Af Elizabeth Burke

Tirsdag den 9. august 2016

Videnskabsfolk bruger en række forskellige laboratorieteknikker til at undersøge den genetiske årsag til menneskelige sygdomme. Forskningen anvender ofte patienters celler eller vævsprøver, men for at fastslå, om en mutation i et bestemt gen kan forårsage en patients symptomer, har vi ofte brug for eksperimentelle dyremodeller.

Mens mus og rotter tidligere har været almindelige valg til modellering af menneskelige sygdomme, er brugen af zebrafisk hurtigt ved at blive mere populær. Overrasker det dig? Lad mig forklare.

Hvad er zebrafisk?

Zebrafisk er en tropisk ferskvandsfisk i familien af elritter. I naturen findes de i floder og damme i Indien, men de er nu ofte tilgængelige i dyrehandlere. Navnet “zebrafisk” kommer fra de vandrette blå striber på hver side af deres krop.

Zebrafisk, der har fået dette navn på grund af deres striber, foretrækker at leve i store grupper, der kaldes stimer.

Hvordan kan man modellere en menneskelig sygdom i fisk?

Og selv om mennesker kan synes at være meget forskellige fra zebrafisk, ligner vi dem faktisk meget mere, end man skulle tro. Faktisk findes 70 % af de menneskelige gener i zebrafisk.

Dertil kommer, at zebrafisk har to øjne, en mund, hjerne, rygmarv, tarm, bugspytkirtel, lever, galdeveje, nyre, spiserør, hjerte, øre, næse, muskler, blod, knogler, brusk og tænder. Mange af de gener og kritiske veje, der er nødvendige for at udvikle disse egenskaber, er i høj grad bevaret mellem mennesker og zebrafisk. Derfor kan enhver type sygdom, der forårsager ændringer i disse kropsdele hos mennesker, teoretisk set modelleres i zebrafisk.

Hvorfor bruge zebrafisk, når man kan bruge mus?

Selv om mus evolutionært set minder mere om mennesker, fordi de er pattedyr, har zebrafisk flere fordele i forhold til deres pelsede konkurrenter.

En vigtig fordel ved zebrafisk er, at de voksne fisk er små og foretrækker at blive opstaldet i store grupper, eller “stimer”. Derfor kræver de meget mindre plads og er billigere at vedligeholde end mus.

The NIH Zebrafish Core huser hundredtusindvis af zebrafisk i et topmoderne anlæg.

En anden fordel er, at voksne zebrafisk yngler let (ca. hver 10. dag) og kan producere op til 50 til 300 æg ad gangen. Dette er helt anderledes end mus, da de generelt producerer kuld på et til 10 unger og kun kan føde ca. tre kuld i løbet af deres liv. Videnskabelige eksperimenter gentages generelt flere gange for at bevise, at resultaterne er korrekte, så det er nyttigt at have et dyr, der kan producere et stort antal afkom igen og igen.

Zebrafiskeembryoner lægges og befrugtes også eksternt, hvilket gør det muligt at manipulere dem let på en række forskellige måder. Der kan om nødvendigt foretages in vitro-befrugtning. De befrugtede æg i et cellestadium kan let injiceres med DNA eller RNA for at ændre deres genetiske sammensætning permanent med henblik på at generere transgene eller knock-out zebrafisklinjer. Det er meget mere kompliceret at arbejde med mus på denne måde. Museembryoner udvikles inde i moderen, og for at få adgang til dem og manipulere dem skal moderen ofres. For at holde embryonerne i live, efter at de er blevet befrugtet eller injiceret, skal de også transplanteres i en anden hunmus.

Zebrafiskens larve, udviklingsstadiet fra tre til tredive dage efter befrugtning, vokser i længde fra ca. 3,5 til 8 millimeter.

Dertil kommer, at zebrafiskens embryoner er klare, hvilket gør det muligt for forskerne at se de befrugtede æg vokse til fuldt dannede fiskeunger under et mikroskop. Deres gennemsigtighed gør det også muligt at visualisere fluorescerende mærkede væv i transgene zebrafiskembryoner. Museembryoner er ikke gennemsigtige og udvikler sig inde i moderen, så det er ikke muligt at observere levende embryonudvikling som i zebrafisk.

Der er dog en grænse for, hvilke typer sygdomme der kan undersøges i zebrafisk. Menneskelige sygdomme forårsaget af gener, der ikke findes i zebrafisk, kræver en anden dyremodel. Desuden er zebrafisk ikke brugbare modeller for menneskelige sygdomme, der hovedsageligt finder sted i en vævstype eller kropsdel, som zebrafisk ikke har (f.eks. prostata, mælkekirtler, lunger).

Hvordan bruger man helt præcist zebrafisk til at undersøge sygdomme hos mennesker?

Ofte sekventeres en patients DNA for at finde en mutation i et gen, der potentielt kan forårsage hans eller hendes sygdomssymptomer. For at afgøre, om tab af funktion i det pågældende gen kan forårsage de symptomer, der ses hos patienten, muteres eller “slås ud” det samme gen i zebrafisk, og derefter undersøges fiskene for lignende symptomer. Selv om det er meget vanskeligere at gøre, kan den nøjagtige mutation, som patienten har, også indføres i zebrafisk – dette kaldes en “knock-in”.

Hvis et eller flere af patientens symptomer observeres i zebrafiskens knock-out- eller knock-in-model, kan zebrafisken bruges til yderligere undersøgelser for at hjælpe med at fastslå, hvorfor mutationen i det pågældende gen forårsager sygdommen. F.eks. kan strukturen af muskelfibrene undersøges for abnormiteter i mikroskopet, hvis patienten har en muskelsygdom. Eller hvis patientens sygdomssymptomer begyndte under udviklingen i livmoderen, kan man undersøge knock-out- eller knock-in-zebrafiskembryoner for ændringer i genekspressionen (sammenlignet med embryoner uden mutationen), som kan føre til unormal udvikling. For en patient med en neurologisk sygdom kan neuroner i knock-out embryoner mærkes med fluorescens for at se, om de dannes forkert.

Ud over at anvende zebrafisk-sygdomsmodeller til at karakterisere sygdomme hos mennesker kan forskerne også identificere og afprøve nye lægemidler til behandling af de sygdomme, der er modelleret. Zebrafiskens evne til at generere mange embryoner, hver gang de yngler, gør dem særligt nyttige til high throughput drug screening.

Hvad er nogle eksempler på menneskelige sygdomme, der med succes er blevet modelleret i zebrafisk?

Generering af et knock-out af dystrofin-genet i zebrafisk har vist sig at ligne sværhedsgraden og forløbet af den menneskelige sygdom Duchennes muskeldystrofi meget tæt på. Patienter med Duchennes muskeldystrofi har vist sig at være bærere af mutationer i dystrofin og udviser muskelsvaghed i barndommen, som bliver gradvist værre. Både hos mennesker og i zebrafiskmodellen fører tabet af dystrofin gradvist til nekrotiske muskelfibre, der erstattes af inflammatoriske celler, fibrose og unormalt store muskelfibre.

Denne figur viser visuelle forskelle i musklerne mellem zebrafisklarver af vildtype (A, B, C) og distrofiske larver (A’, B’, C’). Kilde: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

Menneskeligt melanom er også blevet modelleret med succes i zebrafisk. Den mest almindeligt identificerede mutation i menneskelige melanomer – en enkelt aminosyreændring i genet BRAF – blev skabt i zebrafisk for at lave en knock-in-model. Da kræft skyldes en kombination af flere genetiske ændringer, blev denne knock-in zebrafisklinje brugt til at screene andre potentielle kræftfremkaldende mutationer. Da en anden almindeligt observeret melanom-mutation i genet SETDB1 blev tilføjet til BRAF knock-in zebrafisken, udviklede der sig hurtigt et melanom. Disse resultater bidrog til at fastslå, at SETDB1 er et vigtigt gen i melanomvækst.

Disse eksempler på, hvordan mennesker og zebrafisk kan manifestere den samme sygdom på trods af, hvor forskellige vi synes at være, gør det let at forstå, hvorfor zebrafisk er ved at blive en velaccepteret dyremodel. Her i NIH’s program for udiagnosticerede sygdomme udfører vi undersøgelser ved hjælp af zebrafisk som en af flere metoder til at undersøge den potentielle involvering af ændrede gener i vores patienters ekstremt sjældne sygdomme. Mens mus tidligere har været den fremherskende dyrebro mellem laboratoriet og sengekanten, har nyere undersøgelser vist, at zebrafisk har potentiale til at fungere som et lettilgængeligt alternativ til mus. Timingen for indførelsen af zebrafisk som en ny modelorganisme kunne ikke være bedre, da musestudier ofte ikke kan overføres til mennesker. Selv om intet dyr kan modellere en menneskelig sygdom perfekt, mener jeg, at disse små stribede svømmere har et stort potentiale til at fremme den medicinske forskning i fremtiden.

For at få mere at vide om, hvordan zebrafisk bidrager til biomedicinsk videnskab og menneskers sundhed, kan du besøge hjemmesiderne for Trans-NIH Zebrafish Initiative website og NICHD Zebrafish Core.