Abstract

Chronic active Epstein-Barr virus infection (CAEBV) er en alvorlig sygdom med usædvanlig EBV-aktivering, der varer ved i årevis, og dens patogenese er stort set ukendt. Efter oprettelsen af et nøjagtigt og reproducerbart polymerasekædereaktionssystem til kvantificering af EBV-DNA blev virusbelastninger i perifere blodlymfocytter (PBL) bestemt hos 54 børn: 15 med CAEBV, 16 med infektiøs mononukleose (IM) og 23 raske børn. Børn med CAEBV og børn med IM havde høje virusbelastninger. Der blev påvist lavere belastninger hos 47 % af de seropositive raske donorer. Der var to tydelige forskelle mellem børn med CAEBV og børn med IM: De førstnævnte havde større viral replikation (103-107 kopier/PBL)2,5 × 105 PBL) end dem med IM, og viral replikation faldt hos børn med IM, mens aktiv replikation fortsatte i årevis hos personer med CAEBV. Vedvarende høje virusbelastninger er et muligt diagnostisk kriterium for CAEBV. EBV-belastninger kan muliggøre klassificering og prognose af EBV-infektioner.

Epstein-Barr-virus (EBV) er årsag til infektiøs mononukleose (IM) og til kronisk aktiv EBV-infektion (CAEBV). CAEBV er en alvorlig sygdom med usædvanlig EBV-aktivering, der kan være dødelig med multiple organsvigt, og den er forbundet med malignt lymfom uden forudgående immunosuppression . De kliniske symptomer på CAEBV og de serologiske abnormiteter, der svarer til aktiv EBV-replikation, såsom markant forhøjet anti-EA-DR-antistof og fravær af Epstein-Barr nuclear antigen (EBNA)-antistof, fortsætter i måneder til år. EBV replikerer i NK- , T- og B-celler.

Når infektionen er etableret, opholder EBV sig normalt i B-lymfocytter i værtens levetid uden at forårsage nogen kliniske symptomer (betegnet som latent infektion). Derfor er ikke kun påvisning, men også kvantificering af EBV i berørte væv afgørende for at undersøge EBV-sygdom.

For at klarlægge status for EBV-replikation hos personer med CAEBV anvendte vi semikvantitativ DNA-polymerasekædereaktion (PCR) til at evaluere og sammenligne virusbelastninger i perifere blodlymfocytter (PBL) i 3 grupper af børn: en med CAEBV, en med IM og sunde kontroller. Vores detektionssystem blev anset for at være nøjagtigt og pålideligt til kvantificering af EBV, fordi vi forstærkede en enkeltkopieret region af EBV. De fleste tidligere undersøgelser var rettet mod BamHI-W-regionen, for hvilken tandem gentagelsesfrekvensen af gentagelser er ukonstant. Vi mener, at denne undersøgelse er den første og største undersøgelse i stor skala af virusbelastninger i PBL hos børn med CAEBV.

Materialer og metoder

Patienter og kontroller

Vi undersøgte 16 børn med IM (11 drenge, 5 piger; alder, 0-8 år), 15 med CAEBV (11 drenge, 4 piger; alder, 4-19 år), 19 immunkompetente EBV-seropositive raske personer (10 drenge, 9 piger; alder, 1-19 år), og 4 seronegative raske børn (3 drenge, 1 pige; alder, 1-10 år). Alle personer med IM havde typiske kliniske manifestationer (f.eks. feber, tonsillitis, lymfadenopati, hepatosplenomegali, leverdysfunktion og atypisk lymfocytose). Diagnosen IM blev stillet på grundlag af serologiske fund af IgM-antistof mod viralt kapsidantigen (VCA) eller serokonversion af VCA IgG og/eller EA og negativt EBNA-antistof . Der blev indsamlet 22 blodprøver fra 16 børn med IM 8 dage til 8 måneder efter sygdomsudbruddet (det første symptom var feber hos alle patienterne). CAEBV blev diagnosticeret efter Rickinsons kriterier . Børn med CAEBV havde intermitterende eller vedvarende feber i >16 måneder, med hepatosplenomegali, lymfadenopati og/eller hududslæt. Laboratoriefundene viste forhøjede transaminaseværdier, anæmi, trombocytopeni og/eller polyklonal hypergammaglobulinæmi. Serologisk undersøgelse viste markant forhøjede antistoftitere mod VCA og EA. Infektion med humant immundefektvirus og reumatiske sygdomme blev udelukket. Ingen forsøgspersoner havde gennemgået transplantation eller havde fået kræftbehandling.

Prøver

Der blev indsamlet hepariniserede 2-mL perifere blodprøver af perifert blod. PBL blev isoleret ved hjælp af ficoll-hypaque og lyseret med 0,15 μg/μL proteinase K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); DNA blev ekstraheret med phenol-chloroform-ethanoludfældning. Det ekstraherede DNA blev kvantificeret med spektrofotometer, justeret til 0,25 μg/μL DNA og anvendt som PCR-templates.

PCR-følsomhed

EBV DNA var fra tre kilder: Raji, der indeholder 50 kopier af EBV pr. celle ; Akata, der indeholder 20 kopier pr. celle; og klonede BamHI-L-fragmenter, som blev blandet med DNA fra navlestrengsblodceller og anvendt som positiv standard. For at bestemme PCR-systemets følsomhed blev serielle 10-dobbelte fortyndinger (10°-104 kopier af EBV) af det ekstraherede DNA underkastet PCR.

PCR

En nested dobbelt PCR blev designet til at amplificere den konserverede region, der koder for gp220 (inden for BamHI-L-fragmentet) . Det ydre primerpar amplificerer et 302-bp-fragment ved hjælp af oligonukleotiderne 5′-GCGAACTGGTGGGGACACACATGA og 5′-AA-GTCCACACAGGCAAATGCCA, der svarer til positionerne 2870-3171 i B95-8 (GenBank M10593). Det indre par amplificerer et 239-bp-fragment . PCR’en blev udført i en 50-μL reaktion indeholdende 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,5 μM af hver primer, 2,5 U Taq DNA-polymerase (Boehringer-Mannheim) og 4 μL prøve-DNA. De amplificerede produkter blev kørt på 2 % agarose og farvet med ethidiumbromid, og Southern blotting blev anvendt til at bekræfte specificiteten ved hjælp af BamHI-L-fragmentet som sonde . Hver PCR-reaktion blev udført i tre eksemplarer og omfattede den negative kontrol for at udelukke krydskontaminering. For at bekræfte PCR’ens specificitet blev der analyseret DNA fra herpes simplex virus type 1 og 2, varicella-zoster virus, humant cytomegalovirus og humant herpesvirus-6 og -7. Der blev ikke konstateret nogen specifik amplifikation.

Kvantificering af EBV-genom

Mængden af EBV DNA i PBL blev bestemt ved limiterende fortyndingseksperimenter. Serielle 10-foldige fortyndinger (1-10-6μg) af genomisk DNA ekstraheret fra hver prøve DNA blev underkastet nested PCR som beskrevet ovenfor, og minimumsgrænsen for det positive resultat blev omregnet til virusbelastning (kopier/2,5 × 105 celler).

Resultater

PCR-systemets følsomhed blev omhyggeligt bestemt ved 10-foldige fortyndinger af de tre kilder til EBV DNA: Raji og Akata, der begge indeholder et konstant antal kopier af EBV-DNA pr. celle, og det klonede BamHI-L-fragment. Raji indeholder 50 kopier af EBV-genomet pr. celle , og 1 μg genomisk DNA fra Raji-celler svarer til det DNA, der er ekstraheret fra 2,5 × 105 celler, dvs. 1,25 × 107 kopier af EBV-DNA. DNA’et fra Raji blev fortyndet på passende vis, og DNA, der indeholdt 10n kopier (serielle fortyndinger af 10°-104 kopier af virus), blev underkastet amplifikation. Den minimale grænse for et positivt PCR-resultat blev undersøgt. Gentagne undersøgelser viste, at følsomheden var 100 kopier pr. reaktion med reproducerbarhed. Resultaterne var de samme ved brug af Akata DNA og ved fortyndingsforsøget med 10n kopier af BamHI-L-fragmenter blandet med 105μg, 102μg og intet DNA fra navlestrengsblodceller.

Alle PBL fra personer med IM og CAEBV var positive for EBV-genomet. Ni (47 %) af 19 prøver fra EBV-seropositive raske personer var positive. Alle PBL fra seronegative personer var negative.

EBV-DNA i PBL blev kvantificeret og sammenlignet for EBV-seropositive raske kontroller, børn med IM og børn med CAEBV (figur 1). Hos raske EBV-seropositive børn var virusbelastningerne 100-1000 kopier pr. 2,5 × 105 PBL. I PBL fra børn med IM varierede de laveste grænser for positive PCR-resultater fra 10° μg (2,5 × 105 PBL) til 10∼3μg (2,5 × 102/PBL)genomisk DNA, hvilket indikerer, at virusbelastningen var 100-100.000 kopier/2,5 × 105 PBL. Tre blodprøver, der blev udtaget inden for en måned efter sygdomsudbruddet, indeholdt højere belastninger (1000-100 000 kopier/2,5 × 105 PBL). PBL, der blev indsamlet >11 måneder efter udbruddet af IM, havde en tendens til at indeholde mindre mængder virus. Vi fulgte virusbelastningerne hos 4 IM-patienter (figur 2A). Hos alle 4 faldt virusbelastningerne i løbet af det kliniske forløb, men var højere (100-10.000 kopier/2,5 × 105 PBL) end hos de seropositive raske værter.