PARADIGMER FOR ROLEN AF CD40-CD40L INTERAKTIONER VED SYGDOM

Transplantation. Transplantationskirurgi ville ikke have nået den grad af succes, der er set i de seneste årtier, uden udviklingen af effektive immunosuppressive midler, der minimerer risikoen for transplantationsafstødning. Monoklonalt antistof (MAb) mod CD40L er blevet anvendt som immunosuppressiv behandling i mange dyretransplantationsmodeller. Hos primater forsinker administration af anti-CD40L MAb afstødning af allografttransplantater, mens kombination med CTLA4Ig, et chimært protein bestående af det ekstracellulære domæne af celleoverflademolekylet CTLA-4 og Fc-regionen af humant IgG1, der blokerer CD28-B7-vejen, har additive og synergistiske virkninger. Denne kombinationsbehandling opretholder overlevelsen af nyreallotransplantater hos primater og øger overlevelsen af hudtransplantater hos mus (53, 69). Skift til anti-CD40L MAb-behandling efter 60 dages konventionel immunosuppression med CsA var en effektiv behandling i en nyreallotransplantatmodel med aber, selv om CsA er kendt for at nedregulere CD40L-ekspression på T-celler (7). Det er blevet påvist, at CD40L-genekspressionen stiger fire gange i tilfælde af akut afstødning. Dette kunne tjene som en ikke-invasiv metode til overvågning af allograftfunktionen og også til bestemmelse af det biologiske respons på klassiske immunosuppressive midler såsom CsA og tacrolimus, som begge er kendt for at hæmme CD40L-induktion (54). I dyretransplantationsmodeller undertrykker calcineurinininhibitorer CD40L-ekspression på T-celler in vitro, men ikke i lymfoidt væv, hvilket indikerer, at CD40-CD40L-vejen fortsat er funktionel under behandling med disse midler, hvilket kan bidrage til allotransplantationsafstødning i kliniske omgivelser (63).

Atherosklerose. Den nuværende opfattelse af åreforkalkning, som er den mest udbredte dødelige sygdom i den vestlige verden, er en kronisk, degenerativ, inflammatorisk sygdom, hvor immunsystemet menes at spille en vigtig rolle. CD40 og CD40L overudtrykkes i eksperimentelle og humane åreforkalkningslæsioner. CD40-ligering på aterom-associerede celletyper, såsom endotelceller, glatte muskelceller og makrofager, fører til øget ekspression af mediatorer for udvikling af aterosklerose, såsom cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer og metalloproteinaser. Blokering af CD40-CD40L-interaktioner med anti-CD40L MAb i mus resulterer i mindsket dannelse og progression af musearoma, men fremmer også sådanne ændringer i læsionens biologi og struktur, som kan være vigtige for plakstabilisering i den menneskelige sygdom (52).

Pladerne udtrykker også CD40L og menes at bidrage væsentligt til rekruttering af inflammatoriske celler til det beskadigede endotel in vivo (5). Aktiverede T-celler, der udtrykker CD40L, er placeret i den aterosklerotiske karvæg, hvilket understøtter hypotesen om, at aktiverede CD4+ T-celler kan orkestrere den aterosklerotiske proces (43).

Andre sygdomme, hvor CD40-CD40L-parret kan spille en rolle, er kort skitseret i tabel 1. En kort diskussion af denne interaktions rolle i de autoimmune sygdomme systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid arthritis (RA) og polymyositis følger nedenfor.

SLE. (i) CD40L-ekspression i menneskelig SLE (tabel 2). Desai-Mehta et al. har rapporteret, at perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra patienter med aktiv lupus udviser en 21-dobbelt stigning i procentdelen af CD40L+ CD4+ celler sammenlignet med raske personer. Ved yderligere stimulering af PBMC’erne med anti-CD3 MAb steg procentdelen af CD40L+ CD4+ celler fem gange hos raske personer, men kun 1,4 gange hos patienter med aktiv SLE. Procentdelen af CD40L+ T-celler forblev dog stadig højere i gruppen med aktiv-SLE. PBMC fra patienter med SLE i remission opførte sig på samme måde som i kontrolgruppen. Der blev gjort lignende observationer med hensyn til CD40L-ekspression af CD8+ T-celler, der var frisk isoleret fra aktive SLE-patienter (22 gange højere ekspression end i kontrolgruppen). B-celler overudtrykker CD40L hos aktive SLE-patienter på et niveau, der er sammenligneligt med det niveau, der er observeret hos de aktiverede T-celler. Normale humane B-celler udtrykker meget lave niveauer af CD40L og kun når de manipuleres, i modsætning til aktive-SLE B-celler, der udtrykker CD40L spontant (12).

I en undersøgelse offentliggjort af Koshy et al. viste aktiverede PBMC fra raske personer eller sygdomskontrolpatienter højintensiv ekspression af CD40L med et gradvist fald til nær baselineværdierne efter 48 timer, mens lupus-PBMC fortsat udviste signifikant højere niveauer af CD40L på dette tidspunkt. Der blev ikke fundet nogen tilsyneladende korrelation mellem CD40L-ekspression og sygdomsaktivitet i denne undersøgelse (33).

Higuchi et al. bekræftede disse resultater i både SLE og murin lupus, hvilket tyder på, at ektopisk CD40L-ekspression i lupus B-celler kan spille en afgørende rolle i udviklingen af SLE. Transgene lupus-prone-mus, der udtrykker CD40L på B-celler, producerer spontant autoantistoffer, og desuden udvikler halvdelen af disse mus glomerulonefritis med immunkompleksaflejring (22). Devi et al. har også bekræftet den høje ekspression af CD40L på T- og B-lupusceller. Mere specifikt udtrykker 45 % af T-cellerne fra SLE-patienter CD40L sammenlignet med kun 8 til 18 % af T-cellerne fra raske personer eller RA-patienter. Desuden havde 30 % af de 48 undersøgte SLE-patienter også et øget udtryk af CD40L på B-celler (13). I modsætning til ovenstående resultater er der imidlertid én rapport, hvor der ikke blev fundet nogen ændringer i CD40L-ekspressionen i lupus-lymfocytter. I stedet rapporterede disse forfattere om et højt udtryk af CD86 på SLE B-celler, som også er et vigtigt kostimulerende molekyle (3). En anden undersøgelse har rapporteret, at monocytter fra patienter med aktiv SLE udtrykker CD40L afvigende. Treogtyve patienter med aktiv SLE blev undersøgt og sammenlignet med 16 raske personer. Resultaterne viste en syvdobbelt stigning i frekvensen af CD40L-udtrykkende perifere monocytter fra SLE-patienter sammenlignet med raske personer. CD40L-ekspression blev verificeret på både mRNA- og proteinniveau og korrelerede signifikant med sygdomsaktivitet (28).

CD40L spaltes fra celleoverfladen af aktiverede T-celler af en matrixmetalloproteinase, hvorved sCD40L frigives, et molekyle på ca. 18 til 20 kDa, som danner homotrimere. I en rapport, der undersøger den funktionelle rolle af sCD40L, konkluderes det, at sCD40L kan fremkalde aktivering og differentiering af B-celler. Plasma sCD40L-niveauerne var betydeligt højere hos aktive SLE-patienter end hos raske donorer. Disse niveauer korrelerede med sygdomsaktivitet, vurderet ved SLEDAI, og cirkulerende anti-dobbeltstrenget DNA (dsDNA) autoantistoftitere. Det er blevet antaget, at de høje niveauer af sCD40L, der findes hos aktive SLE-patienter, kan spille en patogen rolle i vaskulitis og i den nefrit, der forekommer ved aktiv lupus. Forfatterne foreslog, at sCD40L-niveauerne i fremtiden kunne tjene som en prædiktiv markør for SLE-sygdomsudbrud (27). Vakkalanka et al. viste også signifikant højere gennemsnitskoncentrationer af sCD40L hos lupuspatienter end hos sygdomskontroller og raske personer. Mere specifikt blev 66 patienter med SLE undersøgt og sammenlignet med 30 sygdomskontrolpatienter og 23 raske personer. Hos de raske personer var sCD40L næsten ikke påviseligt, mens 38 patienter med SLE havde et sCD40L-niveau på over 2 ng/ml (med en gennemsnitskoncentration på 2,61 ± 2,15 ng/ml), og kun 7 sygdomskontrolpatienter havde et sCD40l-niveau på over 1 ng/ml. Patienterne blev inddelt i tre grupper, svær, moderat og mild, i henhold til de kliniske manifestationer. Patienter med svær SLE havde en gennemsnitskoncentration af sCD40L på 3,93 ± 2,86 ng/ml, patienter med moderat SLE havde en gennemsnitskoncentration af sCD40L på 2,81 ± 1,57 ng/ml, og endelig havde patienter med mild sygdom en gennemsnitskoncentration af sCD40L på 1,52 ± 1.06 ng/ml, hvilket indikerer en korrelation mellem sCD40L-niveauet og sygdomsaktivitet (62).

Mens CD40L-induktion på aktiverede normale T-celler hæmmes i tilstedeværelse af CsA, er det af interesse, at denne effekt ikke gælder for SLE T-celler. En undersøgelse af CD40L-ekspression i human lupus konkluderede, at CsA ikke kunne hæmme den langvarige og øgede CD40L-ekspression, der blev observeret in vitro på anti-CD3 MAb-aktiverede lupus-T-celler. Resistens over for CsA var uafhængig af sygdomsaktivitet. Cirkulerende lupusmonocytter udviser også en fremtrædende resistens over for CsA’s hæmmende virkninger på CD40L-ekspression. Disse resultater tyder på, at CD40L-induktion på SLE T-celler kan være reguleret af en calcium/calcineurin-uafhængig vej (29).

Det er uklart, hvorfor CD40L-ekspressionen er højere hos patienter med SLE, og om denne overekspression har patogenetiske implikationer. Det er blevet foreslået, at SLE-T-lymfocytter, når de aktiveres ved TCR-engagement, favoriserer en NFAT-dominant profil i stedet for en afbalanceret NFAT-AP-1-transskriptionsfaktorprofil. Dette panel af intracellulære mediatorer fremmer transkription og mRNA-stabilitet af visse gener, herunder CD40L-genet. Tidlig ekspression af CD40L på SLE T-celler kræver den CsA-følsomme NFAT-vej, men langvarig ekspression er mere afhængig af en specifik MAP-kinase, dvs. den ekstracellulære signalregulerede kinase. Øget og vedvarende ekstracellulær signalreguleret kinaseaktivitet i lupus T-celler kunne bidrage til CD40L-overekspression via aktivering af AP-1-transskriptionsfaktoren og muligvis ved at stabilisere CD40L mRNA (10, 68). Cytoplasmatiske Ca2+-flux er supranormale i cirkulerende T- og B-celler fra patienter med SLE, og det er blevet foreslået, at denne abnormitet kan udgøre den molekylære baggrund for den unormale CD40L-ekspression i lupus (38, 40, 64). Der er også tegn på, at manglen på TCR ζ-kæden, som er blevet beskrevet hos SLE-patienter, kan være delvis ansvarlig for det ovennævnte supranormale Ca2+-respons (39, 61). Denne sammenhæng er blevet forstærket af den nylige rapport om, at transfektionel korrektion af TCR ζ-kædemanglen i lupus T-celler fører til en normalisering af de cytoplasmatiske Ca2+-flux (48).

(ii) Anvendelse af anti-CD40L MAb i lupusmodeller og i SLE. CD40/CD40L’s mange funktioner i immunresponset har gjort det til et attraktivt mål for terapeutisk intervention ved autoimmune sygdomme. MAbs mod CD40L blev i første omgang testet i murine lupusmodeller. Behandling af New Zealand Black × New Zealand White (NZB×NZW) F1-mus med kontinuerlige anti-CD40L MAb-infusioner resulterede i en forsinkelse af sygdomsudbruddet i gennemsnitligt 4 måneder, et fald i IgG anti-dsDNA autoantistofniveauet, en forsinkelse i ophobningen af T-celler med den aktiverede hukommelsesfenotype, et fald i antallet af B-celler i milten og en undertrykkelse af Ig-klasseskift og somatiske mutationer. Serumniveauet af IgG anti-dsDNA-antistoffer var 4 til 10 gange lavere end hos ubehandlede aldersmatchede kontroller. Ved ophør af behandlingen blev T-cellefænotypen hos de behandlede mus ikke til at skelne fra kontrollernes, og B-cellerne opnåede en fuldt aktiveret fænotype med forhøjelse af IgG anti-dsDNA-titre og udvikling af proteinuri og progressiv nyresygdom (65).

I en anden undersøgelse blev der anvendt kombinationsbehandling med anti-CD40L-antistof og CTLA4Ig. Kortvarig kombinationsbehandling af NZB×NZW F1 prenefritiske mus resulterede i en forsinket indtræden af nyrefunktionsforstyrrelser i ca. 6 måneder. Efter indtræden af proteinuri var et gentaget behandlingsforløb i stand til at fremkalde remission hos tidligere behandlede mus, men ikke hos tidligere ubehandlede mus. Der var et fald i niveauet af IgG anti-dsDNA autoantistoffer, og murenes milt var markant udtømt for B-celler, selv 16 til 20 uger efter infusionen. Det er blevet postuleret, at CTLA4Ig- og anti-CD40L MAb-behandling kan virke synergistisk for at blokere antiapoptotiske signaler og dermed lette apoptose af B-celler under tidlig B-celleaktivering. Denne behandling forårsagede ikke langvarig global immunosuppression (66).

De lovende resultater, der blev opnået i eksperimentelle dyreforsøg, blev ikke bekræftet i SLE. I lupus hos mennesker er cyclophosphamid fortsat “guldstandarden ” til behandling af større organinvolvering. Cyklofosfamid er et alkylerende middel, som forårsager uspecifik hæmning af immunresponset og klinisk betydelig immunosuppression. Det har betydelige bivirkninger, herunder blærekræft og gonadal svigt, hvilket gør det nødvendigt at finde nye terapeutiske tiltag. Cyklofosfamidadministration har været en etableret behandling af lupusnefritis, en almindelig og frygtelig komplikation af SLE og en af de førende årsager til morbiditet og mortalitet.

Der er offentliggjort to undersøgelser af anti-CD40L MAb-administration i human lupus. I den første, en fase 2, dobbeltblind, placebokontrolleret, multicenterundersøgelse, blev 85 patienter med mild til moderat aktiv SLE indskrevet og modtog 6 injektioner af IDEC-1 (anti-CD40L MAb) eller placebo i løbet af 16 uger. Effektiviteten blev vurderet i uge 20, primært ved hjælp af SLEDAI. Resultaterne viste, at behandlingen med IDEC-1 var sikker og veltolereret, men at der ikke kunne påvises effekt sammenlignet med placebo (19, 26).

Det andet forsøg evaluerede patienter med biopsibevist proliferativ lupus nephritis ved hjælp af BG9588 (anti-CD40L MAb). Otteogtyve otteogtyve patienter med aktiv proliferativ lupus nephritis blev indskrevet og fik 20 mg BG9588/kg kropsvægt med to ugers mellemrum i de første tre doser og med månedlige mellemrum i fire yderligere doser. Resultaterne viste en 50 % reduktion af proteinuri (hvor den var til stede) uden forværring af nyrefunktionen, forsvinden af hæmaturi og en stigning i serum C3-koncentrationen. Anti-dsDNA autoantistoftiterne faldt efter behandlingen med gennemsnitlige reduktioner på henholdsvis 38,8, 50,1 og 25,3 % 1, 2 og 3 måneder efter behandlingen (4). Denne undersøgelse blev afbrudt før tid på grund af tromboemboliske komplikationer. Mere specifikt blev der rapporteret to tilfælde af myokardieinfarkt. De trombotiske virkninger, der komplicerede dette behandlingsregime, rejste vigtige spørgsmål vedrørende fremtidige undersøgelser med mennesker. Det skal bemærkes, at ingen af de patienter, der blev ramt af en trombotisk hændelse, havde påviselige antiphospholipidantistoffer. CD40-CD40L-interaktionens rolle i disse trombotiske komplikationer er fortsat uklar og hypotetisk.

En undersøgelse af 5 patienter med lupus nephritis, der modtog anti-CD40L-behandling, viste, at et kort forløb med denne behandling fører til en reduktion i antallet af IgG anti-DNA-antistofproducerende B-celler, der producerer anti-DNA-antistoffer. Disse ændringer varede ved i flere måneder efter behandlingsophør (25). En lignende undersøgelse af fire patienter med aktiv lupus nephritis, der modtog anti-CD40L-behandling (BG9588), viste, at B-celler, der udtrykker CD38, CD5 og CD27, som betragtes som B-celle-differentieringsmarkører, forsvandt fra periferien under anti-CD40L-behandlingen. Disse ændringer var forbundet med et fald i anti-dsDNA-antistofniveauer, proteinuri og SLE-sygdomsaktivitetsindeks (20).

RA. (i) CD40L-ekspression i RA (tabel 2). RA er en almindelig autoimmun systemisk reumatisk sygdom, der er karakteriseret ved en kronisk vævsdestruktiv proces, der tilskrives et muligt igangværende antigen-drevet immunrespons. Da aktiverede T-celler menes at spille en nøglerolle, er det ikke overraskende, at CD40-CD40L-interaktioner er blevet undersøgt i forbindelse med RA.

Berner et al. undersøgte udtrykket af CD40L på T-celler fra patienter med RA. Der blev undersøgt 62 patienter med RA og 20 raske personer. CD40L var stærkt udtrykt på >10% af T-cellerne hos 29% af RA-patienterne, men på 0% af T-cellerne hos de raske kontrolpersoner. RA-patienter med >10 % CD4+ CD40L+ T-celler havde mere aktiv sygdom. Treogfirs procent af patienterne i denne gruppe havde forhøjede niveauer af C-reaktivt protein, 89 % var reumatoid faktor (RF) positive, og ingen af dem opfyldte American College of Rheumatology-kriterierne for fuldstændig klinisk remission, hvilket tyder på en stærk korrelation mellem sygdomsaktivitet og CD40L-ekspression (2). CD40L-ekspression på høje niveauer kan afspejle øget og langvarig aktivering af lymfocytter, hvilket kan resultere i en øget og langvarig inflammatorisk aktivitet. Ekspression af funktionel CD40L på høje niveauer på T-celler fra patienter med RA blev også påvist af MacDonald et al. (42).

En anden undersøgelse omhandlede CD40-CD40L-signaleringens rolle i RF-produktion. I det sunde immunsystem er autoreaktive B-celler med høj affinitet slettet. Hos raske personer findes der lav-affinitets RF-producerende B-celler i lymfeknuderne, men høj-affinitets RF er ikke påviselig. Ved RA ophobes højaffinitets RF-producerende B-celler i den betændte synovia. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at interaktionen mellem CD40L på aktiverede T-celler og CD40 på RF-producerende B-celler er afgørende, ikke kun for overlevelsen af disse autoreaktive B-celler, men også for RF-syntesen. De to signaler, der er nødvendige og tilstrækkelige for induktion af RF-syntese med høj affinitet in vivo, viste sig at være IgG og CD40-CD40L-interaktion. I mangel af CD40-CD40L-interaktion blev RF B-celler slettet (35).

Cho et al. undersøgte CD40-CD40L-interaktionens rolle i produktionen af vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF). Ved RA har den betændte synovia tumorlignende karakteristika. Perpetuering og udvidelse af den reumatoide pannus afhænger af neovaskularisering, da den omfattende migration af mononukleære celler ind i synovia og pannusovervækst afhænger af eksistensen af et rigt vaskulært bed. VEGF, et heparinbindende dimerisk glykoprotein, er en central mediator for angiogenese og inducerer endothelcelleproliferation og kapillærpermeabilitet. Det blev påvist, at CD40-ligering på synoviale fibroblaster ved CD40L på aktiverede T-celler resulterede i øget produktion af VEGF, som yderligere øges i tilstedeværelse af IL-1, TNF-α og transformerende vækstfaktor β (8). Ligation af CD40 på RA-synoviocytter ved CD40L på aktiverede T-celler i synovia øger produktionen af TNF-α signifikant på en dosisafhængig måde (21). TNF-α er et nøglecytokin i RA-patogenese. Ud over TNF-α øges produktionen af IL-10 også via CD40-CD40L-interaktioner (15). T-celler i synovialvæske fra patienter med RA udtrykker høje niveauer af CD40L sammenlignet med T-celler fra perifert blod fra raske donorers perifere blod, og efter in vitro-aktivering udviser de et langvarigt, højt niveau af CD40L-ekspression. Resultaterne viste, at 8,71 % af T-cellerne i synovialvæske fra RA-patienter var CD40L+ i forhold til 1,74 % i kontrolgruppen (41). Den potentielle rolle, som CD40-CD40L-interaktionen spiller i RA-patogenese, førte til bestræbelser på farmakologisk manipulation af denne akse som en terapeutisk tilgang til patienter med RA.

(ii) Anvendelse af anti-CD40L MAb i dyremodeller af RA. Behandling med anti-CD40L MAb undertrykker udviklingen af kollageninduceret arthritis, som er en dyremodel for RA. Mere specifikt blev udviklingen af ledbetændelse blokeret, og infiltrering af inflammatoriske celler i det subsynoviale væv og brusk erosion blev formindsket (14). I K/B×N-transgene mus, en model for Ig-medieret arthritis, mindskede anti-CD40L MAb-behandling signifikant udviklingen af arthritis, når den blev administreret en uge før udbruddet af klinisk tydelig sygdom, men behandlingen var uden held, når den blev administreret i etableret sygdom (36).

Dermatomyositis/polymyositis. I en undersøgelse, der analyserede 9 patienter med polymyositis og dermatomyositis, blev det observeret, at muskelinfiltrerende T-celler var CD40L+ i alle 9 tilfælde, hvilket tyder på en potentiel rolle for CD40-CD40L-interaktioner i de ovennævnte kliniske enheder (58).