Abstract

Die chronisch aktive Epstein-Barr-Virus-Infektion (CAEBV) ist eine schwere Erkrankung mit ungewöhnlicher EBV-Aktivierung, die über Jahre hinweg andauert, und ihre Pathogenese ist weitgehend unbekannt. Nach der Entwicklung eines genauen und reproduzierbaren Polymerase-Kettenreaktionssystems zur Quantifizierung der EBV-DNA wurde die Viruslast in peripheren Blutlymphozyten (PBL) bei 54 Kindern bestimmt: 15 mit CAEBV, 16 mit infektiöser Mononukleose (IM) und 23 gesunde Kinder. Kinder mit CAEBV und Kinder mit IM wiesen hohe Viruslasten auf. Bei 47 % der seropositiven gesunden Spender wurde eine geringere Viruslast festgestellt. Es gab zwei deutliche Unterschiede zwischen Kindern mit CAEBV und Kindern mit IM: Erstere wiesen eine höhere Virusreplikation auf (103-107 Kopien/PBL)2,5 × 105 PBL) als Kinder mit IM, und die Virusreplikation ging bei Kindern mit IM zurück, während die aktive Replikation bei Probanden mit CAEBV jahrelang anhielt. Anhaltend hohe Viruslasten sind ein mögliches Diagnosekriterium für CAEBV. EBV-Lasten können die Klassifizierung und Prognose von EBV-Infektionen ermöglichen.

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein Erreger der infektiösen Mononukleose (IM) und der chronisch aktiven EBV-Infektion (CAEBV). CAEBV ist eine schwere Erkrankung mit ungewöhnlicher EBV-Aktivierung, die mit multiplem Organversagen tödlich verlaufen kann und ohne vorherige Immunsuppression mit malignen Lymphomen einhergeht. Die klinischen Symptome von CAEBV und die serologischen Anomalien, die einer aktiven EBV-Replikation entsprechen, wie z. B. deutlich erhöhte Anti-EA-DR-Antikörper und das Fehlen von Antikörpern gegen das nukleare Epstein-Barr-Antigen (EBNA), bleiben über Monate bis Jahre bestehen. EBV repliziert in NK-, T- und B-Zellen.

Ist die Infektion einmal etabliert, verbleibt EBV in der Regel ein Leben lang in B-Lymphozyten, ohne klinische Symptome zu verursachen (als latente Infektion bezeichnet). Daher ist nicht nur der Nachweis, sondern auch die Quantifizierung von EBV in den betroffenen Geweben von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung von EBV-Erkrankungen.

Um den Status der EBV-Replikation bei Personen mit CAEBV zu klären, haben wir die semiquantitative DNA-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt, um die Viruslast in peripheren Blutlymphozyten (PBL) in drei Gruppen von Kindern zu bewerten und zu vergleichen: eine mit CAEBV, eine mit IM und gesunde Kontrollen. Unser Nachweissystem wurde als genau und zuverlässig für die Quantifizierung von EBV angesehen, da wir eine Single-Copy-Region von EBV amplifizierten. Die meisten früheren Studien zielten auf die BamHI-W-Region ab, bei der die Wiederholungshäufigkeit der Tandemrepeats nicht konstant ist. Wir glauben, dass diese Studie die erste und umfangreichste Studie zur Viruslast in der PBL von Kindern mit CAEBV ist.

Materialien und Methoden

Patienten und Kontrollen

Wir untersuchten 16 Kinder mit IM (11 Jungen, 5 Mädchen; Alter, 0-8 Jahre), 15 mit CAEBV (11 Jungen, 4 Mädchen; Alter, 4-19 Jahre), 19 immunkompetente EBV-seropositive gesunde Personen (10 Jungen, 9 Mädchen; Alter, 1-19 Jahre) und 4 seronegative gesunde Kinder (3 Jungen, 1 Mädchen; Alter, 1-10 Jahre). Alle Probanden mit IM wiesen typische klinische Symptome auf (z. B. Fieber, Tonsillitis, Lymphadenopathie, Hepatosplenomegalie, Leberfunktionsstörung und atypische Lymphozytose). Die Diagnose IM wurde auf der Grundlage des serologischen Nachweises von IgM-Antikörpern gegen virales Capsid-Antigen (VCA) oder der Serokonversion von VCA-IgG und/oder EA sowie negativer EBNA-Antikörper gestellt. Zweiundzwanzig Blutproben wurden von 16 Kindern mit IM 8 Tage bis 8 Monate nach Ausbruch der Krankheit entnommen (das erste Symptom war bei allen Patienten Fieber). CAEBV wurde nach den Kriterien von Rickinson diagnostiziert. Kinder mit CAEBV hatten intermittierendes oder persistierendes Fieber über >16 Monate, mit Hepatosplenomegalie, Lymphadenopathie und/oder Hautausschlag. Die Laborbefunde zeigten erhöhte Transaminasewerte, Anämie, Thrombozytopenie und/oder polyklonale Hypergammaglobulinämie. Die serologische Untersuchung ergab deutlich erhöhte Antikörper-Titer gegen VCA und EA. Eine Infektion mit dem Humanen Immundefizienz-Virus und rheumatische Erkrankungen wurden ausgeschlossen. Keiner der Probanden hatte sich einer Transplantation unterzogen oder eine Krebstherapie erhalten.

Proben

Heparinisierte 2-mL-Proben aus peripherem Blut wurden entnommen. PBL wurden mit Ficoll-Hypaque isoliert und mit 0,15 μg/μL Proteinase K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis) lysiert; die DNA wurde mit Phenol-Chloroform-Ethanol-Fällung extrahiert. Die extrahierte DNA wurde mit einem Spektrophotometer quantifiziert, auf 0,25 μg/μL DNA eingestellt und als PCR-Vorlage verwendet.

PCR-Empfindlichkeit

EBV-DNA stammte aus drei Quellen: Raji, die 50 EBV-Kopien pro Zelle enthalten; Akata, die 20 Kopien pro Zelle enthalten; und geklonte BamHI-L-Fragmente, die mit DNA aus Nabelschnurblutzellen gemischt und als positiver Standard verwendet wurden. Um die Empfindlichkeit des PCR-Systems zu bestimmen, wurden serielle 10-fache Verdünnungen (10°-104 EBV-Kopien) der extrahierten DNA einer PCR unterzogen.

PCR

Eine verschachtelte Doppel-PCR wurde entwickelt, um die konservierte Region zu amplifizieren, die für gp220 kodiert (innerhalb des BamHI-L-Fragments). Das äußere Primerpaar amplifiziert ein 302-bp-Fragment unter Verwendung der Oligonukleotide 5′-GCGAACTGGTGGACACATGA und 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, entsprechend den Positionen 2870-3171 von B95-8 (GenBank M10593). Das innere Paar amplifiziert ein 239-bp-Fragment. Die PCR wurde in einer 50-μL-Reaktion durchgeführt, die 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,5 μM von jedem Primer, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Boehringer-Mannheim) und 4 μL Proben-DNA enthielt. Die amplifizierten Produkte wurden auf 2 % Agarose laufen gelassen und mit Ethidiumbromid angefärbt. Zur Bestätigung der Spezifität wurde ein Southern Blotting durchgeführt, bei dem das BamHI-L-Fragment als Sonde verwendet wurde. Jede PCR-Reaktion wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt und umfasste auch die Negativkontrolle, um eine Kreuzkontamination auszuschließen. Um die Spezifität der PCR zu bestätigen, wurde die DNA von Herpes Simplex Virus Typ 1 und 2, Varizella-Zoster-Virus, Humanes Cytomegalovirus und Humanes Herpesvirus 6 und 7 analysiert. Es wurde keine spezifische Amplifikation festgestellt.

Quantifizierung des EBV-Genoms

Die Menge der EBV-DNA in PBL wurde durch Experimente mit limitierender Verdünnung bestimmt. Serielle 10-fache Verdünnungen (1-10-6μg) der genomischen DNA, die aus jeder DNA-Probe extrahiert wurde, wurden wie oben beschrieben der nested PCR unterzogen, und die minimale Grenze für das positive Ergebnis wurde in die Viruslast (Kopien/2,5 × 105 Zellen) umgerechnet.

Ergebnisse

Die Sensitivität des PCR-Systems wurde sorgfältig durch 10-fache Verdünnungen der drei EBV-DNA-Quellen bestimmt: Raji und Akata, die beide eine konstante Anzahl von EBV-DNA-Kopien pro Zelle enthalten, und das klonierte BamHI-L-Fragment. Raji enthält 50 Kopien des EBV-Genoms pro Zelle, und 1 μg genomische DNA aus Raji-Zellen entspricht der aus 2,5 × 105 Zellen extrahierten DNA, also 1,25 × 107 Kopien der EBV-DNA. Die DNA aus Raji-Zellen wurde entsprechend verdünnt, und DNA mit 10n Kopien (serielle Verdünnungen von 10°-104 Kopien des Virus) wurde einer Amplifikation unterzogen. Die minimale Grenze für ein positives PCR-Ergebnis wurde untersucht. Wiederholte Untersuchungen ergaben, dass die Sensitivität bei 100 Kopien pro Reaktion lag und reproduzierbar war. Die Ergebnisse waren bei der Verwendung von Akata-DNA und beim Verdünnungsexperiment mit 10n Kopien von BamHI-L-Fragmenten gemischt mit 105μg, 102μg und keiner Nabelschnurblut-DNA gleich.

Alle PBL von Personen mit IM und CAEBV waren positiv für das EBV-Genom. Neun (47 %) von 19 Proben von EBV-seropositiven gesunden Personen waren positiv. Alle PBL von seronegativen Personen waren negativ.

EBV-DNA in PBL wurde quantifiziert und für EBV-seropositive gesunde Kontrollen, Kinder mit IM und Kinder mit CAEBV verglichen (Abbildung 1). Bei gesunden, EBV-seropositiven Kindern lag die Viruslast bei 100-1000 Kopien pro 2,5 × 105 PBL. Bei PBL von Kindern mit IM reichten die untersten Grenzen für positive PCR-Ergebnisse von 10° μg (2,5 × 105 PBL) bis 10∼3μg (2,5 × 102/PBL) genomischer DNA, was auf eine Viruslast von 100-100.000 Kopien/2,5 × 105 PBL hinweist. Drei Blutproben, die innerhalb eines Monats nach Ausbruch der Krankheit entnommen wurden, wiesen höhere Belastungen auf (1000-100.000 Kopien/2,5 × 105 PBL). Die >11 Monate nach Ausbruch der IM entnommenen Blutplättchen enthielten tendenziell geringere Mengen des Virus. Wir verfolgten die Viruslast bei 4 IM-Patienten (Abbildung 2A). Bei allen 4 nahm die Viruslast während des klinischen Verlaufs ab, war aber höher (100-10.000 Kopien/2,5 × 105 PBL) als bei den seropositiven gesunden Wirten.

Die PBL von Kindern mit CAEBV wiesen mehr EBV-DNA auf als Proben von Kindern mit IM. Vier CAEBV-Patienten wurden >16 Monate lang beobachtet (Abbildung 2B zeigt die Ergebnisse für zwei Patienten). Zwei weitere Patienten hatten über 2-3 Jahre hinweg unveränderte Viruslasten (105 bzw. 106 Kopien/2,5 × 105 PBL). Alle diese Patienten hatten im Gegensatz zu den Befunden bei IM anhaltend hohe Viruslasten. Als wir die Beziehung zwischen den klinischen Manifestationen und den EBV-Lasten untersuchten, war nur Fieber mit der Viruslast korreliert. Es gab keine Korrelation mit Hepatosplenomegalie, Lymphadenopathie, Exanthem, Mückenallergie, Leberfunktionsstörungen, Anämie, Thrombozytopenie oder Serum-Antikörpertitern gegen VCA, EA-DR und EBNA.

Diskussion

Die PCR zur Quantifizierung der EBV-DNA zeigte, dass die PBL von Kindern mit CAEBV oder IM hohe Viruslasten aufwiesen, was auf eine aktive EBV-Replikation in den Lymphozyten hinweist. Die Virusreplikation wurde bei CAEBV als aktiver angesehen als bei IM; in der IM-Gruppe ging die Replikation allmählich zurück, während die aktive Replikation bei den CAEBV-Patienten jahrelang anhielt.

Unser PCR-System amplifiziert EBV-spezifische Sequenzen, die für gp220 kodieren, das ein Einzelkopie-Gen in einem Virus ist, während frühere Studien auf die interne Wiederholung abzielten, die sich in der BamHI-W-Region befindet. Da bei der polyklonalen EBV-Vermehrung die Anzahl der Wiederholungen in dieser Region nicht konstant ist, gilt unser System als genauer für die Quantifizierung von EBV, wenn auch weniger empfindlich für den Nachweis. Der Mangel der geringen Empfindlichkeit wurde durch den Einsatz der nested PCR überwunden. Die Empfindlichkeit lag bei 100 Kopien pro Reaktion, im Vergleich zu 10 Kopien in einem früheren Bericht. Wir quantifizierten EBV-Genome in PBL durch die serielle Verdünnung der extrahierten DNA. Unser System zur Quantifizierung der EBV-DNA durch serielle Verdünnung der extrahierten DNA erwies sich als reproduzierbar und zuverlässig.

Die PBL von Kindern mit IM und CAEBV enthielten größere Mengen des EBV-Genoms als die PBL von gesunden seropositiven Kontrollen. Von letzteren hatten 47 % nachweisbare EBV-DNA (100-1000/2,5 × 105 PBL). Bei 2 Probanden wurde EBV in höheren Konzentrationen nachgewiesen als in den früheren Studien (1-50/106 PBL). Da wir Kinder untersuchten, könnten die kürzeren Zeiträume nach der Primärinfektion zu den höheren EBV-Belastungen beitragen, als sie in früheren Studien mit Erwachsenen beobachtet wurden, was uns daran erinnert, dass insbesondere bei Kindern positive PCR-Ergebnisse eine asymptomatische latente EBV-Infektion einschließen.

Die Kinder mit IM hatten große Mengen an EBV. Die EBV-Belastung erreichte innerhalb eines Monats nach Beginn der Erkrankung ihren Höhepunkt (1000-100.000 Kopien/2,5 × 105 PBL) und nahm dann allmählich ab, blieb aber mehrere Monate (⩽8) nach Beginn der Erkrankung hoch, verglichen mit den Werten gesunder Kontrollen. Selbst als die klinischen Manifestationen verschwanden, blieben die relativ hohen EBV-Replikationsraten in den PBL bestehen.

Die Patienten mit CAEBV wiesen anhaltend große EBV-Mengen auf, was darauf hindeutet, dass eine chronische unregulierte aktive EBV-Replikation in den PBL zu einer schweren Erkrankung mit schlechter Prognose führt. Die Faktoren und Mechanismen, die zu der überraschend aktiven Virusreplikation führen, sind nach wie vor unklar. Es wurden verschiedene heterogene Defizite in den Wirtsabwehrsystemen sowohl der humoralen als auch der zellulären Immunität beschrieben, die eine aktive Virusreplikation ermöglichen könnten. Eine hohe Viruslast in der PBL (>1300.000 EBV/105 PBL) wurde bei EBV-assoziierter lymphoproliferativer Posttransplantationskrankheit (PTLD), einer Komplikation nach Transplantationen, nachgewiesen, obwohl die Viruslast innerhalb eines Jahres parallel zur Erholung von der Immunsuppression abnahm. Ein quantitativer Unterschied in der zirkulierenden EBV-Last korrelierte mit dem EBNA-Antikörperspiegel bei PTLD, nicht aber bei CAEBV. Daher wurde davon ausgegangen, dass das EBV-Verhalten bei PTLD sowohl ähnlich als auch unterschiedlich zu dem bei CAEBV ist. Angesichts der klinischen Manifestationen scheint CAEBV dem X-chromosomalen lymphoproliferativen (XLP) Syndrom zu ähneln, für das kürzlich das verantwortliche Gen identifiziert wurde. Im Gegensatz zum XLP-Syndrom handelt es sich bei CAEBV jedoch nicht um eine Erbkrankheit, und es können auch Frauen betroffen sein. Weitere immunologische Analysen von CAEBV sind notwendig, um prädisponierende Faktoren für die virale Aktivierung zu klären.

Acyclovir, Interferon-α und Interleukin-2 wurden zur Behandlung von CAEBV eingesetzt – mit unbefriedigenden Ergebnissen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass zytotoxische Medikamente, die eine Immunsuppression induzieren und die virale Aktivierung verstärken, sorgfältig ausgewählt werden sollten, obwohl die klinischen Merkmale denen hämatologischer Malignome ähneln. Persistierende hohe EBV-Belastungen in PBL sind ein mögliches diagnostisches Kriterium für CAEBV und können für die Überwachung der Krankheitsaktivität, für die Klassifizierung der Krankheit und für die Vorhersage der Prognose nützlich sein.

Danksagung

Wir danken George Klein (Microbiology and Tumorbiology Center, Karolinska Institute, Stockholm) für die Durchsicht des Manuskripts und Sachi Takemoto und Ai Kitamura für die geschickte technische Unterstützung.