3 Amylase-Inhibitoren

α-Amylase (1,4-α-d-Glucan-Glucanohydrolase, EC3.2.1.1) ist eine Endoglucanase, die die Hydrolyse der endo α-(1,4)-glykosidischen Bindungen in Stärke und verwandten Polysacchariden katalysiert. Die Hydrolyse von Stärke wird zunächst von der im menschlichen Speichel vorhandenen α-Amylase katalysiert, gefolgt von der Pankreasamylase im Zwölffingerdarm. Die humane pankreatische α-Amylase (HPA) ist ein wichtiges pharmakologisches Ziel für die Behandlung von Typ-2-Diabetes. Allerdings sind die Kosten für die HPA für Forschungszwecke relativ hoch. Stattdessen wird die α-Amylase der Bauchspeicheldrüse von Schweinen (PPA) zur Messung der Verdauung in vitro verwendet. PPA besteht aus 496 Aminosäureresten und weist eine 83%ige Identität mit ihrem menschlichen Gegenstück HPA auf (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA ist eine Endo-Amylase und katalysiert die Hydrolyse interner α-(1,4)-glykosidischer Bindungen in Amylose und Amylopektin durch mehrfachen Angriff auf das nicht-reduzierende Ende (Robyt & French, 1970). Die Hydrolyseprodukte der pankreatischen α-Amylase des Schweins sind hauptsächlich Maltose, Maltotriose und Maltotetraose (Yook & Robyt, 2002). PPA hat zwei Isomere, PPA-Isoenzym-I (PPA-I) und PPA-II, die das gleiche Molekulargewicht haben, sich aber in der Aminosäurezusammensetzung und im isoelektrischen Punkt leicht unterscheiden (Pasero et al., 1986).

Natürlich vorkommende α-Amylase-Inhibitoren umfassen solche auf Proteinbasis und Sekundärmetaboliten. Erstere werden in diesem Artikel nicht behandelt, da sie dazu neigen, bei thermischer oder saurer Behandlung (Magensäure) zu denaturieren und ihre Aktivität zu verlieren, wenn sie den Dünndarm erreichen. In diesem Artikel fassen wir die neueste Literatur über α-Amylase-Inhibitoren zusammen. Die zur Messung der Hemmaktivität verwendeten Methoden sind ebenfalls aufgeführt, da unterschiedliche Methoden zu unterschiedlichen IC50-Werten führen können. Im Vergleich zur α-Glucosidase liegen für die α-Amylase weniger Berichte vor, und die meisten Studien beziehen sich auf Polyphenole.

Isookanin (57) (Abb. 3.8), isoliert aus spanischen Nadeln, Bidens bipinnata, zeigte eine mäßige Hemmaktivität auf HPA (IC50 von 0,447 mg/mL oder 156 μM), gemessen mit einem iodometrischen Assay (Yang et al., 2012). Es ist zu beachten, dass Isookanin zwei Catechin-Einheiten enthält und daher ein gutes Reduktionsmittel sein dürfte, das Jod reduzieren kann, was zu falsch positiven Ergebnissen führen kann.

Abbildung 3.8. Chemische Strukturen für Amylase-Inhibitoren, Verbindungen 57-59, 5-Caffeoylchinasäure und 4,5-Dicaffeoylchinasäure.

Aus dem Blatt der Wasseranwendung (Syzygium aqueum) wurden Myricetin-3-O-Rhamnosid (9) und Europetin-3-O-Rhamnosid (10) (Abb. 3.2) wurden isoliert, und die Hemmaktivität auf die α-Amylasehemmung wurde mit dem DNSA-Assay gemessen und war 10-mal (EC50 von ~ 2,0 μM) stärker als die von Acarbose (EC50 von 19 μM). Eine derart hohe Aktivität ist bei polyphenolischen Verbindungen eher selten zu beobachten und rechtfertigt weitere Untersuchungen, insbesondere zum Hemmungsmechanismus und zur Selektivität, wenn diese Verbindungen mit einer komplexen Lebensmittelmatrix konfrontiert werden. Myricetin ist ein starker Radikalfänger, so dass die Stabilität von 9 und 10 ebenfalls ein Problem darstellt. Die Autoren berichteten, dass Quercetin eine vergleichbare EC50 (17 μM) wie Acarbose (19 μM) aufweist. Mit dem in unserem Labor entwickelten Trübungstest konnten wir keine Hemmwirkung von Quercetin auf die α-Amylase der Bauchspeicheldrüse nachweisen, wenn wir Acarbose als Referenzstandard verwendeten (Huang et al., unveröffentlichte Ergebnisse). Daher muss überprüft werden, ob die angegebene EC50 methodenabhängig ist, um mögliche Artefakte auszuschließen (Manaharan et al., 2012). Cleistocalyx operculatus gehört ebenfalls zur Familie der Myrtaceae. Hu, Luo, Li, Joshi und Lu (2012) isolierten und reinigten 2′4′-Dihydroxy-6′-methoxy-3′5′-dimethylchalkon (DMC) aus den getrockneten Blütenknospen von C. operculatus. Die Verbindung zeigte einen nicht-kompetitiven Hemmmechanismus gegenüber PPA (Hu et al., 2012).

Tilirosid (58) (Abb. 3.8), isoliert aus den Samen der Hundsrose, Rosa canina L., hemmt PPA mit einer IC50 von 280 mM, und eine kinetische Studie zeigt, dass es ein nicht-kompetitiver Hemmstoff mit Ki-Werten von 84,2 μM ist, quantifiziert mit p-Nitrophenyl-alpha-d-pentaglucosid als Substrat. Im Gegensatz zu Acarbose zeigt Tilirosid keine Hemmaktivität gegenüber α-Glucosidase. Möglicherweise aufgrund seiner schwachen α-Amylase-Hemmaktivität im Tiermodell ist eine hohe Dosis Tilirosid (600 mg/kg) erforderlich, um die postprandiale Plasmaglukosekonzentration von Mäusen zu senken, die mit 2 g/kg Stärke behandelt wurden. Tilirosid könnte eine Antihyperglykämie durch Hemmung der durch den natriumabhängigen Glukosetransporter 1 und den Glukosetransporter 2 vermittelten Glukoseaufnahme in Enterozyten bewirken (Goto et al., 2012).

Curcumin und seine Derivate gelten als Multitargeting-Verbindungen, die ein sehr breites Spektrum an gesundheitlichen Vorteilen aufweisen. Als potenzielles Mittel zur Verringerung der Stärkeverdauungsrate hat Bisdemethoxycurcumin (59) (Abb. 3.8) aus dem Rhizom von Curcuma longa eine HPA- und PPA-Hemmaktivität mit IC50-Werten von etwa 25 μM unter Verwendung des DNSA-Tests. Eine kinetische Studie zeigt, dass es sich um einen nicht-kompetitiven HPA-Inhibitor mit einem scheinbaren Ki von 3,0 μM handelt (Ponnusamy et al., 2012).

Mono- und disubstituierte Caffeoylchinasäuren sind die wichtigsten polyphenolischen Verbindungen in grünen Kaffeebohnen. Aufgrund des Vorhandenseins von drei sekundären Hydroxylgruppen im Chinasäurering gibt es drei Isomere zwischen den Positionen von monosubstituierten Caffeoylchinasäuren und drei Dicaffeoylchinasäuren, die alle aus grünen Kaffeebohnen gereinigt wurden. Ihre hemmende Wirkung auf PPA-I (Narita & Inouye, 2011) wurde mit p-Nitrophenyl-Diglucosid gemessen, das bei der Hydrolyse p-Nitrophenol und Maltose erzeugt. Es ist bemerkenswert, dass die hemmende Aktivität stark von der Position der Caffeoylgruppen in der Monocaffeoylchinasäure abhängt. 5-Caffeoylchinasäure (oder allgemein als Chlorogensäure bekannt) (Abb. 3.8) hat die höhere Hemmaktivität mit einer IC50 von 80 μM, verglichen mit der von 4-Caffeoylchinasäure (120 μM) und 3-Caffeoylchinasäure (230 μM). Bei den drei Dicaffeoylchinasäure-Isomeren ist die hemmende Aktivität viel höher und sie sind nicht so empfindlich gegenüber der Position der Estergruppen, da 3,4- und 4,5-Dicaffeoylchinasäuren (Abb. 3.8) die gleichen IC50-Werte (20 mM) haben und 4,5-Dicaffeoylchinasäure eine IC50 von 30 μM (Narita & Inouye, 2011).