Ingeniørte CRISPR/Cas9-enzymer forbedrer diskrimination ved at bremse DNA-spaltning for at tillade frigivelse af DNA uden for målgruppen

HypaCas9 og Cas9-HF1 viser langsomme observerede spaltningshastigheder

Vi begynder vores kinetiske analyser ved at måle koncentrationen af enzymet på det aktive sted for hver af Cas9-varianterne23,24,25. Måling af mængden af produkt dannet i en titrering af enzym med stigende koncentrationer af DNA afslørede aktive stedskoncentrationer på henholdsvis 31 nM, 26 nM, 23 nM for SpCas9, HypaCas9 og Cas9-HF1 for enzymprøver med en nominel koncentration på 100 nM baseret på absorbans ved 280 nm (Supplerende fig. 1a-d). Vi målte også koncentrationerne af det aktive sted for SpCas9 og HiFiCas925 fra Integrated DNA Technologies (IDT) og observerede lignende koncentrationer af aktivt enzym (Supplerende fig. 1e-f). Det er vigtigt at bemærke, at i hvert enkelt tilfælde var den koncentration af DNA, der var nødvendig for at mætte signalet, lig med koncentrationen af det dannede produkt, hvilket eliminerer bekymringer om, at noget af enzymet kunne binde DNA, men ikke reagere. Alle efterfølgende eksperimenter blev opstillet ved hjælp af koncentrationen af aktivt enzym bestemt i titreringen af det aktive sted.

For at sammenligne kinetikken af on- eller off-target DNA-substrater af SpCas9 med de manipulerede varianter undersøgte vi først tidsforløbet for målstrengen (HNH) spaltning for hvert enzym (Fig. 1 og Supplerende Fig. 2). Data blev tilpasset med enten en enkelt- eller dobbelt eksponentiel funktion ved hjælp af henholdsvis Eq. (1) eller Eq. (2).

$$$Y = A_1e^{ – \lambda _1t} + C$$$
(1)

hvor Y repræsenterer koncentrationen af spaltningsproduktet, A1 repræsenterer amplituden, og λ1 repræsenterer den observerede henfaldshastighed (egenværdi)17.

$$$Y = A_1e^{ – \lambda _1t} + A_2e^{ – \lambda _2t} + C$$$
(2)

hvor Y repræsenterer koncentrationen af spaltningsproduktet, A1 repræsenterer amplituden, og λ1 repræsenterer den observerede hastighed for den første fase. A2 repræsenterer amplituden, og λ2 repræsenterer den observerede hastighed for anden fase.

Sammenligning af de observerede nedbrydningshastigheder for spaltning af on- og off-target-substrater ved SpCas9 viser, at den 3 bp PAM-distale mismatchning forsinker enzymet 13 gange (fra 1 s-1 til 0,076 s-1). Begge høj-fidelitets Cas9-varianter reducerer dramatisk den observerede nedbrydningshastighed for spaltning af on-target DNA-substrater 21- til 35-foldigt i forhold til SpCas9 (0,028 s-1 for HypaCas9 og 0,047 s-1 for Cas9-HF1 mod 1 s-1 for SpCas9). Desuden reducerer HypaCas9 og Cas9-HF1 yderligere nedbrydningshastighederne for off-target DNA-spaltning 8- til 290-foldigt (hastigheder på henholdsvis 0,0033 s-1 og 0,00016 s-1) i forhold til deres respektive hastigheder med on-target DNA. Disse data viser dramatiske ændringer i de observerede spaltningshastigheder ved de manipulerede varianter med on- og off-target-DNA. Disse målinger alene definerer imidlertid ikke ændringer i specificitet, som er en funktion af den kinetiske opdeling af DNA-spaltning i forhold til dissociation, der omfatter alle trin, der fører op til det første irreversible trin i vejen17 , herunder reversibel DNA-binding, R-loop-dannelse, HNH-domænedokning og DNA-spaltning.

DNA-afvikling er stort set uændret med Cas9-varianterne

Da vores tidligere arbejde identificerede R-loop-dannelse som hastighedsbegrænsende for on-target-spaltning, og andre efterfølgende foreslog, at R-loop-dannelses- og genopviklingshastigheder kan diktere enzymspecificitet for SpCas9 og Cas9-HF116, testede vi, om HypaCas9 ville vise lignende kinetik. For direkte at måle hastighederne for R-loop-dannelse for alle enzymer anvendte vi et stop-flow-assay baseret på måling af fluorescens af tCo ved -16 nt, en fluorescerende tricyklisk cytosinanalog, der slukkes af base stacking i dsDNA, således at åbning af duplexet resulterer i en stor stigning i fluorescensen. Vores kontrolforsøg med både vores tCo- og 2-AP-mærkede baseanalog-substrater ved henholdsvis positionerne -16, -9 og -1 nt (Supplerende fig. 3) viser, at ingen af analogerne påvirker den observerede henfaldshastighed for DNA-spaltning. De kemiske strukturer af tCo og 2AP er langt mindre voluminøse end større Cy3- og Cy5-mærkninger og mindre tilbøjelige til at forstyrre enzymkinetikken (Supplerende fig. 4). I tilstedeværelse af Mg2+ afvikler SpCas9, HypaCas9 og Cas9-HF1 DNA-substratet på målet med næsten identiske nedbrydningshastigheder (~2 s-1) (fig. 2) (fig. 2). Overraskende nok var henfaldshastigheden for R-loop-dannelse for off-target DNA-substrater for alle Cas9-varianter også stort set uændret (mellem 0,85 s-1 og 2,59 s-1). Derfor er DNA-afviklingen ikke hastighedsbegrænsende og er ikke korreleret med de observerede spaltningshastigheder for varianterne med høj fidelitet i modsætning til SpCas9.

Fig. 2: DNA-afviklingshastighederne er næsten identiske for on-targets og off-targets.

R-loop-dannelsens henfaldsrater blev målt ved at overvåge fluorescensforøgelsen fra tCo (position -16 i ikke-målstrengen) som en funktion af tiden efter blanding af enzym (28 nM) med DNA (10 nM) i nærvær af 10 mM Mg2+. Dataene blev tilpasset til en dobbelt eksponentiel funktion for at få de viste henfaldshastigheder. a, b SpCas9 (28 nm) med on-target (a) og off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 med on-target (c) og off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 med on-target (e) og off-target (f) DNA.

Givet placeringen af tCo ved -16 nt er det sandsynligt, at vores målinger afspejlede et trin sent i afviklingsprocessen. Til sammenligning målte vi henfaldshastigheden for R-loop-dannelse ved hjælp af tCo mærket på en position umiddelbart proximalt for PAM’en (position -1 nt). Efter hurtig blanding af Cas9-RNA med on-target DNA-substratet observerede vi en markant stigning i fluorescens, efterhånden som DNA’et afvikler tCo-baseanalogen. Vi tilpassede dataene til en dobbelt eksponentiel for at bestemme den største henfaldshastighed på 10 s-1 (Fig. 3a-f). Disse resultater tyder på, at når først et PAM-sted er engageret med enzymet, er den indledende afvikling af DNA’et hurtigere end observeret ved -16 nt. Disse data tyder på, at den observerede nettoafviklingshastighed for afvikling, der er observeret ved -16 nt, kan være en funktion af flere hurtige afviklingstrin, der fører til fuldstændig afvikling. Da der imidlertid ikke blev observeret nogen forsinkelse i kinetikken, ser det ud til, at de hurtigere, tidligere delvise afviklingstrin fører til et sidste hastighedsbegrænsende trin med fuld afvikling, målt ved -16 nt-positionen. Selv om der er behov for yderligere undersøgelser for at undersøge virkningerne af mismatches på tidligere stadier af afviklingen, giver vores nuværende måling det bedste skøn over nettohastigheden af R-loop-dannelsen. Nedbrydningshastigheden målt for R-loop-dannelse ved hjælp af denne mærkning er ikke til at skelne for både SpCas9 og high-fidelity-varianterne på alle testede substrater, så hastigheden for DNA-afvikling synes at være uændret af de manipulerede Cas9-enzymer.

Figur 3: DNA-afvikling sker hurtigere nær PAM’en.

R-loop-dannelsens henfaldsrater blev målt ved at overvåge fluorescensforøgelsen fra tCo (position -1 i ikke-målstrengen) som en funktion af tiden efter blanding af enzym (28 nM) med DNA (10 nM) i tilstedeværelse af 10 mM Mg2+. Dataene blev tilpasset til en dobbelt eksponentiel funktion for at få de viste aftagende hastigheder. a, b SpCas9 (28 nm) med on-target (a) og off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 med on-target (c) og off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 med on-target (e) og off-target (f) DNA. g Tegning af HNH-domæneomlægningen. h FRETSpCas9-mærket med Cy3- og Cy5-parret ved henholdsvis C867 og C355 blev brugt til at måle HNH-domænets bevægelse under spaltning af on-target-substrater.

For at korrelere hastighederne for R-loop-dannelse med de trin, der er involveret i HNH-domænets docking på målstrengen, målte vi enzymets konformationsændring ved hjælp af stop-flow-analyse på et Cas9, der var mærket med Cy3 og Cy5 som tidligere beskrevet18. Kort fortalt blev en Cysteine-light-version af Cas9 mærket med Cy3 ved aminosyre 355 og Cy5 ved aminosyre 867. FRET-effektiviteten øges, når HNH-domænet omarrangeres til den katalytisk aktive tilstand (fig. 3g). Efter hurtig blanding af det FRET-par-mærkede Cas9 med et perfekt matchet on-target-DNA observerede vi en stigning i FRET-effektiviteten, hvilket indikerer, at HNH-domænet omarrangerede sig til en katalytisk aktiv tilstand. Vi målte afviklingshastigheden for HNH-dokning til at være ~2,5 s-1 (Fig. 3h), hvilket svarer til enkeltmolekyl FRET-målinger. Overraskende nok er de observerede hastigheder for R-loop-dannelse (1.5 s-1) og HNH-domænets docking meget ens, hvilket indikerer, at disse trin kan være kinetisk forbundet. Den lidt hurtigere observerede henfaldshastighed for HNH-domænebevægelse kan skyldes den omvendte reaktion, da domænebevægelsen kommer i ligevægt efter eller sammenfaldende med R-loop-dannelsen.

Faldhastigheden for DNA-afvikling er også blevet målt ved hjælp af enkeltmolekylmetoder ved hjælp af et FRET-par-mærket DNA, Cy3 og Cy5 blev mærket på henholdsvis position -6 nt på målstrengen og -16 nt på ikke-målstrengen16. Derfor testede vi også de FRET-parrede DNA-substrater i et forsøg på at korrelere FRET-signalet med de observerede hastigheder for DNA-spaltning. Først testede vi det substrat, der tidligere er anvendt i enkeltmolekyleundersøgelser uden Cy3/Cy5-mærkater16 , som har en forskel på to nukleotider i forhold til vores substrat, nærmere bestemt en T-substitution ved positionerne -16 og -18. Nedbrydningshastigheden for målstrengen (HNH) spaltning svarer til den for vores substrat (0,7 s-1 vs. 1 s-1, Supplerende fig. 5a), så sekvenskonteksten på denne position har ikke en væsentlig indflydelse. Vi testede også spaltning med Cy3/Cy5-mærket DNA med denne anden sekvens, og den viste en lignende henfaldshastighed som vores sekvens (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, Supplerende figurer 5b og 6a). Senere undersøgte vi tidsforløbet for målstrengen (HNH) spaltning af Cy3/Cy5-mærket DNA med vores sekvens for hvert enzym (Supplerende fig. 6). Med SpCas9 følger reaktionen af det Cy3/Cy5-mærkede DNA en enkelt eksponentiel med en markant reduceret henfaldshastighed (0,06 s-1 vs. 1 s-1), hvilket viser et ~17-dobbelt fald i den observerede henfaldshastighed for DNA-spaltning sammenlignet med umarkeret substrat. De manipulerede HypaCas9 og Cas9-HF1 udviste også nedsatte DNA-spaltningshastigheder på henholdsvis 0,0046 s-1 og 0,0016 s-1, hvilket er 5,9 gange og 28,75 gange langsommere end umærkede substrater, målt under identiske betingelser. Det er klart, at interferens fra Cy3/Cy5-mærkningerne ændrer virkningen af varianterne med høj fidelitet på DNA-spaltningshastigheden. Samlet set havde mærkning af DNA’et med voluminøse Cy3- og Cy5-mærkninger en dramatisk indvirkning på enzymet. Af disse grunde blev der ikke udført yderligere undersøgelser med FRET-par-mærket DNA.

Cas9-specificitet er styret af kinetisk partitionering

Da enzymspecificitet er en funktion af alle trin, der fører op til det første stort set irreversible trin, skal alle begivenheder forud for DNA-spaltning tages i betragtning17. For at måle den intrinsiske spaltningshastighed omgik vi det normalt hastighedsbegrænsende R-loop-dannelsestrin ved at præinkubere SpCas9 med off-target-DNA i fravær af Mg2+ for at tillade binding og konformationsændringer at komme i ligevægt for at danne et SpCas9.DNA-kompleks. Vi igangsatte derefter den kemiske reaktion ved at tilsætte 10 mM Mg2+. I vores tidligere undersøgelser var R-loop-dannelsen hastighedsbegrænsende med SpCas9, der reagerede med on-target-DNA, og den intrinsiske spaltningsnedbrydningshastighed var hurtigere, når den blev målt ved hjælp af præinkubationsprotokollen. Her, med off-target DNA, blev hastighederne for HNH- og RuvC-spaltning målt til henholdsvis 0,12 s-1 og 0,14 s-1 (Supplerende fig. 7c, d og Supplerende fig. 8), hvilket er meget langsommere end hastighederne for R-loop-dannelse. Disse resultater viser på forunderlig vis, at det hastighedsbegrænsende trin i enzymvejen for SpCas9 med et off-target er DNA-spaltning, da den nedbrydningshastighed for R-loop-dannelse, vi målte, var 0,85 s-1 (fig. 2b). Disse data indikerer, at diskrimination i det mindste delvist er baseret på en ændring i identiteten af det hastighedsbegrænsende trin ved sammenligning af on- og off-target DNA.

Vi gentog disse eksperimenter med HypaCas9 og Cas9-HF1 med on- eller off-target DNA. Disse resultater definerer observerede hastigheder for HNH-spaltning på henholdsvis 0,035 s-1 og 0,0023 s-1 for HypaCas9 med on- og off-target-substrater (Supplerende fig. 7g, k). De observerede spaltningshastigheder for Cas9-HF1 for on- og off-target-substrater blev målt til henholdsvis 0,038 s-1 og 0,00014 s-1 (Supplerende fig. 7o, q). Disse observerede spaltningshastigheder er noget hurtigere end dem, der er målt ved samtidig tilsætning af DNA og Mg2+, hvilket indikerer, at et andet trin end R-loop-dannelse, men forud for DNA-spaltning, kan sænke den observerede nedbrydningshastighed. Ikke desto mindre viser disse resultater, at de observerede spaltningshastigheder for on-target-DNA er reduceret ~100 gange for både HypaCas9 og Cas9-HF1 i forhold til SpCas9. For off-target-DNA er de observerede spaltningshastigheder reduceret 50- eller 860-foldigt for henholdsvis HypaCas9 og Cas9-HF1 i forhold til SpCas9.

Diskrimination defineres ikke udelukkende af de relative DNA-spaltningshastigheder. Da R-loop-dannelsen er hurtig, er diskriminationen snarere en funktion af den kinetiske fordeling mellem hastighederne for DNA-frigivelse og DNA-spaltning17,26,27. For at kvantificere den kinetiske fordeling inkuberede vi enzym og mærket DNA i fravær af Mg2+, som gør det muligt for R-loop-dannelsen at komme i ligevægt, men forhindrer katalysen15. Vi tilføjede derefter Mg2+ for at starte reaktionen i nærvær af et stort overskud af identisk, umærket on-target-DNA, der skal fungere som fælde. Sammenligning mellem parallelle eksperimenter udført i tilstedeværelse og fravær af DNA-fælden giver et estimat for den fraktionelle kinetiske fordeling for dissociation versus spaltning af bundet DNA (Fig. 4a). Når SpCas9 først var bundet til on-target-DNA, blev det hurtigt spaltet, og DNA-fælden havde kun ringe effekt (Fig. 4b). I modsætning hertil dissocierede 33 % af off-target-DNA’et sig fra enzymet, mens ~67 % af DNA’et var forpligtet til spaltning (Fig. 4c og Supplerende Fig. 9a). Disse resultater viser, at SpCas9 diskriminerer mod det PAM-distale mismatchede DNA ved at nedsætte spaltningshastigheden, hvilket øger den fraktion af DNA, der frigives snarere end spaltes. Effekten er dog lille, så dissocieringshastigheden synes at være langsommere end spaltningen.

Figur 4: Engineered Cas9s forbedrer specificiteten gennem en nedsat DNA-spaltningshastighed.

a Skematisk fremstilling af DNA-fældeforsøg. b, c SpCas9-spaltning af on-target (fra Gong et al.15) (b) eller off-target (c) DNA. d, e HypaCas9-spaltning af on-target (d) eller off-target (e) DNA. f, g Cas9-HF1-spaltning af on-target (f) eller off-target (g) DNA. Enzym (28 nM) og mærket DNA (10 nM) blev inkuberet i fravær af Mg2+, og reaktionen blev indledt ved at tilsætte Mg2+ i tilstedeværelse eller fravær af et overskud af umarkeret DNA-fælde. A- og A◦ repræsenterer amplituden med (fyldte cirkler) og uden fælde (åbne cirkler), henholdsvis. Procentdelen angiver den brøkdel af præ-bundet DNA, der er forpligtet til at gå fremad til spaltning i forhold til reaktionen i fravær af fælde.

Næst undersøgte vi den kinetiske fordeling for HypaCas9 og Cas9-HF1 bundet til on-target DNA (Fig. 4d, f, Supplerende Fig. 9b, d). Vores resultater med HypaCas9 og Cas9-HF1 viser, at henholdsvis ~75 % og ~92 % af on-target-DNA’et blev kløvet i nærvær af fælden. Procentdelen spaltede er mindre end for wild-type SpCas9, fordi den observerede intrinsiske spaltningsnedbrydningshastighed for on-target DNA af HypaCas9 (0,035 s-1) og Cas9-HF1 (0,038 s-1) var 100 gange langsommere end med SpCas9 (4,3 s-1). Denne langsommere spaltningshastighed giver tid til, at en lille fraktion (8 til 25 %) af on-target-DNA’et kan dissocieres, før det spaltes.

Kinetisk partitionering til fordel for dissociation blev forstærket, når HypaCas9 og Cas9-HF1 reagerer med off-target-DNA, fordi spaltningshastighederne blev yderligere reduceret til henholdsvis 0,0023 s-1 og 0,00014 s-1 (Fig. 4e, g, Supplerende fig. 9c, e). Disse hastigheder er henholdsvis 50- til 860-foldig langsommere sammenlignet med SpCas9 på et off-target-substrat. Følgelig var kun ~24 % og ~10 % af det bundne off-target-DNA forpligtet til at gå fremad med henblik på spaltning af henholdsvis HypaCas9 og Cas9-HF1 i tilstedeværelse af fælde-DNA. Samlet set viser disse resultater, at de manipulerede high-fidelity-varianter opnåede forbedret specificitet mod det PAM-distale mismatchede DNA gennem en markant nedsat spaltningshastighed, hvilket ændrer den kinetiske fordeling til fordel for frigivelse snarere end spaltning af det bundne substrat for både on- og off-target DNA, men effekten er større for off-target DNA. Beregning af de tilsyneladende dissocieringshastighedskonstanter ved hjælp af Eq. (3) viser, at varianterne med høj fidelitet ikke øger den tilsyneladende hastighed for DNA-frigivelse (Supplerende tabel 1).

$$${{\mathrm{Kleavage}}}\,{\mathrm{probability}}} = \frac{{{k_{chem}}}{{k_{off}} + k_{chem}}}}$$$
(3)

Snarere tilskrives den øgede diskrimination udelukkende fald i den tilsyneladende hastighedskonstant for spaltning.

I vores hidtidige beskrivelser af Cas9-enzymernes kinetik er de observerede henfaldsrater for reaktioner blevet estimeret på grundlag af tilpasning af data til eksponentielle funktioner, som giver egenværdier, der normalt er komplekse funktioner af flere hastighedskonstanter17. For fuldt ud at forstå kinetikken og mekanismen blev alle eksperimenterne for hvert enzym og DNA-substrat tilpasset globalt baseret på numerisk integration af hastighedsligningerne ved hjælp af en enkelt forenet model (Fig. 5 og Supplerende figurer 10-14). Global datatilpasning viser, at vores minimale model (Fig. 5f, indsat) tager højde for vores data, og at hver af hastighedskonstanterne er veldefineret baseret på tillidskonturanalyse, der tester det omfang, i hvilket hver parameter er begrænset af dataene (Fig. 6)17,28. Bemærk især, at vores model tager højde for de bifasiske spor, der ses i nogle eksperimenter, uden at det er nødvendigt at påberåbe sig heterogenitet, og den giver iboende hastighedskonstanter for hvert trin i vejen, herunder R-loop-dannelse og HNH- og RuvC-spaltningsbegivenheder. Selv om det er sandsynligt, at yderligere, uopklarede strukturelle omlægninger kan være nødvendige for tilpasning af katalytiske rester til DNA-spaltning, er disse endnu ikke blevet opklaret som kinetisk adskilte hændelser. Den nuværende model repræsenterer en minimal vej, der er nødvendig og tilstrækkelig til at redegøre for alle tilgængelige data, og den kan let udvides, efterhånden som nye oplysninger bliver tilgængelige for at definere yderligere trin i vejen.

Fig. 5: Global tilpasning af eksperimenter udført for at undersøge on-target-aktivitet af SpCas9.

a DNA og Mg2+ initierede spaltning ved HNH-domænet. b DNA og Mg2+ initierede spaltning ved RuvC-domænet. c R-loop-dannelseshastighed. d Mg2+ initierede spaltning ved HNH-domænet. e Mg2+ initierede spaltning ved RuvC-domænet. f Effekt af DNA-fælde på kinetisk opdeling af Cas9-spaltning. Alle kurver blev beregnet på grundlag af den globale tilpasning til dataene i overensstemmelse med den kinetiske model (indsat), med hastighedskonstanter vist i tabel 1. Fejlestimater blev baseret på tillidskonturanalyse som vist i fig. 6. E er Cas9.gRNA, D er mål-DNA, ED er Cas9.gRNA.DNA, EDH er R-loop-dannelse med docking af målstrengen til HNH, EDHR og EDP1R er R-loop-dannelse med docking af ikke-målstrengen til RuvC, EDHP2 er RuvC-spaltning af ikke-målstrengen, EDP1 er HNH-spaltning af målstrengen, EDP1P2 er spaltning af begge strenge, Dtrap er overskydende umarkeret, perfekt matchet DNA. EDtrap er Cas9.gRNA.DNAtrap.

Fig. 6: Tillidskonturanalyse for global datatilpasning.

Videnskabskonturer er vist for tilpasningsdata i fig. 5. Nummererede hastighedskonstanter er defineret i vores kinetiske model (Fig. 5f, indsat). χ2-tærsklen (stiplet linje) blev sat til 0,99 for at definere øvre og nedre grænser for hver hastighedskonstant som beskrevet17,32. Da konturerne var symmetriske med parametre, der var godt begrænsede, rapporterer vi ± fejlgrænser i tabel 1. Til denne analyse blev en χ2-tærskel beregnet ved hjælp af en F-fordeling og blev anvendt til at definere de nedre og øvre grænser for hver parameter.

For at forstå enzymspecificitet skal hastighedskonstanterne fortolkes i sammenhæng med alle kinetisk relevante trin som illustreret i den frie energiprofil (beregnet ved hjælp af Eq. (4) ud fra hastighedskonstanterne i tabel 1).

Transmissionskoefficienten A = 0,001

Tabel 1 Kinetiske parametre for Cas9-enzymer.

Da global datatilpasning giver hastighedskonstanterne for hvert relevant trin (fig. 5 og 6), kan vi konstruere en bona fide frienergiprofil (fig. 7b og supplerende fig. 10-14). De frie energiprofiler, der sammenligner SpCas9, HypaCas9 og Cas9-HF1, viser en ændring i de hastighedsbegrænsende og specificitetsbestemmende trin. Enzymspecificitet er defineret ved kcat/Km og er givet ved den højeste samlede barriere i forhold til starttilstanden, mens den maksimale hastighed, kcat, er defineret ved den højeste lokale barriere i forhold til den forudgående tilstand, dæmpet af eventuelle forudgående hurtige ligevægtstrin. Da hastighedskonstanterne for R-loop-dannelse ikke ændrer sig væsentligt med forskellige substrater og enzymvarianter, styres specificiteten i vid udstrækning af den kinetiske opdeling af Cas9 R-loop’en, EDH-tilstanden i vores kinetiske model (Fig. 5f, indsat), til enten at gå fremad, hvilket resulterer i irreversibel spaltning, versus frigivelse via genannealing af DNA’et og udstødning fra enzymet. De højere samlede barrierer for spaltning, der ses med varianterne med høj fidelitet, øger den kinetiske fordelingssandsynlighed til fordel for dissociation af DNA’et (fig. 6c).

Fig. 7: Specificitet er styret af Cas9’s kinetiske partitionering.

a Tegneserieformet repræsentation af Cas9-enzymernes reaktionsvej. b Frie energiprofiler for SpCas9-spaltning af en on-target (grå linje) fra Gong et al.15 og off-target (rød linje), henholdsvis; HypaCas9-spaltning af et off-target (blå linje); og Cas9-HF1-spaltning af et off-target (sort linje). Hver profil blev beregnet ved hjælp af overgangstilstandsteori ved hjælp af hastigheds- og ligevægtskonstanter, der blev afledt af global tilpasning af hvert sæt af eksperimenter (tabel 1). Bemærk, at de højere barrierer for DNA-spaltning i forhold til den lavere barriere for den forudgående omvendte reaktion øger sandsynligheden for DNA-frigivelse. c Sammenfattende søjlediagram for k2, k3 og kinetisk partitionering (P).