Introduktion

Numre fremskridt inden for forskellige forskningsområder, herunder udviklingsbiologi, stamcellebiologi og vævsteknologi, har gjort det lettere for regenerativ medicin. Den første generation af regenerativ medicin er stamcelletransplantationsterapi ved hjælp af vævsafledte stamceller, embryonale stamceller (ES-celler) eller inducerede pluripotente stamceller (iPS-celler) . Knoglemarvstransplantation er f.eks. allerede blevet en almindelig behandling af leukæmi og hypoplastisk anæmi. Desuden er både ES-celler og iPS-celler på vej ind i kliniske forsøg i forbindelse med mange sygdomme og skader, herunder leukæmi, Parkinsons sygdom og Alzheimers sygdom, hjerteinfarkt, diabetes, leversygdomme og forskellige andre sygdomme . Vævsregeneration er positioneret som anden generation af regenerativ medicin, og flere produkter, herunder hud og brusk, er allerede på markedet. Desuden undersøges verdens første vævsregenerationsterapi med iPS-celler fra enten patienten eller en anonym donor i et klinisk forsøg med henblik på at helbrede aldersrelateret makuladegeneration.

Næste generation af regenerativ terapi er rettet mod hele organer, der består af flere celletyper med en kompleks tredimensionel struktur . I dette årti har fremskridtene inden for stamcellebiologi og udviklingsbiologi givet nye muligheder for at regenerere funktionelle organer. Under den embryonale udvikling opstår organerne fra de respektive organkim, som fremkaldes af gensidige interaktioner mellem skæbnebestemte epitheliale og mesenkymale stamceller i overensstemmelse med de enkelte organdannende felter (figur 1a) . Funktionel organregenerering blev først opnået i 2007 ved at udvikle en ny cellemanipulationsmetode til at generere en bioteknologisk organspire med organinducerende potentiale epitheliale og mesenkymale stamceller isoleret fra en embryonalt organspire (figur 1b) . Denne banebrydende undersøgelse og efterfølgende undersøgelser rapporterede om fuldt funktionel regenerering af flere typer ektodermiske organer, hvilket gav bevis for begrebet funktionel organregeneration .

Det næste paradigmeskift kom i 2008 med opdagelsen af organoider, som blev genereret ved at inducere et organdannende felt i et celleaggregat, der stammer fra pluripotente stamceller, såsom ES-celler og iPS-celler, samt vævsstamceller (figur 1c) . Der kan genereres stort set alle typer organoider, herunder organoider fra centralnervesystemet (dvs. hjernebarken, hypofysen, hypofysen, optikum og det indre øre) . Selv om fremkomsten af organoider er et teknologisk gennembrud, der nu er et vigtigt redskab i mange grundlæggende biologiske og kliniske anvendelser, kan organoider stadig kun delvist gengive de oprindelige organers struktur og funktion. Derfor kan størstedelen af de enkelte organoider, der hidtil er fremstillet, erstatte begrænsede og/eller delvise funktioner af et komplet organ, og de betragtes derfor i øjeblikket som mini-organer. For nylig blev der med succes udviklet spytkirtelorganoider, som viser fuldt funktionel organregeneration ved ortotopisk transplantation . Da principperne for ektodermisk organudvikling ligner principperne for andre organer, er det vigtigt at få en dybere forståelse af ektodermisk organregeneration for at opnå en fuldstændig funktionel regeneration af andre organer (figur 1a). Desuden viste regenerering af et integumentært organsystem (IOS) ved hjælp af en in vivo-organoidmetode klart muligheden for organsystemregenerering .

I denne gennemgang beskriver vi de seneste fremskridt inden for organregenerering ved hjælp af forskellige stamcellepopulationer og strategier baseret på udviklingsbiologi og stamcellebiologi og diskuterer de fremtidige retninger for organerstatningsterapi som den næste generation af regenerativ medicin for organer.

Udvikling af en tredimensionel cellemanipulationsmetode, organkimemetoden, ved hjælp af embryonale celler

Forskere har i flere årtier forsøgt at regenerere organer ved at kombinere funktionelle celler, stilladsmaterialer og fysiologisk aktive stoffer ved hjælp af vævsteknologiske teknikker . Selv om disse tidligere undersøgelser har ydet visse bidrag til organregenerering, er der betydelige betænkeligheder ved resultaterne af disse undersøgelser, f.eks. den lave effektivitet af organinduktion og den ukontrollable retning og størrelse af det regenererede organ. Med fremskridt inden for stamcelle- og udviklingsbiologi har reproduktionen af organogenese i fosterstadiet gjort fremskridt i de seneste 30 år. Udviklingsprocessen for organregeneration starter med induktion af organkimen ved epithelial-mesenkymale interaktioner i det organfelt, der dannes efter etableringen af kropsplanen i den tidlige udvikling. Der er i årenes løb blevet udviklet teknikker til cellemanipulation med henblik på at regenerere organkimser, men der er ikke opnået fuldstændig reproduktion af udviklingen og regenerering af funktionelle organer .

Vi har udviklet en bioteknisk metode, benævnt organkimsmetoden, til at genskabe induktionen af organkimser gennem epithel- og mesenkymale interaktioner i tidlige udviklingsstadier . Vi kompartmenterede epithel- og mesenkymceller isoleret fra musens embryo ved en høj celletæthed i en type I kollagen gel for at opnå en præcis replikation af de processer, der finder sted under organogenese . Ved hjælp af denne nye metode har vi observeret den funktionelle regenerering af flere typer ektodermiske organer, såsom tænder, hårfollikler og sekretoriske kirtler .

Fuldt funktionelle bioteknologiske tænder

3.1. Tandudvikling

I tandkimudviklingen fortykkes tandlaminaen i begyndelsen (lamina-stadiet) (figur 2a). Tandspiren udvikler sig og interagerer med det orale slimhindeepithel og mesenchym. Derefter induceres epithelial fortykkelse på tandens fremtidige placering og efterfølgende epithelial knopning (knopstadiet) til det underliggende neuralkam-afledte mesenchym af epithelialsignaler på embryonale dage (ED) 11-13 hos mus. Ved ED 13-15 fungerer emaljeknuden som et signalcenter, der er ansvarlig for dannelsen og vedligeholdelsen af tandpapillen. De primære emaljeknopper dannes ved tandknoppen og fremkommer under overgangen fra knoppestadiet til kasketstadiet. Ved ED 17-19 differentierer de epitheliale og mesenkymale celler i tandkimen sig terminalt . Mesenchymet differentierer også til tandpulp og parodontalt væv, som bliver til cementum, parodontalt ligament og alveolarknogle. Tandrodsdannelsen påbegyndes efter dannelsen af tandkronen, og de modne tænder bryder ud i mundhulen.

3.2. Fuldt funktionel tandregeneration

Tandtab som følge af caries, parodontose eller traumer forårsager grundlæggende problemer med korrekt oral funktion og er forbundet med orale og generelle sundhedsproblemer . Konventionelle tandbehandlinger, der har til formål at genoprette okklusale funktioner efter tandtab, er baseret på udskiftning af tænder med kunstige materialer, såsom faste eller aftagelige proteser og broarbejde. Selv om disse kunstige behandlinger anvendes i vid udstrækning til behandling af tandlidelser, er det nødvendigt at genoprette en okklusion, fordi tænderne koordineres med den okklusale kraft og den ortodontiske kraft fra de omkringliggende muskler, og integriteten af det stomatognatiske system bevares ved at etablere det okklusale system under kæbevæksten i den postnatale periode . De seneste fremskridt inden for vævsregenerering har gjort det muligt for forskere at forbedre de biologiske tænders funktioner ved at lette den underliggende tandudvikling gennem knogleomdannelse og fremme evnen til at opfatte skadelige stimuli .

Som vist i vores tidligere undersøgelse udvikler en bioteknisk tandkim sig til den korrekte tandstruktur og bryder med succes ud i mundhulen efter transplantation i området for den tabte tand (figur 2b) . I tilfælde af en transplanteret bioteknologisk udviklet moden tandenhed, der omfatter en moden tand, kan parodontalligament og alveolær knogle indtransplanteres i området med tandtab gennem knogleintegration i modtageren (figur 2c) . Den bioteknologiske tand opretholder interaktioner med det parodontale ligament og den alveolære knogle, der stammer fra den bioteknologiske tandenhed, gennem en vellykket knogleintegration. Hårdheden af emaljen og dentinen i de bioteknologiske tandkomponenter lå inden for normalområdet, da de blev analyseret ved hjælp af Knoop-hårdhedstesten . Som en fremtidig retning anses det for at være vigtigt at kontrollere tandformen. Tænder skabes ved at lede mesenchymet i overensstemmelse med kropsplanen under udviklingsprocessen. Med hensyn til den morfologiske kontrol af tænderne kontrolleres tandbredden af arealet af kontakter mellem epithel- og mesenkymcellelagene, og antallet af tandhuler kontrolleres af ekspressionen af Shh i det indre emaljeepitel . Denne bioteknologiske tandteknologi bidrager til realiseringen af regenerativ terapi til erstatning af hele tænder som en næste generations terapi.

Fuldt funktionel bioteknologisk fremstillet hårfollikel

4.1. Udvikling af hårfollikel

Mus har fire forskellige typer hår på ryggen, der er klassificeret som vagt-, pille-, auchene- og zigzaghår. Hårfollikeludviklingen i musens ryghud begynder med skæbnebestemmelse af mesenkymale celler ved ca. ED 10,5, hvilket resulterer i dannelsen af et dermal kondensat. Gensidige interaktioner mellem det dermale kondensat og den overliggende epidermis fører til induktion af hårplacode (figur 3a). Når hårplakoden er etableret, sker hårfollikeludviklingen i tre bølger, begyndende med udviklingen af vagthåret ved ED 14,5, efterfulgt af pølse- og auchenehår ved ED 17 og zigzaghår ved fødslen . Den nederste ende af hårnåleepitelet, som vikler sig om en kondenseret dermal celle, danner kimen til hårmatrixen. Den kondenserede dermalcelle danner en dermal papil, der betragtes som en niche for hårfollikelmesenkymale stamceller og inducerer differentieringen af hårmatrixen og danner hårfolliklens indre rodskede og hårskaftet. Udbulingsområdet danner også en niche for epitelstamceller og har samtidig forbindelse med nervefibre og arrector pili-musklen (figur 3a) .

4.2. Fuldt funktionel regenerering af hårfollikel

Hårorganet har de biologiske funktioner termoregulering, fysisk isolering mod UV-stråling, vandtæthed, taktil fornemmelse, beskyttelse mod skadelige stimuli, camouflage og social kommunikation . Hårtabssygdomme som f.eks. medfødt dysplasi af hårsækkene og androgenetisk alopeci er psykologisk belastende og har negative virkninger på livskvaliteten hos begge køn . De nuværende farmakologiske behandlinger er utilstrækkelige til at opnå en ideel kontrol af hårtab som f.eks. medfødt hårsækdysplasi eller alopecia areata . Efterspørgslen efter udvikling af bioteknologiske teknologier, der muliggør regenerativ behandling af hårtab, er steget.

I hårcyklusen gendannes hårfollikelkim med jævne mellemrum, og epitheliale og mesenkymale stamceller, der er i stand til at regenerere hårfollikler, er til stede, selv hos voksne. Derfor er dette organ det eneste organ, for hvilket rekonstituerende kimceller kan regenereres fra celler, der stammer fra voksne. Der er rapporteret om autolog hårfollikeltransplantation, hvor en enkelt hårfollikel isoleres fra den raske hovedbund og transplanteres til patienter med mandlig alopeci, og de transplanterede hårfollikler bevarer deres egenskaber . Ifølge mange forskere inducerer udskiftning af dermale celler i huden ved hjælp af mesenkymale celler, som indsamles fra voksne hårløg i en hårfollikel, ny dannelse af hårfollikel . Det er imidlertid vanskeligt at regenerere hårfollikler, der fungerer i samarbejde med det omgivende væv. Vores gruppe rekonstituerede en bioteknologisk fremstillet hårfollikelkim, som indeholder mesenkymale stamceller, ved hjælp af pæreafledte epitelceller og dermale papilaceller, der ikke kun er isoleret fra embryoner, men også fra voksne mus (figur 3b) . Efter ortotopisk transplantation udvikler de bioteknologiske hårfollikelkim sig til modne hårfollikler med korrekte strukturer og producerer hår i hele deres liv (figur 3c). De regenererede hårsække knyttede sig desuden effektivt til det omgivende værtsvæv og udviste pilomotoriske reflekser som reaktion på acetylcholinadministration (figur 3d). Denne undersøgelse viste potentialet af vævsstamceller isoleret fra voksne hårfollikler til at udvikle sig til menneskelige hårfollikler inden for regenerativ medicin.

Fuldt funktionelle bioteknologiske sekretoriske kirtler

5.1. Spytkirtel- og tårekirteludvikling

Sekretoriske kirtler, herunder spytkirtler og tårekirtler, er afgørende for beskyttelsen og opretholdelsen af fysiologiske funktioner i mikromiljøet i mund- og øjenfladerne. Sekretoriske kirtler udvikles via gensidige epithel-mesenkymale interaktioner . Spytkirtlerne er inddelt i tre hovedtyper: parotidekirtlen (PG), den submandibulære kirtel (SMG) og den sublinguale kirtel (SLG). SMG udvikles gennem invagination af epithelet i det mesenkymale område på ED 11. Det invaginerede epithelvæv prolifererer og danner en epithelstængel (figur 4a) . En terminal knop danner en forgrenet struktur ved at udvikle en kløft og ved at gentage forlængelses- og forgreningsprocessen fra ED 12,5-14,5 . De terminale knopper differentierer sig til acinærceller og modnes til at syntetisere sekretære proteiner på ED 15 . I modsætning hertil udvikler tårekirtlen sig også gennem invagination af epitelet i en mesenkymal sæk i et temporalt område af øjet på ED 12,5 . De afrundede epitelknopper kondenserer til den øverste konjunktivale fornix, som derefter invaginerer sig i det omgivende mesenchym . Gråkirtelkimmen danner grene via stængelforlængelse og spalteformet morfogenese. Den grundlæggende struktur af lacrimalkirtlen opnås ved ED 19 .

5.2. Spyt- og lakridskirtelregenerering

Den tørre mund og tørre øjne er almindelige symptomer. Spytkirtelsygdomme omfatter spytkirteltumorer, obstruktive lidelser, infektioner og symptomer på systemiske sygdomme som f.eks. Sjögrens syndrom, lymfom og metaboliske sygdomme . Disse sygdomme påvirker også tårekirtlerne, hvilket resulterer i tørre øjne . Dysfunktion og lidelser i forbindelse med disse eksokrine kirtler resulterer i en generel forringelse af livskvaliteten. De nuværende behandlinger for sygdomme, der er kendetegnet ved mund- og øjentørhed, behandler imidlertid kun symptomerne . Disse behandlinger udøver kun midlertidige virkninger og vender ikke den exokrine kirteldysfunktion.

Vores gruppe havde til formål at udvikle bedre behandlinger ved at genskabe en bioteknologisk spytkirtelkim fra epithel- og mesenkymceller, der stammer fra ED 13,5-14,5-musembryonale spytkirtelkim ved hjælp af vores udviklede organkimmetode (figur 4b) . Efter ortotopisk transplantation efter fjernelse af native spytkirtler udviklede den bioteknologiske spytkirtelkim sig til en moden spytkirtel, og der blev dannet en korrekt forbindelse mellem værtens spytkanal og den bioteknologiske spytkanal (figur 4b). Denne procedure førte til udvikling af en forbundet spytkirtelkanal i recipientmusen med acinærvævsstrukturer, der lignede den naturlige spytkirtel (figur 4c). Den bioteknologiske SMG regenererede serøse acinærceller og udviste en naturlig organstruktur. Der blev også konstateret nerveindgang i disse bioteknologiske spytkirtler, og spytsekretion blev induceret i spytkirtlen ved smagsløsning ved hjælp af citronsyre (figur 4d).

Vi rekonstituerede også en bioteknologisk lacrimal kirtelspire fra epithel- og mesenkymale celler, der stammer fra lacrimal kirtelspirer fra ED 16.5-musembryo . Den bioteknologiske kim fra tårekirtlen, som blev genereret ved hjælp af organ kimmetoden, gennemgik med succes en forgrenet morfogenese. Efter transplantation udviklede disse kirtler sig til modne sekretoriske kirtelstrukturer in vivo. Disse resultater bekræftede muligheden for at regenerere en bioteknologisk fremstillet sekretorisk kirtel ved hjælp af organkimtransplantation.

Generering af organoider som mini-organer fra pluripotente stamceller

Organoider, som gengiver organers delvise struktur og funktion, blev genereret fra multipotente stamceller baseret på konceptet om at rekapitulere induktionsprocessen af et organdannende felt med efterfølgende selvorganisering under den embryonale organogenese. Denne induktion blev opnået ved hjælp af forskellige kombinationer af cytokiner, som efterligner mønsterdannelsen og placeringen af signalering i embryoet. Dette koncept blev først bevist ved den vellykkede frembringelse af en optisk kop-organoid fra ES-celler . Derefter blev der induceret forskellige organoider i hvert organdannende område, f.eks. nethinden, hypofysen, cerebrum, det indre øre og hårfolliklen i hovedområdet, skjoldbruskkirtlen og lungerne i thoraxområdet og tyndtarmen, maven og nyrerne i maveområdet .

Voksne vævsstamceller, såsom tarm- , lunge- , mave- og bugspytkirtelstamceller , er også i stand til at generere organoider gennem selvorganisering af deres niche, som delvist kan reproducere den oprindelige vævsstruktur. Selv om definitionen af en organoid er lidt forskellig alt efter dens oprindelse (dvs. pluripotente stamceller eller vævsstamceller), genskaber organoider delvist organ- eller vævsstrukturen og kan vokse til en begrænset lille størrelse og betragtes derfor som mini-organer. Derfor er en organoid i modsætning til en biotekniske organspire ikke i stand til helt at erstatte de oprindelige organers funktioner efter ortotopisk transplantation alene; ortotopisk og heterotopisk transplantation af flere organoider kan dog delvist genoprette organfunktionen .

For nylig lykkedes det os at regenerere en fuldt funktionel spytkirtel fra ES-celler fra mus in vivo (figur 4e,f) . Ved hjælp af den generelle metode til organoiddannelse genererede vi spytkirtelprimordiumet som en organoid gennem induktion af et organdannende felt (dvs. den orale ektoderm), som derefter blev transplanteret ortotopisk. Den transplanterede organoid udviklede sig til en moden spytkirtel med den korrekte vævsstruktur, f.eks. acinærvæv, og dannede passende forbindelser med de omkringliggende væv, herunder PG-kanalen og nerverne. Desuden udskrev den regenererede spytkirtel spyt som reaktion på smagsstimulering ved hjælp af citronsyre, hvilket viser den fulde funktionelle genopretning af den oprindelige spytkirtel efter ortotopisk transplantation af organoidet (figur 4f). Disse undersøgelser viser klart, at det er muligt at foretage funktionel organregenerering ved hjælp af organoider, der er genereret ved at inducere organdannelsesfeltet i multipotente stamceller, ikke embryonale stamceller med organinduktionspotentiale. Udvikling af det nye in vitro-kultursystem, der gør det muligt for organoider af store organer, såsom lever og nyre, at vokse til en passende størrelse, bør være det næste forskningsemne for at opnå organregeneration.

Regeneration af et tredimensionelt IOS fra iPS-celler

Den koordinerede funktion af flere organer, der kollektivt betegnes som et organsystem, såsom centralnervesystemet, kredsløbssystemet, fordøjelsessystemet og IOS, er afgørende for at opretholde homeostase i en organisme . Derfor er regenerering af hele organsystemet den næste udfordring inden for regenerativ medicin. IOS er det største organsystem i kroppen. Dette system indeholder flere organer som f.eks. hårfollikler, talgkirtel og svedkirtel ud over hudvævet, der består af epidermis, dermis og subkutant fedt. Hudens organsystem spiller vigtige roller i homøostasen, f.eks. sekretion af fugt og talg og beskyttelse mod ultraviolet lys og ydre stimulering ved hjælp af hårstråene. Hudskader ved alvorlige forbrændinger er livstruende. Medfødte defekter og tab af hudtilbehør påvirker livskvaliteten betydeligt, selv om der er mulighed for delvis regenerativ medicinsk behandling med epidermal plader. Der er blevet rapporteret om skabelse af kunstig hud, der består af epidermis og dermis, og om regenerering af hårfollikelorganer ved hjælp af cellemanipulation. Ikke desto mindre er intet hudorgansystem blevet regenereret.

For nylig lykkedes det os at regenerere IOS ved at inducere et organdannende felt i embryoid bodies (EB’er) afledt af iPS-celler fra mus (figur 5a) . Efter transplantation af EB’er i den subrenale kapsel blev generering af hudtilbehør, herunder hårfollikler, talgkirtler og subkutant fedtvæv, bekræftet i den bioteknologiske IOS uden tumorigenese (figur 5b,c). Desuden var antallet og tætheden af regenererede hår i den bioteknologiske IOS det samme som i naturligt hår, hvilket tyder på, at organogenesen i IOS foregik på samme måde som i den normale udvikling. Den bioteknologiske IOS, der blev genereret i den subrenale kapsel, var fuldt funktionel efter transplantation til nøgenmusenes ryghud, hvilket fremgik af den gentagne hårcyklus (figur 5d). Denne undersøgelse beviste konceptet om regenerering af organsystemer in vivo. Ud fra et praktisk anvendelsesperspektiv er det ønskeligt med en ny strategi til at generere et organsystem in vitro. En sådan strategi kunne være at samle de mange forskellige typer organoider som dele. Forskning i at kontrollere organoidernes konfiguration og dyrke dem in vitro vil være den næste trend inden for regenerativ medicin.

Slutning og fremtidsperspektiver

I dette årti har undersøgelser af organregeneration med udgangspunkt i bioteknologi gjort store fremskridt i retning af realisering af organregenerativ terapi ved at indarbejde begreberne fra stamcellebiologi og udviklingsbiologi. På grundlag af resultaterne af organoidstudier kan stort set alle mini-organer genereres fra enten pluripotente stamceller eller vævsstamceller, hvilket fjerner bekymringerne om cellekilden til organregenerativ terapi. Funktionel regenerering af ektodermale organer ved hjælp af celler isoleret fra embryonale organkim, stamceller med organinduktivt potentiale og pluripotente stamceller beviser konceptet for organerstatningsterapi.

Det er vigtigt at udvikle et in vitro tredimensionelt kultursystem med mulighed for at dyrke organoider og organkim til en passende størrelse for at opnå funktionel regenerering af flere organer og organsystemer. De nuværende in vitro-kultursystemer gør det ikke muligt at opnå passende vækst eller vedligeholdelse af organoider eller organkimser på grund af forekomsten af nekrose i disse væv, hovedsagelig på grund af manglende næringsstofforsyning. In vivo er blodcirkulationssystemet afgørende for at opretholde organernes funktioner gennem ilttransport, næringsstofforsyning og fjernelse af affald. De seneste fremskridt inden for vævsteknologi har vist, at det vaskulære netværk tilfører biologiske stoffer til det indre af cellesfæroidens indre. Desuden har vi tidligere udviklet et organperfusionskultursystem ved hjælp af et vaskulært netværk, der opretholdt rotteleveren i en sund tilstand i en længere periode , hvilket giver ledetråde til udvikling af et nyt tredimensionelt kultursystem.

Da hårfollikelstamceller er de eneste voksne stamceller med organinduktivt potentiale, der kan transplanteres autogent, vil det første kliniske forsøg med organregenerativ terapi på mennesker utvivlsomt undersøge regenerering af hårfollikelceller. Regenerering af hårfollikler ved hjælp af vores organkeimmetode undersøges nu i en præklinisk undersøgelse med henblik på at helbrede patienter, der lider af androgen alopeci, med henblik på at gennemføre kliniske forsøg i 2020. Denne regenerative hårfollikelterapi vil være en milepæl inden for regenerative organterapier og vil føre til udvikling af materiale og responsiv infrastruktur til realisering af regenerativ medicin for organer. Anvendelse af viden om regenerering af hårfollikel og ekspertise fra kliniske forsøg på andre organkimeller eller organoider vil gøre det muligt at regenerere andre organer fra pluripotente stamceller og vævsstamceller i kombination med organoidteknologier i de næste par årtier.

Datatilgængelighed

Denne artikel har ingen yderligere data.

Autors bidrag

T.T. har designet denne gennemgang. E.I., M.O., M.T. og T.T. skrev manuskriptet.

Konkurrerende interesser

Denne undersøgelse blev udført i henhold til en opfindelsesaftale mellem Riken og Organ Technologies Inc. T.T. er direktør hos Organ Technologies Inc.

Funding

Publikationen af denne anmeldelse blev delvist støttet af et Grant-in-Aid for KIBAN (A) fra Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (bevilling nr. 25242041) og af et samarbejdstilskud (til T.T.) fra Organ Technologies Inc. Dette arbejde blev delvist finansieret af Organ Technologies Inc.

Fodnoter