DR. EDWIN B. ASTWOOD var en visionær inden for moderne endokrinologi. Den biografiske erindringsbog af Roy Greep og Monte Greer sluttede: “Ud over sine specifikke forskningsbidrag lykkedes det Dr. Edwin B. Astwood i et omfang, som kun få har opnået, at spænde over det brede område mellem naturvidenskab og klinisk medicin.” For mig er dette det højeste kald inden for endokrinologien.”

Slutet af 1960’erne og begyndelsen af 1970’erne var præget af de utrolige resultater, som to grupper, nemlig dr. Andrew Schally og Roger Guillemin, der isolerede, karakteriserede og sekventerede de hypothalamiske regulerende hormoner. Det første hypothalamiske reguleringshormon, der blev sekventeret, var TRH (et tripeptid), det andet var gonadotropin-frigivende hormon (et decapeptid), og det tredje var somatostatin med 14 aminosyrer. GHRH’s eksistens var blevet antydet i begyndelsen af 1960’erne ved nogle klassiske forsøg af Reichlin (1); han lavede læsioner i hypothalamus og påviste, at indholdet af GH i hypofysen faldt. På baggrund af disse data foreslog han, at der måtte være et GHRH i hypothalamus.

Jeg tog min lægeuddannelse i London, England, med min endokrinologiske uddannelse under professor G. Michael Besser. En af de mest fornøjelige konferencer, som vi regelmæssigt deltog i, var præsentationen af kliniske tilfælde i Royal Society of Medicine. Jeg husker det faktum, at hver gang en patient med akromegali blev præsenteret, spurgte professor Peter Sonksen, om patienten havde tegn på en carcinoid tumor eller ej. Opfattelsen i salen var “Hvorfor stiller denne mand altid dette spørgsmål?”, fordi sådanne tilfælde sandsynligvis ikke findes eller, hvis de findes, meget sjældent!

I 1977 flyttede jeg fra St. Bartholomew’s Hospital (London, England) til University of Virginia. Min hovedinteresse på det tidspunkt var PRL-sekreterende hypofysetumorer og deres medicinske behandling.

I oktober 1980 blev en 21-årig patient henvist til mig af Dr. Ann Johanson. Denne patient havde amenoré og galactorrhea, mens hun tog et oralt præventionsmiddel til gonadal steroiderstatning. Hun havde gonadal agenese fra Turners syndrom.

Hendes evaluering afslørede en forstørret hypofyse fossa på kranie røntgenbillede, en hypofyse masse med beskeden suprasellar udvidelse på computertomografi scanning, og en forhøjet serum PRL på 68 μg/L. Hendes forhøjede serum GH på 95 μg/L blev ikke undertrykt med oral glukose, steg med TRH og blev undertrykt med en dopamininfusion. Hendes serumniveau af insulinlignende vækstfaktor (IGF)-I var forhøjet til 11 U/mL (normalt, 0,41-2,2 U/mL).

Baseret på disse resultater var diagnosen akromegali klar. Det er af interesse, at patientens højde var 5’3″, hvilket er meget høj for en patient med Turners syndrom. I denne henseende var det heldigt, at der var blevet gemt sera fra de foregående 7 år. Hendes serum GH-koncentrationer havde været forhøjede i hele denne periode (Tabel 1).

Patienten blev henvist til transsphenoidal kirurgi, som blev udført den 15. januar 1981. Syv uger efter operationen viste det sig, at hun stadig havde akromegali; serum GH var 52 μg/L, og IGF-I var stadig forhøjet til 7,7 U/mL.

Som led i et igangværende samarbejde var hypofysepatologiprøverne blevet sendt til Dr. Kalman Kovacs (St. Michael’s Hospital, Toronto, Canada). Noget senere ringede Dr. Kovacs for at give mig resultaterne af sin undersøgelse af vævet. Hans rapport viste, at denne patient havde somatotrof hyperplasi og ikke en hypofysetumor. Årsagerne til denne diagnose var følgende: 1) reticulinmønsteret var bevaret (det ødelægges i tumorer) (Fig. 1); 2) somatotroferne var dominerende, selv om thyrotrofer, gonadotrofer og corticotrofer var indimellem; og 3) elektronmikroskopi af somatotroferne afslørede veludviklet endoplasmatisk reticulum og Golgi-apparat, hvilket tyder på aktiv hormonsyntese (Fig. 2). Da somatotroferne var tæt pakket med sekretoriske granula, antydede dette for mig, at dette afspejlede en hæmning af hormonfrigivelsen på grund af feedback af sekreteret GH, formentlig ved at øge somatostatinsekretionen (og/eller IGF-I).

Baseret på hypofysehistologien var det klart, at hypofysen blev stimuleret af en extrinsisk faktor. Det var usandsynligt, at dette skyldtes en mutation i GHRH-receptoren eller en konstitutiv aktivering af det G-protein, der er koblet til GHRH-receptoren, fordi dette sandsynligvis ville ske i en enkelt celle, hvilket ville føre til tumorudvikling og nedbrydning af reticulinmønsteret. Det var derfor langt mere sandsynligt, at hypofysen blev stimuleret af en ekstrinsisk faktor, enten GHRH, der kom fra hypothalamus eller fra periferien. For det andet gjorde den vedvarende akromegali det bydende nødvendigt, at vi fandt årsagen til denne patients akromegali. På dette tidspunkt rapporterede en artikel af Frohman et al. (2) den delvise oprensning og karakterisering af et peptid med GH-frigivende aktivitet fra ekstrapituitære tumorer fra akromegaliske patienter.

En abdominal computertomografi-scanning viste en tumor med en diameter på 5 cm i pancreashaleroden. Den 26. august 1981 blev tumoren fjernet. Den var godt indkapslet og blev ved histologien bestemt til at være en isletcelletumor. Tumoren var imidlertid hverken en β- eller αcelletumor. Den var stærkt positiv for neuronspecifik enolase og var ved immunfarvning negativ for GH, insulin, glukagon, calcitonin og ACTH med tvetydig farvning for somatostatin.

Tumoren indeholdt ingen GH ved immuncytokemi. I de første 2 timer efter fjernelse af tumoren var der et hurtigt fald i serum GH-niveauet fra 70 μg/L til 3 μg/L (Fig. 3) (3) (3). Patienten er nu blevet fulgt i 18 år og er fortsat helbredt for sin akromegali.

Det næste spørgsmål var, hvad man skulle gøre med den pancreatiske tumor. På det tidspunkt var jeg så heldig at have afdøde Dr. Michael Cronin som kollega på University of Virginia. Michael kom med mig på operationsstuen for at hjælpe med at gennemføre vores omhyggeligt udarbejdede strategi for håndtering af tumoren. Halvdelen af tumoren blev skåret i tern og straks lagt i flydende nitrogen, og den anden halvdel blev forberedt til vævskultur. Sidstnævnte blev sendt til flere grupper, der var eksperter i at etablere stabile cellelinjer. Michael Cronin kunne påvise, at det medium, der badede i denne tumor, indeholdt GHRH-aktivitet og stimulerede adenylatcyklase (4). Tumoren blev oprindeligt givet til Dr. Wylie Vale på Salk Institute (La Jolla, CA), og han gav efterfølgende en del af den til Dr. Guillemin. De to grupper fandt uafhængigt af hinanden, at den indeholdt høj GHRH-aktivitet, og de var i stand til at isolere GHRH fra tumoren, karakterisere den og sekventere den (5-8). GHRH fra denne tumor var et 40-aminosyrepeptid, som har homologi med medlemmer af glukagon/sekretin/VIP-familien af peptider.

Jeg valgte endokrinologi som mit speciale, fordi mine mentorer indprentede mig vigtigheden af anvendelsen af fysiologi til forståelse af patofysiologi og terapi af patienter med endokrine sygdomme.

Hver patient, man ser, er et eksperiment af naturen. Jeg var meget heldig at blive henvist til denne patient, som gjorde det muligt for mig og mine kolleger at levere tumoren til to førende grupper, som derefter var i stand til at isolere, karakterisere og sekventere det længe eftersøgte GHRH. Faktisk var GHRH et af de første hypothalamiske hormoner, som man søgte at finde, men der havde været mange fejlstarter.

Der var flere grunde til, at det i 1982 lykkedes at karakterisere og sekventere GHRH. For det første var metoderne til vurdering af aktiviteten af tumorekstrakter blevet forfinet og var meget mere følsomme. For det andet var metoderne til mikrosekventering blevet stærkt forbedret i løbet af de foregående 10 år. Men den tredje, og sandsynligvis vigtigste, grund var, at denne tumor indeholdt høje koncentrationer af GHRHH og meget lidt somatostatin. Somatostatin hæmmer GH-frigivelsen i bioassayet, og dets tilstedeværelse forvirrede derfor overvågningen af rensningen af GHRH. Ekstraktet fra denne tumor forenklede processen betydeligt (fordi den indeholdt høje koncentrationer af GHRH og kun lidt somatostatin) sammenlignet med tidligere forsøg med hundredtusindvis af hypothalamier fra dyr, der var rige på somatostatin og havde meget små koncentrationer af GHRH. Dette var det første eksempel på en enkelt menneskelig tumor, der blev brugt til at identificere og isolere et hormon. PTH-relateret protein blev isoleret med en lignende teknik ved hjælp af en menneskelig tumorcellelinje.

Som klinikere har vi alle et ansvar for at identificere eksperimenter fra naturen og gribe mulighederne for at stille spørgsmål, som det ville være meget vanskeligt at besvare på anden vis. Naturens eksperimenter er ofte unikke, og de 15 eller 20 patienter, der kom før denne, gav helt sikkert et fingerpeg om, at en tumor fra en patient med ektopisk GHRH-sekretion kunne besvare spørgsmålet om GHRH’s natur og struktur. Faktisk blev Dr. Guillemins gruppe efterfølgende opmærksom på en anden tumor fra Dr. Genevieve Sassolas (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Frankrig), og da de havde mere væv fra denne tumor, undersøgte de den mere aggressivt end den fra Charlottesville. Det var imidlertid den oprindelige Charlottesville-tumor, der antydede, at en sådan tumor kunne tilbyde nøglen til søgen efter GHRH.

Den efterfølgende undersøgelse af GHRH’s fysiologi og dets terapeutiske potentiale som behandling af GH-mangel hos børn har været i fokus for vores gruppes arbejde i løbet af de sidste 17 år (9, 10). I første omgang administrerede vi GHRHH til normale frivillige og påviste dets effektivitet og specificitet med hensyn til at øge GH-koncentrationerne i serum (11). Derefter bestemte vi GH-responset på en akut injektion af GHRH hos børn med idiopatisk GH-mangel (fig. 4). Mange af børnene havde en meget kraftig stigning i GH, mens der hos nogle af dem var en lille eller ingen stigning (12); responset på GHRH var større end på arginin og l-dopa. På baggrund af disse resultater foreslog vi, at mange børn med idiopatisk GH-mangel i virkeligheden lider af GHRH-mangel.

Der blev derefter iværksat et multicenterforsøg med GHRH-behandling. Dette syntes særlig hensigtsmæssigt, fordi den GH, der blev anvendt til behandling af GH-mangel, stammede fra kadavere og var blevet impliceret i overførslen af Jacob Creutzfeld-sygdommen. I alt 24 børn blev behandlet; hos 10 børn blev der anvendt en pumpe til at administrere en sc GHRH-bolus hver 3. time. Denne vej og dosis blev valgt for at efterligne den normale fysiologi med ca. én GH-puls hver 3. time hos børn i vækst. Desuden blev 10 børn kun behandlet med pumpen hver 3. time om natten, og 4 børn fik to gange dagligt sc-injektioner af GHRH i sc-injektioner. Væksthastighederne hos børnene før og efter 6 måneders behandling er vist i fig. 5 (13).

Baseret på resultaterne af denne undersøgelse indledte Serono Laboratories, Inc. en 12-måneders multicenterundersøgelse med GHRH(1-29)-NH2 administreret sc én gang dagligt (14). De børn, der voksede langsomst, havde den største stigning i væksthastigheden (fig. 6). Dette tyder på, at GHRHH kan genoprette fysiologisk GH-sekretion. GHRH er godkendt af Food and Drug Administration til diagnostisk brug såvel som til behandling af GH-mangel hos børn. GHRH er sikkert og fremskynder effektivt væksthastigheden hos de fleste patienter med GH-mangel.

På det tidspunkt, hvor GHRH blev syntetiseret, var der stor interesse for nedregulering af gonadotropinresponset på gonadotropin-frigivende hormon. Vi blev fascineret af en observation hos en anden patient med ektopisk GHRHH-sekretion fra en metastatisk karcinoid tumor, der gav anledning til akromegali. På trods af vedvarende forhøjede GHRH-niveauer i hele 24-timers perioden var mønsteret af GH-frigivelse stadig pulserende, hvilket indikerer, at der formentlig er andre faktorer, der er involveret i reguleringen af det pulserende mønster af GH-sekretion (15). Det er blevet foreslået, at dette kan skyldes tilbagetrækning af somatostatin. Ektopisk GHRH-sekretion viser således utvetydigt, at en langtidsvirkende GHRH-agonist kan øge den pulsatile GH-sekretion. Undersøgelser af kontinuerlig iv GHRH-infusion hos normale personer viser det samme fænomen, og det er således klart, at et depotpræparat af GHRH kan være et nyttigt terapeutisk middel.

Vores gruppe (16) og Mayo (17) har klonet GHRH-receptoren. Det er interessant, at GHRH-receptoren tilhører B-klassen af G-protein-koblede receptorer, som omfatter receptorerne for glucagon/sekretin-familien af peptider samt CRH, calcitonin og parathyroidhormon. Deres struktur er helt forskellig fra strukturen af de større receptorer af rhodopsin (A-familien). Der er dog også syv transmembran-spanende domæner i denne receptorfamilie.

Den kritiske rolle, som GHRH spiller, er påvist af dværglitmusen, der har en punktmutation i GHRH-receptoren (18, 19). Wajnrajch et al. (20) beskrev en nonsense-mutation (Glu 72stop) i den humane GHRH-receptor, der forårsager vækstsvigt og GH-mangel hos to børn fra den samme indiske muslimske slægt. Maheshwari et al. (21) har beskrevet en slægt i Sindh-dalen i Pakistan med den samme mutation. Medlemmerne af denne slægt er ekstremt små af størrelse. En anden mutation i receptoren er blevet beskrevet i en stor brasiliansk slægt, der omfatter over 110 personer med alvorlig GH-mangel og ekstrem kortvoksenhed (22). Disse naturforsøg viser, at en defekt i GHRH-receptoren hæmmer normal vækst og understreger GHRH’s vitale betydning.

En tegning af GHRH-receptoren er vist i fig. 7 (10). Asparaginsyre på position 60 fra startkodonet er stedet for den oplyste mutation i musen. Western blotting med et C-terminalt GHRH-receptor antiserum, der var rejst mod et peptid baseret på sekvensen af den humane GHRH-receptor, blev anvendt til undersøgelse af membraner fra HEK293-celler, der var transficeret med komplementært DNA for GHRH-receptoren. Undersøgelserne tyder på, at receptoren fra den oplyste mus oversættes til protein og faktisk er til stede i hypofysecellernes membran hos den oplyste mus. Vi har foreslået, at denne mutation fører til en ændring i receptorens tertiære struktur, hvilket forhindrer binding (23). Ved hjælp af fotoaffinitetssonder tyder vores beviser på, at andre steder er i umiddelbar nærhed af bundet GHRH, hvilket indikerer, at flere interaktionssteder sandsynligvis er nødvendige for signaltransduktion. Tilgængeligheden af rekombinant receptor gør det muligt at søge efter nonpeptid GHRHH agonister.

Sammenfattende kan det konkluderes, at den viden, der blev indsamlet ved omhyggelig observation af en enkelt patient med akromegali, førte til isolering, karakterisering og syntese af GHRH. Yderligere undersøgelser førte til indførelsen af GHRH-behandling af GH-mangel. Senere lykkedes det os og andre at klone receptoren for GHRH. Undersøgelser med GHRH har bekræftet, at det er afgørende for GH-syntese og normal vækst. Denne holdning bekræftes nu af observationer af, at mutationer af GHRH-receptoren, som resulterer i inaktivering af denne, fører til dybtgående GH-mangel og alvorlig kortvoksenhed og fuldender cirklen i vores forståelse af GH-regulering ved hjælp af GHRH.

Anerkendelser

Jeg takker mine mange kolleger, som har ydet vigtige bidrag til dette arbejde, samt fru Suzan Pezzoli for hjælp til udarbejdelsen af dette manuskript.

Dette arbejde blev delvist støttet af NIH Grants HD-13197, DK-32632 og DK-45350 (til M.O.T.) og Grant RR-00847 (til General Clinical Research Center og CDMAS Laboratory ved University of Virginia.