En biologi af p38-kinase

Den p38 MAPK-signalvej har været et af de mest intensivt studerede emner i biologien siden dens første identifikation for mere end 10 år siden. Interessen for denne vej har primært været drevet af to faktorer. For det første aktiveres denne signalvej af en lang række stimuli og er involveret i en lang række sygdomme, især inflammation. For det andet gav den tidlige tilgængelighed af selektive p38-hæmmere de kritiske redskaber, der var nødvendige for yderligere at kunne beskrive den rolle, som proteinkinaser spiller i signalveje, og midlerne til at forfølge det terapeutiske potentiale ved p38-hæmning. I løbet af de sidste 5 år er et stort antal p38-hæmmere således gået ind i kliniske forsøg.

På det tidspunkt, hvor p38 MAP-kinase blev opdaget, var det første medlem af MAP-kinasefamilien, ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK), allerede blevet identificeret. Man var imidlertid ikke klar over, at der fandtes yderligere to underfamilier af threonin/tyrosinkinaser med dobbelt specificitet (p38 og JNK). I 1994 identificerede flere forskergrupper uafhængigt af hinanden en ny kinaseaktivitet (Freshney et al., 1994; Han et al., 1994; Han et al., 1994; Rouse et al., 1994;), og efterfølgende førte kloning af det humane cDNA til identifikation af p38 α (Lee et al., 1994). Kort efter blev tre andre splejsningsvarianter af p38-familien, p38β, P38y og p38h, identificeret (Jiang et al., 1996, Jiang et al., 1997, Kumar et al., 1997). To medlemmer af familien, p38α og β, er ubiquitært udtrykt, men differentielt reguleret i forskellige celletyper, mens de to andre er mere begrænsede i vævsfordelingen. Til dato er p38α, som er blevet impliceret i et væld af sygdomme, det bedst forståede medlem af familien (gennemgået i Kumar et al., 2003 og Saklatvala, 2004).

Aktivering af p38 er blevet observeret i forskellige organismer som reaktion på mange stimuli. De ortologer af p38α i gær, orm og frø er blevet impliceret i osmoregulering, stressresponser og cellecyklusregulering. Regulering af p38α i pattedyrceller er også blevet godt undersøgt (gennemgået i Zarubin og Han, 2005). Det er nu klart, at p38α-signalvejen er kompleks og påvirkes ikke kun af stimuli og celletype, men også af forskellige regulatorer og kombinationer af opstrøms aktiverende kinaser. Det er velkendt, at der er to vigtigste opstrøms aktiverende kinaser for p38α, MKK3 og MKK6. Desuden findes der en MKK-uafhængig mekanisme for p38α-aktivering, der involverer transformerende vækstfaktor-aktiveret proteinkinase 1 (TAK1)-bindende protein (TAB) (Ge et al., 2002). Aktiveringen af p38α kan opnås ved autofosforylering efter interaktion med TAB1. Det foreslås også, at p38 negativt regulerer TAK1-signalering ved fosforylering af TAB1 (Cheung et al., 2003). Nedstrøms for TAK1-signalering er IKK, som tjener som et vigtigt aktiveringstrin for Tpl2-kinasen og dens nedstrømsmål, MEK1 og ERK (Waterfield et al., 2004). Hæmning af p38 resulterer således i en opregulering af TAK1, hvilket fører til ERK-aktivering. Dette forklarer, hvorfor aktivering af ERK ofte observeres i celler, der behandles med p38α-hæmmere. Dette fund understreger behovet for at forstå potentiel ikke-lineær crosstalk mellem kinase-signalveje. Ud over TAK1 er andre opstrøms kinaser (MAP3K) også impliceret i aktiveringen af p38α og dets nære nabo, JNK. Små GTP-bindende proteiner som Rac1 og Cdc42 og deres interaktion med PAK (p21-aktiverede kinaser) og MLK1 bidrager også til aktiveringsprocessen.

Downstream-substrater af p38 MAP-kinaser er MAPKAPK2 (Kotlyarov et al, 2002) og MAPKAPK3 (McLaughlin et al., 1996), som fosforylerer forskellige substrater – herunder lille heat shock protein 27 (HSP27), lymfocytspecifikt protein 1 (LSP1), cAMP response element-binding protein (CREB), transkriptionsfaktor (ATF1), SRF og tyrosinhydroxylase. Af særlig interesse er MAPKAPK2-substratet tritetraprolin, et protein, der destabiliserer mRNA (Tchen et al., 2004). MNK er et andet p38-substrat, der synes at være involveret i translationsinitiering, da det fosforylerer eIF-4E (Waskewicz et al., 1997). Desuden er p38-aktiveret kinase (PRAK) og mitogen- og stress-aktiveret proteinkinase (MSK1) også kendt for at blive aktiveret af p38α, selv om MSK1 også aktiveres af ERK (Deak et al., 1998). Det er ikke overraskende, at der er et stort antal transkriptionsfaktorer, der reguleres af p38 (gennemgået i Zarubin og Han, 2005). Nogle eksempler omfatter aktiverende transkriptionsfaktorer 1, 2 og 6, SRF accessorisk protein (Sap1), GADD153, p53, c/EBPb, myocytforstærkende faktor 2C (MEF2C), MEF2A, DIT3, ELK1, NFAT og high mobility group-box protein (HBP1). Andre ubeslægtede proteiner, såsom cPLA1, Na+/H+-veksler isoform-1 (NHE-1), tau, keratin 8 og stathmin har også vist sig at være substrater for p38α.

Mekanismen, hvormed p38 MAP-kinasehæmmere undertrykker ekspression af inflammatoriske cytokiner, har været undvigende. Inflammatorisk genekspression er stærkt reguleret på både transkriptionelt og post-transkriptionelt niveau. Tidlige undersøgelser, der undersøgte virkningerne af p38-hæmmere i humane monocytter, tydede på, at reguleringen af inflammatorisk cytokinbiosyntese (primært IL-1 og TNF) fandt sted på post-transkriptionelt niveau. Efterfølgende blev det klart, at mRNA-stabilitet kan påvirkes negativt af hæmning af p38-banen (Frevel et al., 2003). Denne observation gav anledning til yderligere undersøgelser, der viste, at andre inflammatoriske reaktionsproteiner, såsom COX-2, blev påvirket på lignende måde (Lasa et al., 2000). Andre mRNA’er, der stabiliseres af p38, omfatter MIP-1a, gm-CSF, VEGF og MMP-1 og -3 (Dean et al., 2004). Det er interessant, at MAPKAPK-2, et substrat for p38, også er involveret i mRNA-stabilisering ved p38. Katalytisk aktive former af MAPKAPK-2 stabiliserer reporter-mRNA, mens dominerende negativ MAPKAPK-2 blokerer dets ekspression (Winzen et al., 1999).

Et fælles kendetegn ved strukturelle træk, der påvirker mRNA-stabiliteten, er det AU-rige motiv i den forlængede 3′UTR. Dette motiv blev først beskrevet af Shaw og Kamen (1986). Der findes tre forskellige klasser af sådanne AU-rige elementer (ARE’er): den ene indeholder et lille antal ARE’er (f.eks. c-Fos), den anden indeholder et større antal ARE’er med flere pentamere (f.eks. TNFα, COX-2 osv.), og den tredje klasse indeholder ARE’er, der mangler pentamere, men indeholder U-rige regioner. ARE’erne er rettet mod mRNA med henblik på hurtig deadenylering i cellerne. Generelt har p38-regulerede ARE’er lignende strukturelle motiver med flere, overlappende pentamere i 3′UTR’erne. Der er dog undtagelser, såsom MMP-1 og -3 (Reunanen et al., 2002) og tristetraprolin (Mahtani et al., 2001, Tchen et al., 2004), mRNA’er, der indeholder mindst én pentamerisk, og U-rige sekvenser. Den præcise mekanisme, hvormed p38 regulerer mRNA-stabilitet, er fortsat uklar. Man mener, at downstream kinasen MAPKAPK-2 er involveret, samt et flygtigt ARE-bindende protein. Der er en række kandidater (Dean et al., 2004), men ingen af dem opfylder alle kriterierne for at være det protein, der forbinder p38-baner og ARE-holdigt mRNA. Af disse er tristetraprolin en interessant mulighed, selv om det hovedsagelig tjener som en “off-switch” i mRNA-stabiliseringen.

En stor mængde data fra prækliniske undersøgelser tyder på en central rolle for p38 i immunologiske og inflammatoriske reaktioner (Dong et al., 2002; Kracht og Saklatvala, 2002; Kumar et al., 2003). Det er nu kendt, at p38-vejen aktiveres selektivt i Th1-effektor-T-celler som reaktion på IL-12 og IL-18. Produktionen af Th1-cytokiner, såsom interferon gamma, hæmmes af p38-hæmmere, mens produktionen af IL-4, et Th2-cytokin, ikke hæmmes. I makrofager reguleres en række inflammatoriske cytokiner – f.eks. TNF, IL-1, IL-6 og IL-8 – gennem p38-veje. MKK3 knock-out-musembryo-fibroblast reagerer på TNF, men ikke på IL-1, UV eller sorbitol, hvilket indikerer en rolle for MKK3 i TNF-, men ikke IL-1-virksomheden. I p38α knock-out musemusembryofibroblaster er den IL-1-inducerede IL-6-produktion imidlertid alvorligt svækket. Disse data tyder på, at forskellige ligander vil fremkalde funktionen af forskellige kinaser i p38-vejen. Sammen med en lang række genetiske og farmakologiske beviser in vivo understøtter disse resultater p38 som et gyldigt mål, hvis hæmning kunne give terapeutiske fordele i en række inflammatoriske sygdomme, især reumatoid arthritis (Foster et al., 2000). Andre muligheder for farmakologisk intervention omfatter hjertehypertrofi, Alzheimers sygdom, vaskulær skade, psoriasis og inflammatorisk tarmsygdom.