Novel immunmikroskopisk billeddannelse til detektion af antigen og antistof

oktober 13, 2021
| Ingen kommentarer

Abstract

Detektion og analyse af antigen-antistofreaktion er en af de mest kritiske detektionsteknikker inden for medicin, biologi, miljøvidenskab og fødevaresikkerhed. Traditionelle og klassiske metoder til påvisning af antigen og antistof støder på mange problemer, såsom tidskrævende, høje omkostninger og lav nøjagtighed. Der anvendes en ny billeddannelsesteknik for immune mikrosfærer ved hjælp af mikrolinsen til at teste ændringerne i brydningsindekset før og efter antigen-antistofreaktionen. Den kan hurtigt foretage en kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af antigen-antistofreaktionen uden mærkning, formodificering, eftervaskning og dyre enzymer. Her beskrives og diskuteres dens princip og fordele, opbygningen af et mikrolinse-immunoassay-instrument og dens potentiale i forbindelse med måling af kliniske prøver. Det er lovende at blive udviklet til anvendelse til diagnosticering af kliniske sygdomme.

1. Indledning

Fælles teknikker, der er tilgængelige i dag til antigen- og antistofdetektion, omfatter enzymbundet immunosorbentassay (ELISA), overfladeplasmonresonans (SPR), radioimmunoassay (RIA), kolloidal guld-immunkromatografisk assay (GICT), indirekte immunofluorescensassay (IFA), kemiluminescens-immunoassay (CLIA) og partikelforstærket turbidimetrisk immunoassay (PETIA). ELISA kombinerer forstærkning af den enzymkatalyserede reaktion og den specifikke reaktion af antigenet og antistoffet med høj nøjagtighed og lave omkostninger, men procedurerne er komplicerede og kræver streng tilstandskontrol . SPR blev udviklet i 1990’erne til at påvise interaktionen mellem biomolekyler og andre molekyler, og det kræver ingen mærkning og kan give et hurtigt resultat, men udstyret er dyrt og kræver en stor prøvevolumen . RIA er kendetegnet ved høj følsomhed, pålidelighed og et lavt krav til prøvevolumen. Den anvendes i vid udstrækning til påvisning af proteiner, enzymer og andre molekyler, men radionuklidet er sundhedsskadeligt og ændrer også prøvernes biologiske aktiviteter, hvilket fører til eksperimentelle fejl . Som en ny type immunoassayteknik og en af de mest almindelige metoder til påvisning af antigener og antistoffer er GICT let, enkel og hurtig med lave omkostninger, men dens prøvestørrelse er begrænset med lav følsomhed . CLIA, IFA og PETIA anvendes også i vid udstrækning til påvisning af antigener og antistoffer. Deres fælles fordele er meget nøjagtige, stabile, nemme og hurtige, men med høje omkostninger og stor prøvevolumen .

En immunmikrolinse-billeddannelsesteknik til test af ændringen af brydningsindekset kan bryde begrænsningerne i de ovennævnte metoder. Den er hurtig, følsom og enkel med ikke-forurening og lave omkostninger til detektering og forventes at blive bredt anvendt til primære medicinske institutioner . Denne teknik består af parallel lysbestråling, højopløseligt kamera, intelligent analysesoftware, autofokus og temperaturkontrolsystemer med en multiwell-mikrolinseprøveprøveprøveprøveplade og kan opnå multipass-detektion af antigen og antistof . Det højopløselige kamerasystem kan opfylde kravene til mikrolensbilleder, og brugen af temperaturstyring, autofokus og automatiske intelligente analysesystemer kan i høj grad reducere fejl i eksperimenter for nøjagtig måling.

2. Princip for mikrolens-immunoassay

Mikrolens er en cylinderformet linse med den ene ende af sfærisk overflade og den anden ende er en plan overflade. Den har en stærk forstærkningseffekt og forbedrer billeddannelsesevnen af traditionelle optiske mikroskoper betydeligt . Når en mikrolinse med en radius på og et brydningsindeks (RI) på nedsænkes i en opløsning af () og belyses med plant lys, er dens billede på grund af brydningsvirkningen et rundt billede med en mørk ring i kanten . Forholdet mellem radius af den lyse plet i billedet og andre parametre såsom , , , og mikrolensensens cylinderhøjde vises som følger :hvor er lysets indfaldsvinkel til mikrolensens kugleformede top og . På grundlag af denne formel kan de øjeblikkelige ændringer af mediet bestemmes ved at måle radius af den lyse plet i billedet og radius af mikrolinsen. Da optisk brydning finder sted med lysets hastighed, kan enhver øjeblikkelig RI-variation i det omgivende medium for en mikrolense straks medføre en ændring i radius af den centrale lyse plet. Metoden kan derfor overvåge øjeblikkelige RI/koncentrationsændringer med et højhastighedskamera til billeddannelse (figur 1).

(a)
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)

(f)
(f)

(a)
(a)(b)
(b)(c)
(c)(d)
(d)(e)
(e)(f)
(f)

Figur 1
Immune mikrosfærer afbildes i forskellige opløsninger ved hjælp af mikrolinsen. (a) Grundprincip for billeddannelse af immune mikrosfærer. Billeder af en mikrolinse er vist i vand med bølgelængden 532 nm ved 25 °C (b), i vand med bølgelængden 532 nm ved 37 °C (c), i vand med bølgelængden 633 nm ved 25 °C (d), i ethanol med bølgelængden 532 nm ved 25 °C (e) eller i serum med bølgelængden 633 nm ved 37 °C (f), henholdsvis.

3. Struktur og funktioner i et mikrolinse-immunoassayinstrument

Som vist i figur 2 udgør en parallel lyskilde, billeddannelse med høj opløsning, automatisk intelligent analyse, autofokus- og temperaturkontrolsystemer og en multiwell-mikrolens-testplade et mikrosfære-immunoassayinstrument . Når den parallelle lyskilde udsender parallelt lys til mikrolinsen, opnår det højopløselige autofokus-billeddannelsessystem et billede med fokus på millisekunder. Derefter analyseres immunmikrosfærebillederne af det intelligente analysesoftwaresystem for at udlede værdierne for og samt koncentrationen af antigen/antistof. Temperaturstyringssystemet har til formål at justere de forskellige temperaturer, der er nødvendige for forskellige antigen-antistofreaktioner. Hele processen tager ikke mere end 2 minutter.

Figur 2
Strukturen af et mikrolinse-immunoassay-instrument. Det omfatter parallel lysbestråling, autofokus, billeddannelse med høj opløsning, intelligent analysesoftware, temperaturkontrolsystemer og en testplade med flere brønde med mikrolinser.

3.1. Parallel Light Irradiation System

LED som en kilde til parallelt lys producerer et cylindrisk parallelt belysningsområde, som svarer til en original kondensator med fordele som lave omkostninger, lang levetid, perfekt lysende ydeevne og lille skala . Som vist i figur 3 kan der modtages faktisk parallelt lys på grund af linsens refraktion . I LED’ens bestrålingsområde kan linsen ændre lysets retning og fordeling ved at konfigurere relevant linse, således at det faktiske parallelle lys opnås (figur 3).

Figur 3
Princippet for det parallelle lysbestrålingssystem. Linse 1 og linse 2 fokuserer det lys, der udsendes af LED. Derefter går det fokuserede lys gennem en optisk tunnel og en blænde for at blive projiceret til linse 3. Endelig opfanges det egentlige parallelle lys af linsen.

3.2. Autofokus-billeddannelsessystem med høj opløsning

Dette system består af et digitalkamera med høj hastighed og et autofokussystem. På nuværende tidspunkt har billedhastigheden i nogle kommercielle digitalkameraer oversteget 10.000 billeder pr. sekund . Derfor kan det højopløselige billeddannelsessystem opnå overvågning i realtid af dynamiske ændringer af RI i opløsningen. Et CCD-kamera med højpixelkamera spiller en vigtig rolle for opnåelse af højopløselige billeder af mikrolinser . Kernen i autofokussystemet består af billedidentifikation, billedbehandling og kontroldele . De billeder, der indsamles af kamerasystemet, analyseres, og klarhedsvurderingen vises. I henhold til denne evaluering køres systemet automatisk til et passende område eller en passende retning, indtil opløsningen af de indsamlede billeder opfylder det forudindstillede krav.

3.3. Automatisk intelligent billedgenkendelses- og analysesystem

Det automatiske intelligente analysesystem udfører hovedsagelig billedgenkendelse og dataanalyse af mikrolinsebillederne for at overvåge den øjeblikkelige variation af i dens billede og derved udlede ændringen af brydningsindekset i prøveopløsningen under antigen-antistofreaktionsprocessen. Dens nøjagtighed er tæt forbundet med billedkvaliteten, og parametre som f.eks. pixel, pixelstørrelse og opløsning har direkte indflydelse på målingen af RI . Hvis CCD-digitalkameraet med ≥10 millioner pixel og en lille pixelstørrelse på under 3 nm og en mikrolinse med en radius på 600 μm udnyttes, bestemmes ændringen i brydningsindekset ved ændringer i forholdet mellem det centrale lyse punkt og forholdet mellem den ydre ringradius, således at den målte ændring i brydningsindekset kan nå op på 10-6 .

3,4. Temperaturstyringssystem

Temperaturstyringssystemet er en gennemsigtig hærdet glasplade med en tynd film af indiumtinoxid og styres af en PID (proportional-integral-derivativ)-temperaturregulator med høj nøjagtighed. Det gør det muligt for temperaturen af prøven i multiwell-mikrolens-testpladen hurtigt at nå en indstillet værdi på 2 min og holdes inden for et ændringsområde på 0,1 °C for at gøre antigen-antistofreaktionen effektiv .

3.5. Mikrolens-testplade

En multiwell-mikrolens-plade er specielt designet til et mikrolens-immunoassay-instrument. Den er fremstillet af polymethylmethacrylat (PMMA)-materiale og er generelt fremstillet som 2 eller 16 trapezformede brønde for at opfylde forskellige detektionskrav. Inde i hver brønd er der i bunden en mikrolinse med en radius på flere hundrede mikrometer. Anvendelse af mikrolinsepladen giver en objektiv betingelse for multikanaldetektion. Da diameteren på brøndens underside kun er ca. 2 mm, er flere mikroliter prøveopløsning tilstrækkelig til at drukne mikrolinsen til antigen-antistofdetektion.

4. Anvendelse af systemet til billeddannelse med immunmikrosfære

4.1. Måling af antigen-antistofreaktion

Huang og hans kolleger påviste forskellige typer af antigen-antistofreaktioner og fandt ud af deres regelmæssige kendetegn. For det første ændrede brydningsindekset sig med reaktionstiden i processen med antigen (Ag)-antistof (Ab)-reaktionen. For det andet var der tre faser i variationen af RI med reaktionstiden, herunder hurtigt stigende, relativt stabile og langsomt aftagende perioder. Den første fase var relateret til kombinationen af Ag og Ab, således at RI steg pludselig med den hurtige kombination af Ag og Ab for at danne komplekser. RI er maksimal i den anden fase. For det tredje havde koncentrationen af Ag eller Ab en stor indflydelse på RI. Ved at opnå RI-ændringen som en funktion af Ag- eller Ab-koncentrationen kan deres indhold i de testede prøver således beregnes ved hjælp af en tilpasningskurve. For det fjerde ville forskellige antistoffer, såsom fange-AB og prøve-AB, også have indflydelse på variationen af RI. Ved hjælp af denne teknik til måling af antigen-antistofreaktioner ved hjælp af flere Ag-Ab-systemer blev forholdet mellem ændringen i brydningsindekset og koncentrationerne af flere typer af antigen-antistofopløsninger (interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, placenta alkalisk fosfatase (PAP) Ag-Ab, kallikrein 6 (KLK6) Ag-Ab, humant choriongonadotropin (HCG) Ag-Ab, cardiac troponin (cTnI) Ag-Ab, fedtsyrebindende proteiner (FABP) Ag-Ab og C-reaktivt protein (CRP) Ag-Ab-løsninger) kunne opnås (figur 4). Da vi ved, at associeringen og dissociationen af antigen-antistofkomplekset er en dynamisk proces, kan man på grundlag af kurven for RI vs. tid og beregning af den afledte værdi af med tiden, kan man også få oplysninger om associerings- og dissociationshastighedskonstanterne og (figur 4(a)) og andre termodynamiske parametre ved hjælp af følgende ligning:

(a)
(a)
(b)
(b)
(c)
(c)

(a)(a)(b)
(b)(c)
(c)

Figur 4
Refraktivt indeks ændrer sig med antigen-antistofreaktioner. (a) Sammenhænge mellem refraktionsindekset for IFN-γ- eller PAP-antigen-antistofreaktionen og dens tid. (b) Forholdet mellem og KLK6- eller CRP-antigenkoncentrationerne blev bestemt, henholdsvis når det monoklonale Ab eller polyklonale Ab blev tilsat det tilsvarende antigen. (c) Forholdet mellem henholdsvis og HCG- og cTnI- eller FABP-antigenkoncentrationer blev analyseret, når dets capture Ab eller probing Ab blev tilsat til det tilsvarende antigen. Ag: antigen; Ab: antistof; : ændring af brydningsindeks; IFN-γ: interferon-γ; PAP: placenta alkalisk fosfatase; KLK6: kallikrein 6; HCG: humant choriongonadotropin; cTnI: cardiac troponin; FABP: fedtsyrebindende proteiner; CRP: C-reaktivt protein.

4.2. Måling af kliniske prøver

Den immunmikrosfæriske billeddannelsesteknik blev yderligere anvendt til at teste kliniske prøver. 36 kliniske prøver blev påvist ved denne for koncentrationer af CRP Ag. Dens relative standardafvigelse er ca. 2-10 % i forhold til immunokromatografi, og korrelationskoefficienten mellem de resultater, der er opnået på de to måder, når helt op på 0,989 (figur 5). Det er velkendt, at klinisk hæmolyserede serumprøver i høj grad kan påvirke nøjagtigheden af de resultater, der påvises ved hjælp af traditionelle metoder. Derimod er billeder af mikrolinsen i hæmolyserede prøver stadig klare ved hjælp af denne teknik. De relative fejl mellem de påviste antigenværdier i prøverne med hæmolyse og prøverne uden hæmolyse er kun ca. 2 %, hvilket viser, at de hæmolyserede serumprøver har mindre indflydelse på nøjagtigheden af resultatet.

Figur 5
Måling af 36 kliniske prøver for C-reaktivt proteinantigen ved hjælp af immunmikroskopisk billeddannelse i sammenligning med immunokromatografi.

5. Feasibility of the Immune Microsphere Imaging for Antigen and Antibody Detection

De fleste antigener er proteiner, mens et par stykker er polysaccharider, nukleinsyrer og andre stoffer, og alle antistoffer er proteiner. Da proteinet indeholder en stor mængde amido og carboxyl, får disse polære grupper de kolloidale partikler til at producere en elektrisk ladning på grund af den elektrostatiske virkning, og partiklerne med samme ladning blev frastødt hinanden . Samtidig reagerer de polære grupper, der er stærkt hydrofile, med vandmolekyler og danner et hydreringslag for at producere et hydrofilt kolloid, hvilket sikrer, at proteinet ikke agglomererer og danner et bundfald, så de kolloidale partikler er ensartet spredt i en opløsning .

Når antigenet kombineres med antistof, reduceres eller forsvinder den elektriske ladning af kolloidale partikler, og hydreringslaget forsvinder også eller bliver tyndt. Proteinet ændrer sig fra det hydrofile til det hydrofobiske kolloid . I elektrolytmiljøet agglomererer kolloidpartiklerne yderligere for at danne antigen-antistofkomplekser, der kan realiseres af øjnene . Brydningsindekset for det hydrofile og det hydrofobiske kolloid er markant forskelligt. Derfor kan denne teknik overvåge dynamiske ændringer af brydningsindekset for at vurdere, om der forekommer antigen- og antistofreaktioner i en opløsning. Der kan opstilles en standardkurve i overensstemmelse med forholdet mellem antigen- og antistofkoncentrationen og deres reaktionstid. Komplekset bliver større i takt med antigen-antistofreaktionen, og ændringen af brydningsindekset bliver også mere tydelig. Ved hjælp af standardkurven er det let at kvantificere koncentrationen af detekteret antistof eller antigen.

Det blev påvist, at et antistof, der er komplementært til epitoper af forskellige antigener, faktisk ville inducere en lignende RI-forøgelse i Ag-Ab-reaktionen med den billeddannende immunoassay med mikrolinser. Som vist i figur 4(b) og 4(c) blev der udført antigenmålinger ved hjælp af capture Ab og probing Ab eller monoklonalt Ab og polyklonalt Ab for et bestemt antigen. Af kurverne kan man se, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem de to typer antistoffer med hensyn til at inducere ændringer under Ag-Ab-reaktionen, hvilket indikerer, at mikrolinse-immunoassayet med billeddannelse kan anvende forskellige typer antistoffer, enten capture eller probing Ab og monoklonalt eller polyklonalt Ab til detektion. Ikke desto mindre foretrækkes monoklonalt Ab til mikrolinse-immunoassay, da det ikke blot inducerer en større reaktion på grund af dets højere affinitet til antigenet, men også reducerer muligheden for falske positive krydsreaktioner, således at antigener kan påvises ved lavere koncentrationer . Samlet set er krydsreaktion teoretisk set uundgåelig for denne teknik ligesom andre midler, der indgår i immunoassay. Med andre ord afhænger specificiteten af den immune mikrolinse-billeddannelse helt og holdent af de udvalgte antistoffer mod målantigenet. Derfor er det meget vigtigt at screene passende antistoffer og optimere Ag-Ab-reaktionssystemet.

6. Konklusioner

Denne immunmikroskopiske billeddannelsesteknik kan hurtigt og nøjagtigt måle RI af forskellige prøver og overvåge ændringer af RI i realtid i forbindelse med antigen- og antistofreaktionsprocessen. RI ændrer sig med ændringer i koncentrationen af Ag eller Ab. I henhold til RI-ændringen som en funktion af Ag- eller Ab-koncentrationen kan indholdet af prøverne således beregnes kvalitativt og kvantitativt uden mærkning, formodificering, eftervaskning og dyre enzymer. Sammenlignet med konventionelle detektionsmetoder er fordelene ved denne metode nøjagtig, pålidelig, hurtig (færdig inden for flere minutter) og enkel uden forurening. Desuden er dens detektionsgrænse så lav som pg/ml, hvilket kun kræver flere μl nok til at udføre detektion, og den er også velegnet til hæmoliserede kliniske prøver, som er vanskelige at detektere med traditionelle metoder. Desuden er den ikke indgribende for prøverne. Det parallelle lysbestrålingssystem, et højopløseligt kamerasystem, et automatisk intelligent analysesystem, et autofokussystem, et temperaturstyringssystem og et porøst detektionskort med mikrolinser udgør mikrokugleimmunoassayinstrumentet. Det er lille og let at bære.

Det er velkendt, at antigen-antistofreaktionen i høj grad påvirkes af sin egen koncentration, temperatur, pH-værdi og elektrolytopløsning. Af denne grund tages disse faktorer i betragtning i mikrolinse-billeddannelsessystemet for at holde dataene stabile ved at afbalancere deres ændringer. Dette system kan f.eks. optimeres ved at vælge egnede materialer til en testplade, der tilbyder et antigen-antistofreaktionssted, og ved at gøre pladen hydrofil for at undgå hydrofob interferens. Detektionsnøjagtigheden kan yderligere forbedres ved at justere antigen-antistof-forholdet, screene det rette fortyndingsmiddel, modificere dem med metalioner osv.

Detektion af antigen og antistof er relativt vigtig inden for biomedicinsk undersøgelse, klinisk diagnose, lægemiddelanalyse, fødevaresikkerhed og miljøovervågning. Med folks bekymring for miljøsundhed, fødevaresikkerhed og sundhedspleje er det blevet et presserende samfundsmæssigt behov at udvikle et følsomt instrument med lav pris, høj nøjagtighed, lille størrelse, bærbarhed og enkel betjening. Således er denne immune mikrolinse-billeddannelsesteknik lovende til at blive bredt anvendt på forskellige områder og passende til at blive særligt populæriseret i lokalsamfundet og på landet.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Autors bidrag

Jiahui Liang og Xiaotian Ye har bidraget ligeligt til dette arbejde.

Akkreditering

Vi er taknemmelige over for Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (bevillingsnummer: 20160404020146) og National Natural Science Foundation of China (bevillingsnumre: 81172824 og 30971465) for deres finansieringsstøtte.

Articles