Limulus Amebocyte Lysate Test (LAL) er en metode til påvisning og kvantificering af bakterielle endotoksiner, som er meget anvendt i den farmaceutiske og bioteknologiske industri. Testens biokemiske princip er baseret på koagulationsreaktionen af hæmolymphen fra Limulus polyphemus, almindeligvis kendt som den atlantiske hestesko krabbe, i tilstedeværelse af antigener med mikrobiel overflade, såsom lipopolysaccharider eller bakterielle endotoxiner.

Selskabet “Wako Chemicals” er blandt de virksomheder, der fremstiller LAL-reagenser på internationalt niveau på grund af sin unikke formel af en LAL-reagens, der er specifik for bakterielle endotoxiner uden interferens af betaglucaner i prøverne, takket være tilsætning af carboximethylated Curdlan (CMC), der er kolofyliseret med LAL. Under mærket PYROSTAR™ fremstiller og markedsfører dette distributørfirma af forskningsreagenser LAL-reagenser og tilbehør, der overholder alle de normer, bestemmelser og kvalitetsstandarder, der er fastsat af FDA fra USA.

Vi vil nu tale om de forskellige reagenser og tilbehør, hvormed Wako bidrager til undersøgelsen af bakterielle endotoksiner:

For det første har vi Limulus PS Simple Test-kittet, som gør det muligt at detektere og kvantificere endotoksiner uden interferens fra andre samtidig eksisterende stoffer ved hjælp af et affinitetsadsorbent for endotoksiner kaldet Pyrosep™. Med denne metode kan vi måle endotoksinet i en lipofil prøve, forudsat at den kan opløses i ethanol, f.eks. fedtopløselige vitaminer, olier og fedtstoffer, albuminer osv. som normalt ikke kan måles med en konventionel Limulus-test. Desuden går der ikke noget LAL-reagens til spilde, da det anvendes individuelt i hætteglas til den enkle test og kan anvendes i nøjagtig den mængde, der er nødvendig for målingen.

PYROSTAR™ ES-F-serien er en unik formulering, der indeholder carboximethylated Curdlan (CMC) coliophylificeret med LAL med det formål at fjerne interferens med β-glucaner. ES-bufferen, der er udviklet af Wako, indeholder høje CMC-koncentrationer og bliver til et endotoksinspecifikt LAL-reagens. Dette reagens er beregnet til anvendelse både til kvalitativ påvisning af endotoksiner ved hjælp af gel-klumpmetoden og til kvantitativ påvisning af endotoksiner ved hjælp af den kinetiske turbidimetriske metode (KTA). Til måling af hastigheden af turbiditetsændringen anvendes et fotometrisk instrument kaldet Toxinometer®, der er udviklet af Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Kits PYROSTAR™ ES-F fås med og uden standardkontrolendotoxin (SCE): et frysetørret reagens raffineret fra E. coli, der anvendes til at bekræfte LAL-reagensets følsomhed, validere produkttestmetoderne og forberede hæmningskontroller.

Til støtte for disse reagenser er Wako også ved at udvikle en endotoxinekstraheringsopløsning, der er i stand til at ekstrahere endotoksiner fra overflader, hvor de ikke kan ekstraheres med vand eller salt. Det anbefales at anvende den til endotoxinprøver på udstyr og anordninger, der kan være i kontakt med væsker, der indeholder blod eller proteiner.

Toxinometer® ET-6000 er en computerstyret kinetisk inkubationslæser, som kan inkorporere 3 testmetoder: gel-klump, KTA og KCA (kinetisk kromogen test). Dette udstyr gør det muligt at opnå gel-klump og KTA-resultater fra den samme prøve. Det måler samtidig op til 16 prøver med en forureningsrisiko, der er meget lavere end ved mikroplader, og det giver os mulighed for at arkivere standardkurverne. Toximaster® QC7 er den software, der indeholder alle funktioner til databehandling og udarbejdelse af rapporter til LAL-testen med Toxinometer® ET-6000.

Dertil kommer, at vi blandt tilbehøret fra Wakos LAL-kataloger også ser reagensglas med og uden aluminiumsdæksel. Disse rør er fremstillet uden endotoksiner, fremstillet af borosilikatglas og designet til gel-klumpmetoden. Glassets tykkelse kan kalibreres specifikt til toxinometeret for stabil lysintensitet og transmittans.

Et andet LAL-reagens, der markedsføres af Wako, er KY Color Limulus-sættet. Dette reagens er udviklet til KCA-metoden og kan anvendes både i den kinetiske læser og i en mikropladelæser. Det omfatter et multi-testkit og et simpelt testkit, der hver især er designet til en kolorimetrisk analyse baseret på tid, hvor der anvendes et syntetisk substrat, som genererer en gul farve, og som specifikt kan påvise endotoxinet med høj følsomhed.

Bibliografi:

1) Iwanaga, S. Biokemisk princip for Limulus-test til påvisning af bakterielle endotoxiner. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 83(4), 110-119. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices (Retningslinje om validering af Limulus Amebocyte Lysate Test som en slutprodukt-endotoksintest af human og animalsk parenterale lægemidler, biologiske produkter og medicinsk udstyr). U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, december (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Uddrag 44 (1994), 21st Annual Meeting of the Society for Antibacterial and Antifungal Agents.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discrimination mellem endotoxin og (1-3) beta-D-glucan ved hjælp af turbidimetrisk kinetisk analyse med Limulus amøbocytlysat. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

LAL PRODUCT LINE

LAL Reagent Kit	LAL Accessories