einer neuen Reihenfolge, oder einige seiner Teile verliert (Abb. 1a). Welche Teile des ursprünglichen überzähligen Chromosoms verloren gehen und welche erhalten bleiben, könnte von stochastischen Ereignissen abhängen, von der Neigung der abgebrochenen Enden, sich miteinander oder mit anderen Teilen des Genoms zu verbinden, und/oder von der anschließenden Auswahl der Zellen, die bei minimalen segmentalen Ungleichgewichten überleben und sich vermehren können. Theoretisch können zentrische Fragmente als überzählige Markerchromosomen durch ihre Zirkularisierung mit Bildung von Ringchromosomen erhalten werden, wodurch das Fehlen der telomeren Sequenz an beiden Enden überwunden wird. Die Erhaltung supernumerärer interstitieller azentrischer Fragmente erfordert ebenfalls die Bildung eines Neozentromers oder alternativ die Einnahme des Fragments durch ein anderes Chromosom mit der Bildung einer de novo Insertionstranslokation. In der Tat berichteten Kato et al. (Kato et al. 2017) kürzlich über einen Fall von de novo interstitieller Translokation, die durch Chromothripsis eines überzähligen Chromosoms in einer trisomischen Zygote entstand. Schließlich erfordert die Erhaltung überzähliger Fragmente, die an einem Ende mit einem Telomer ausgestattet sind, entweder ein Telomer-Capture, z. B. ein transloziertes überzähliges Marker-Chromosom, wie in Vetro et al. (2012) berichtet (Fälle 2 und 3), oder sein Capture durch ein anderes Chromosom, das Empfängerchromosom, das seinen distalen Teil verliert, wodurch eine 46-chromosomale Zelle mit einer unausgewogenen de novo-Translokation entsteht, wie hier beschrieben. Der Fall 6 mit der Duplikation desselben mütterlichen Haplotyps (Abb. 1, Online-Ressource 1: Tabelle S2) veranschaulicht das Auftreten eines Chromothripsis-Ereignisses (Abb. 1a), das durch das Vorhandensein zweier nicht zusammenhängender duplizierter Regionen, die durch ~ 1,3 Mb voneinander getrennt sind, gezeigt wird, von denen die interstitielle eine invertierte Orientierung aufweist (Online-Ressource 2: Abbildung S15). Chromothripsis-Ereignisse wurden in einer Reihe von Fällen von de novo unbalancierten Translokationen beobachtet (Weckselblatt et al. 2015), und die meisten von ihnen sind väterlichen Ursprungs und betreffen mehr als zwei Chromosomen (Marcozzi et al. 2018). Im Gegensatz dazu war die unbalancierte Translokation in unserem Fall 6 mütterlichen Ursprungs und tatsächlich de novo, was mit FISH-Untersuchungen der elterlichen Metaphasen übereinstimmt. Außerdem betraf sie, zumindest nach den hochauflösenden (1M) aCGH- und FISH-Untersuchungen, nur zwei Chromosomen, während eine komplexere Umlagerung ausgeschlossen wurde. Daher liegt die Vermutung nahe, dass die Zygote oder der frühe Embryo aufgrund einer meiotischen oder postzygotischen mütterlichen Nicht-Disjunktion trisomisch für Chromosom 8 war. Auf die Zertrümmerung des überzähligen Chromosoms 8 folgte die Wiederherstellung von nur zwei nicht zusammenhängenden Abschnitten, einschließlich des telomeren Abschnitts, die, als sie bereits wieder zusammengenäht waren, vom 18q des Empfängers übernommen wurden (Abb. 1a).

Das Modell der Entstehung der de novo unbalancierten Translokationen, ausgehend von einer trisomischen Zygote, passt auch zum Fall 24, obwohl wir keine unterstützenden molekularen Untersuchungen durchführen konnten. Das Vorhandensein einer Restzelllinie, die trisomisch für Chromosom 9 ist, zusammen mit einer Hauptzelllinie mit normalem Karyotyp und einer dritten Zelllinie mit der unbalancierten t(14;9)-Translokation lässt jedoch darauf schließen, dass sich ausgehend von einer trisomischen Zygote verschiedene Zelllinien bilden können, einige mit dem vollständigen Verlust des überzähligen Chromosoms und andere mit dem Verlust eines Teils davon (9p) und dem verbleibenden Teil (das gesamte 9q), der von einem anderen Chromosom übernommen wird. Diese Art von Mosaik aus drei Zelllinien wurde selten dokumentiert (Phillips et al. 1997), aber in der Pränataldiagnostik sind Mosaike mit einer normalen Zelllinie und einer zweiten mit einer de novo unbalancierten Translokation relativ häufig, und in den meisten von ihnen kann ein erhöhtes mütterliches Alter nachgewiesen werden (Kovaleva und Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).

Eine unabhängige Unterstützung für die Hypothese, dass mütterliche Nicht-Disjunktion ein Hauptauslöser für de novo unbalancierte Translokationen ist, ist ein erhöhtes mütterliches Alter. In der Tat wurde in unseren acht Fällen (Fälle 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 und 32), in denen die Duplikation zweifelsfrei mit einer mütterlichen meiotischen Nicht-Disjunktion (zwei verschiedene mütterliche Allele innerhalb der Duplikationsregion) verbunden war, ein Anstieg des durchschnittlichen mütterlichen Alters dokumentiert (34,75 Jahre, Online-Ressource 1: Tabelle S1), wenn man berücksichtigt, dass das durchschnittliche mütterliche Alter in Italien im Jahr 2016 bei 31,8 Jahren lag (ISTAT, https://www.istat.it/). Eine Erhöhung (33,5 Jahre) wurde auch in den 12 Fällen (Fälle 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 und 37) mit Duplikation desselben mütterlichen Allels festgestellt, was mit einer mütterlichen Nicht-Disjunktion als auslösendem Ereignis vereinbar ist. Selbst in den Fällen, in denen die Duplikation väterlicherseits war, wurde ein Anstieg des mittleren mütterlichen Alters (32,6 Jahre) festgestellt, wenn auch in geringerem Maße, was möglicherweise darauf hinweist, dass andere Mechanismen als die mütterliche Nicht-Disjunktion bei der Entstehung dieser unausgewogenen Translokationen eine Rolle spielen. In der Tat war in den vier Fällen (3, 8, 29 und 36), die mittels SNP-Array analysiert wurden, keine mütterliche Hetero-Isodisomie im nicht duplizierten Teil der homologen Chromosomen vorhanden (Online-Ressource 1: Tabelle S2), wie man es für eine trisomische Zygote erwartet hätte, in der das überzählige väterliche Chromosom eine Chromothripsis mit der Rettung nur des telomeren Teils durchlaufen hatte. Berücksichtigt man außerdem die vernachlässigbare Häufigkeit von Trisomien, die auf eine Fehlverteilung in der väterlichen Meiose zurückzuführen sind (Nagaoka et al. 2012), erscheint das Auftreten von unausgewogenen Translokationen, die durch eine partielle trisomische Rettung einer trisomischen Zygote väterlichen Ursprungs ausgelöst werden, höchst unwahrscheinlich. Stattdessen scheinen andere Mechanismen, wie ein vererbter oder postzygotischer väterlicher Doppelstrangbruch, der durch Telomererfassung repariert werden muss, plausibler (Abb. 1b). Tatsächlich passt der Fall 25, der ein Mosaik für zwei Zelllinien im Blut und in Fibroblasten darstellt, mit einer terminalen 2q-Deletion und einem derivativen Chromosom der(2)t(2q;14q) väterlichen Ursprungs (Online-Ressource 2:Abbildung S9), zu dieser Hypothese. Bei Vorliegen einer terminalen Deletion können also verschiedene Reparaturmechanismen zu unterschiedlichen Zeiten in verschiedenen Zellen des frühen Embryos ablaufen, was schließlich zu einem Mosaikzustand führt. In diesem Modell leitet das deletierte Chromosom die Translokation ein und fungiert als Empfänger, während das duplizierte Chromosom der Spender ist und als Reparaturmechanismus für Verletzungen fungiert (Abb. 1b). Es ist jedoch nicht möglich zu erkennen, ob die Deletion tatsächlich das erste Ereignis ist, das zur Translokation führt, oder ob sie stattdessen sekundär zur Bildung eines dizentrischen Chromosoms ist (Abb. 1BIII und IV), das infolge seines asymmetrischen Bruchs ein inv-dup del-Chromosom und ein einfaches deletiertes Chromosom erzeugt, wobei letzteres dann durch Telomereinfang repariert wird (Abb. 1b). Es ist möglich, dass die Persistenz des dizentrischen Chromosoms über die ersten embryonalen Teilungen hinaus zu einem Bruch unterschiedlicher Größe in den verschiedenen Zellen führt, der wiederum entweder durch Telomerase oder Telomereinfang repariert wird.

Unabhängig vom Mechanismus wurde bemerkenswerterweise eine hohe Prävalenz von Fällen festgestellt, in denen beide Ungleichgewichte denselben elterlichen Ursprung haben (Abb. 1, Online-Ressource 1: Tabelle S2), obwohl ein biparentaler Ursprung von Deletion und Duplikation in der Hälfte der Fälle zu erwarten wäre, entsprechend einem postzygotischen Endereignis. Der Nachweis einer deutlichen Kompartimentierung der beiden elterlichen Chromosomensätze in Mäuseembryonen bis zum 8-Zell-Stadium (Du et al. 2017) könnte eine Erklärung liefern. Da dieser Zeitraum mit einer sehr hohen chromosomalen Instabilität zusammenfällt (McCoy et al. 2017), ist es verlockend zu spekulieren, dass ein Mechanismus wie das Telomer-Capture, das für die Stabilisierung einer früheren strukturellen Anomalie notwendig ist, auf demselben elterlichen Chromosomensatz der ursprünglichen Anomalie stattfindet. Im Gegensatz dazu würde man erwarten, dass weitere spätere Neuanpassungen zufällig auftreten und Chromosomen beider Elternteile betreffen, was zu einem unausgewogenen translozierten Chromosom biparentalen Ursprungs führen würde, wie wir es in fünf Fällen gefunden haben (Fälle 10, 12, 27, 30 und 31; Abb. 1, Online-Ressource 1: Tabelle S2).

Wie bei den Klasse-C-Umlagerungen fanden wir keine Besonderheiten bei den Kreuzungsbruchpunkten, die klären könnten, ob ihre Stabilisierung durch Telomereinfang des Chromosomenabschnitts, der dem gelöschten Abschnitt gegenüberliegt, auf einen anderen Mechanismus zurückzuführen ist als in den Fällen, in denen der Telomereinfang von einem anderen Chromosom abhängig ist. Diese Analyse konnte jedoch nur in zwei Fällen durchgeführt werden. Die Feststellung, dass in 4 von 5 Fällen sowohl die Deletion als auch die Duplikation väterlichen Ursprungs waren, legt nahe, dass sie entweder durch eine ursprüngliche Deletion oder den Bruch eines dizentrischen Chromosoms entstanden sind.

Komplexe unbalancierte Translokationen und Inversionen (Klassen B und D)

Es besteht allgemeines Einvernehmen darüber, dass diese Umlagerungen durch ein intermediäres dizentrisches Chromosom entstehen, das nach seinem asymmetrischen Bruch zu einer inv-dup del und einem einfach deletierten Chromosom führt (Abb. 1B.III). Der Erwerb einer stabilisierenden telomeren Sequenz kann auf verschiedene Weise erfolgen: Telomerase-vermittelte Hinzufügung von de novo TTAGGG-Sequenzen, Telomererfassung des distalen Abschnitts eines anderen Chromosoms (Yu und Graf 2010) oder des gegenüberliegenden Abschnitts desselben Chromosoms (Buysse et al. 2009; Fan und Siu et al. 2001) oder sogar Bildung eines Ringchromosoms (Rossi et al. 2008). Die beiden translozierten inv-dup del(8p)-Fälle, die wir genotypisieren konnten (Fälle 42 und 44), entstanden, wie erwartet (Giglio et al. 2001), durch NAHR bei mat-MI, was durch das Vorhandensein von zwei mütterlichen und einem väterlichen Allel in der 8p-Duplikationsregion belegt wird (Online-Ressource 1: Tabelle S2). Diese wiederkehrende abnorme Rekombination wird durch hochgradig identische segmentale Duplikationen auf 8p23 innerhalb eines normalen und eines invertierten Chromosoms 8 vermittelt (Giglio et al. 2001). In der Zygote wird das resultierende dizentrische Chromosom wahrscheinlich in verschiedenen Zellen unterschiedliche Bruchereignisse erfahren, was manchmal zu einem Mosaikzustand mit einer del(8p)-Zelllinie und einer zweiten mit dem inv-dup del(8p) führt (Hand et al. 2010), oder in Ausnahmefällen sogar zu einer dritten, bei der das inv-dup del(8p) mit der distalen Region eines anderen Chromosoms endet (Pramparo 2004). Diese Mosaike werden in der Pränataldiagnostik häufiger entdeckt, während im postnatalen Leben eine einzelne Zelllinie mit dem inv-dup del(8p), entweder transloziert oder nicht, zumindest im Blut der häufigste Befund ist. In unseren drei translozierten Fällen (Fälle 42, 43 und 44) wurden die Telomere von 6q, 17p bzw. Xq gespendet, die alle mütterlichen Ursprungs waren und den gleichen Duplikationshaplotyp der mütterlichen Chromosomen 6, 17 und X aufwiesen, wie es für ein postzygotisches Stabilisierungsereignis zu erwarten war. In den übrigen drei Fällen (Fälle 39, 40 und 45), die wie alle inv-dup del-Rearrangements ohne Beteiligung von 8p nicht wiederkehrend sind, war das translozierte inv-dup väterlichen Ursprungs mit identischen väterlichen Allelen in der Duplikationsregion, während das Telomer-Capture in zwei Fällen von einem väterlichen Chromosom bereitgestellt wurde (Fälle 39 und 49, Online-Ressource 2: Abbildungen S3, S4) und ein mütterliches im dritten Fall (Fall 45), einem Fötus, bei dem das translozierte Chromosom t(inv-dup5p;3q) im Mosaik mit einer Zelllinie lag, die ein nicht-transloziertes inv-dup del(5p) enthielt (Online-Ressource 2: Abbildung S12). Bemerkenswert ist, dass die 5p-Duplikation in den beiden Zelllinien unterschiedlich groß ist (Online-Ressource 1: Tabelle S1), was in der Tat zeigt, dass das ursprüngliche dizentrische Chromosom, das vermutlich in der Zygote oder im sehr frühen Embryo vorhanden war (Abb.

Identische duplizierte Allele wurden in allen inv-dup del-Rearrangements, an denen 8p nicht beteiligt ist, nachgewiesen, was auf einen intrachromosomalen Ursprung dieser Rearrangements hinweist (Hermetz et al. 2014). Dementsprechend scheinen diese inv-dup-translozierten Rearrangements das Endergebnis eines anfänglichen mitotischen Ereignisses zu sein, möglicherweise im frühen Embryo (Voet 2011), wie z. B. eines Doppelstrangbruchs, gefolgt von intrastrand pairing an relativ nahen Stellen invertierter homologer Sequenzen, was zur Erzeugung des dizentrischen Chromosoms mit einer dazwischen liegenden normalen Kopierregion führt (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Wie bereits erwähnt, kann das reziproke Produkt der inv-dup del, d.h. ein deletiertes Chromosom, durch die Aufnahme des distalen Teils eines nicht-homologen Chromosoms oder des gegenüberliegenden Arms desselben Chromosoms repariert und stabilisiert werden, was zu einer einfachen unbalancierten Translokation bzw. Inversion führt, wie wir für einige der in den Klassen A und C aufgeführten Rearrangements vorschlagen (Abb. 1b).

Breakpoint junctions

Die Sequenzierung von Breakpoint-Translokationsverbindungen konnte in 26 Fällen durchgeführt werden (Online-Ressource 1: Tabelle S1, Online-Ressource 2: Abbildung S1), obwohl in 4 Fällen die kryptische Komplexität (Fälle 4, 10, 28 und 51) eine feine Sequenzierung behinderte. In 16 Fällen (Fälle 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 und 52) wurden Merkmale der alternativen nicht-homologen Endverknüpfung (alt-NHEJ) oder der mikrohomologievermittelten bruchinduzierten Replikation (MMBIR) wie Mikrohomologien und schablonenhafte oder nicht-schablonenhafte kleine Insertionen nachgewiesen (Online-Ressource 2: Abbildung S1). Bemerkenswert ist, dass in den Fällen 18 und 40 die Umlagerung zwar innerhalb von Alu-Sequenzen stattfand, aber das Vorhandensein einer 5 bp kurzen Template-Insertion bzw. einer 4 bp Mikrohomologie zeigte, dass die Umlagerung nicht durch einen NAHR-vermittelten Mechanismus, sondern eher durch eine alt-NHEJ oder MMBIR zustande kam. Kanonische NHEJ (c-NHEJ, blunt ends junctions) trat in vier Fällen auf (Fälle 26, 29, 31 und 43). In den Fällen 2 und 38 befanden sich die Bruchpunktverbindungen am Rand des homologen Retrotransposons (Online-Ressource 2: Abbildung S13). Dieser Befund deutet darauf hin, dass in einer Minderheit der Fälle Reparaturmechanismen wie das Einfangen des Telomers durch diese Sequenzen erleichtert werden. Obwohl Robberecht et al. feststellten, dass die meisten ihrer de novo unbalancierten Translokationen durch NAHR zwischen LINEs, HERVs oder segmentalen Duplikationen vermittelt wurden (Robberecht et al. 2013), können wir ein NAHR-Ereignis zumindest in Fall 2 ausschließen, wo das Vorhandensein von zwei duplizierten mütterlichen Haplotypen, von denen einer auf das Empfängerchromosom transloziert wurde, eindeutig auf eine mat-MI-Nicht-Disjunktion hinweist (Abb. 1, Online-Ressource 1: Tabelle S2), was es unmöglich macht, die Translokation einem meiotischen Ereignis zuzuschreiben. In der Tat wurde gezeigt, dass LINE-1-vermittelte Retrotranspositionsereignisse in somatischen Zellen des frühen menschlichen Embryos, in menschlichen embryonalen Stammzellen und zumindest bei Mäusen hauptsächlich in der Embryogenese auftreten (für eine Übersicht Kazazian und Moran 2017), was dafür spricht, dass die Bildung der Translokation in unseren Fällen auch ein postzygotisches Ereignis war.

Kombiniert deuten diese Merkmale darauf hin, dass reparaturbasierte Mechanismen (c-NHEJ und alt-NHEJ) und replikative Reparaturmechanismen (MMBIR) für die Verbindung des Spenderchromosoms mit dem Empfängerchromosom oder dem gegenüberliegenden Teil desselben Chromosoms verantwortlich sind (Abb. 1).

Genotyp-Phänotyp-Beziehung

Obwohl Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei großen unbalancierten Rearrangements, wie sie in unserer Studie berichtet wurden, im Allgemeinen eher grob sind, fügen die von uns berichteten Daten auch in diesem Zusammenhang einige weitere Details hinzu.

Die starke Evidenz, dass einige unbalancierte Translokationen aus einer Zygote mit einem überzähligen Chromosom stammen, das ein chromothriptisches Ereignis durchläuft, legt nahe, dass die Duplikationsregion, obwohl sie scheinbar nur aus der distalen Region des chromothriptischen Chromosoms besteht, Fragmente aus anderen Teilen enthalten kann, wie es in unserem Fall 6 der Fall ist und wie es von Weckselblatt et al. (2015) gezeigt wurde. In diesen Fällen, wenn die Größe der zerbrochenen Stücke unter der durch Array-CGH nachweisbaren Größe liegt, besteht die Gefahr, den abnormen Phänotyp nur den Genen zuzuschreiben, die dupliziert oder deletiert erscheinen, während die weitere Morbidität auf die abnorme Genexpression zurückzuführen sein kann, die durch die TAD-Disruption verursacht wird (Fukami et al. 2017).

Darüber hinaus könnte bei unbalancierten Translokationen, die aus einer partiellen Trisomie-Rettung entstehen, wenn die Chromotripsie auf dem überzähligen Chromosom väterlichen Ursprungs auftritt, die folgende mütterliche Hetero-/Isodisomie für die verbleibenden zwei Chromosomen weitere Pathogenität erzeugen (Niida et al. 2018), entweder durch die Reduktion von krankheitsverursachenden Varianten, die in der Mutter im heterozygoten Zustand vorhanden sind, auf den homozygoten Zustand, oder durch das Vorhandensein von geprägten Genen, die nur durch das väterliche Allel exprimiert werden.

Als letzte Überlegung ist es verlockend zu spekulieren, dass die Wahl des Telomers, das für die Stabilisierung des gebrochenen Chromosoms erfasst wird, möglicherweise nicht zufällig ist, sondern durch die Deregulierung der ursprünglichen TADs (Topologically Associated Domains) beeinflusst wird, was wiederum ein günstiges Substrat für spezifische interchromosomale Kontakte und räumliche 3D-Chromatin-Kompartimentierung schafft (Dekker und Mirny et al. 2016).