Svampe undersøgt

Escovopsioides isolater blev opnået fra svampehaver af forskellige bladskærermyrearter og ikke-bladskærermyrearter indsamlet i tidligere undersøgelser. Denne samling omfatter 20 isolater opnået fra Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi og Trachymyrmex tucumanus, foruden typearten af E. nivea opnået fra Acromyrmex subterraneus subterraneus (tabel 3). Der blev også opnået yderligere et isolat fra en koloni af den ikke-bladskærende myre Apterostigma megacephala, der blev fundet i Parauapebas, Pará, Brasilien (tabel 3). Alle isolater udviste de beskrevne morfologiske karakteristika for Escovopsioides-slægten: hyaline kolonier på PDA, terminale og interkalære vesikler med lagenformede fialider, hyaline konidier i lange kæder, aleuroconidier og chlamydospore-lignende strukturer .

Isolaterne opbevares som konidiasuspensioner ved – 80 °C (i glycerol 10 %) og i destilleret vand ved 10 °C i samlingen fra Laboratory of Fungal Ecology and Systematics (LESF), Rio Claro, São Paulo State, Brasilien. Alle isolater blev genoplivet fra lagre ved at inokulere konserverede konidier på PDA-medium og inkuberet i 7 dage ved 25 °C i mørke. Alle undersøgte isolater blev opnået som monosporiske kulturer.

Molekylær karakterisering af Escovopsioides

Genomisk DNA blev ekstraheret ved hjælp af CTAB-metoden fra kulturer dyrket på malt agar 2% (MA2%) i 5 dage i mørke. Generne, der koder for tef1 (primere: EF6-20F og EF6A-1000R), LSU (primere: CLA-F og CLA-R) samt ITS (primere: ITS5 og ITS4) blev amplificeret for alle isolater. For tef1 blev 1 μL fortyndet genomisk DNA (1:100) anvendt som skabelon til amplifikation ved hjælp af illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) under følgende betingelser: et indledende denatureringstrin ved 94 °C i 2 min, efterfulgt af 15 cyklusser ved 94 °C i 30 s og en indledende annealingstemperatur på 65 °C, der falder med 1 °C pr. berøringscyklus, og endelig forlængelse ved 72 °C i 1 min. Der blev udført et andet PCR-trin: 94 °C i 30 s, efterfulgt af 35 cyklusser ved 94 °C i 30 s, 48 °C i 30 s og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 1 minut. For ITS blev 2 μL fortyndet genomisk DNA (1:100) anvendt som skabelon til PCR under de betingelser, der er beskrevet i Schoch et al.: 94 °C i 3 min, efterfulgt af 35 cyklusser ved 94 °C i 1 min, 55 °C i 1 min og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 2 min. For LSU blev 2 μL fortyndet genomisk DNA (1:100) anvendt til PCR under de betingelser, der er beskrevet i Augustin et al.: 95 °C i 2 min., 40 cyklusser af 30 s ved 95 °C, 60 s ved 62 °C, 90 s ved 72 °C og 5 min. forlængelse ved 72 °C. PCR-produkterne blev farvet med GelRed™ (Biotium) og visualiseret under UV efter elektroforese i 1% agarosegel.

Amplikonerne blev renset med Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) efter producentens protokol. Prøverne blev analyseret i NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific), og 20 ng DNA blev sekventeret ved hjælp af BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) i henhold til producentens anvisninger. På grund af det høje GC-indhold i ITS-regionen hos Escovopsioides blev der tilsat 5 % DMSO til sekventeringsreaktionerne. Forward- og reverse-sekvenser blev genereret i ABI 3500 (Life Technologies) og sammensat til kontigs i BioEdit v.7.1.3 . Sekvenser, der blev genereret i denne undersøgelse, blev deponeret på NCBI-GenBank (Additional file 1: Table S1).

Fylogenetisk analyse

Ud over de sekvenser, der blev genereret i denne undersøgelse, blev sekvenserne af typearten (E. nivea) sammen med seks beskrevne Escovopsis-arter og otte svampe, der tilhører Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma og Lecanicillium), hentet fra NCBI-GenBank. Hele det datasæt, der blev anvendt i denne undersøgelse, omfattede således sekvenser af 37 svampe (Additional file 1: Table S1).

Til brug for den fylogenetiske analyse blev sekvenserne afstemt i MAFFT . Sekvenser af tef1, ITS og LSU blev sammenkædet i Winclada v.1.00.08. Bayesiansk inferens blev anvendt som rekonstruktionsalgoritme. Nukleotid-substitutionsmodellen GTR + G og GTR + I + G blev valgt for henholdsvis tef1 og ITS/LSU ved hjælp af AIC i jModeltest2 med et konfidensinterval på 95 %. Der blev således udført partitionerede uafhængige analyser af datasættet i MrBayes med hver tre opvarmede kæder og én kold kæde. MCMC-prøvetagning i hver analyse fandt sted op til en million generationer. Konvergens af opvarmede og kolde kæder opstod, når standardafvigelsen af splitfrekvenserne var under 0,01; derefter blev de første 25 % af generationerne kasseret som burn-in.

Dual-culture eksperimenter

Vi udførte in vitro-forsøg for at verificere Escovopsioides’ antagonistiske potentiale over for den svamp, der blev dyrket af bladskærermyrer. Vi udvalgte 13 ud af 21 Escovopsioides-isolater (tabel 3) på grundlag af følgende kriterier: i) enhver polymorfisme fundet i tef1-genet; ii) forskellige associerede myrearter; iii) geografisk placering (dvs. forskellige byer og indsamlingssteder). To af de udvalgte isolater (LESF 596 og LESF 599) var allerede blevet evalueret for deres interaktioner med svampesorten i undersøgelsen af Varanda-Haifig et al. Vi gentog imidlertid dette forsøg for at sammenligne med yderligere Escovopsioides-isolater.

Svampen Leucoagaricus gongylophorus FF2006, der blev dyrket af myrearten Atta sexdens rubropilosa, blev anvendt i de dobbeltkulturelle eksperimenter. Denne stamme opretholdes på agarslam ved successive overførsler hver 24. dag ved 25 °C. Produktionen af gongylidier fra denne stamme kontrolleres i hver overførselscyklus. Denne svamp blev dyrket på PDA-medium og inkuberet ved 25 °C i 14 dage i mørke. Efter denne periode blev mycelfragmenter (8 mm i diameter) overført til nye petriplader (90 × 15 mm), der også indeholdt PDA, i en afstand af 1,5 cm fra kanten. Disse plader blev inkuberet ved 25 °C i 14 dage i mørke. Derefter blev myceliumfragmenter (8 mm i diameter) af Escovopsioides, der tidligere var blevet inkuberet på PDA, inokuleret i en afstand af 3 cm fra den mutualistiske svamp. For at sammenligne Escovopsioides’ virkninger på svampekultens mycelvækst med de virkninger, der forårsages af andre svampe, anvendte vi et Escovopsis sp. isolat (LESF 19) fra svampehaver af Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brasilien). Dette isolat blev opnået ved at inokulere små stykker af svampehaverne på PDA suppleret med chloramphenicol. Kontrolpladerne blev inokuleret med den samme mutualistiske svamp, men der blev ikke inokuleret Escovopsioides eller Escovopsis. Alle plader blev inkuberet i 14 dage ved 25 °C i mørke. Hver kombination af Escovopsioides, Escovopsis og den mutualistiske svamp blev udført på ti plader. Forsøgs- og kontrolpladerne blev scannet med intervaller på 0, 2, 3, 5, 7 og 10 dage på en HP Deskjet F2050-scanner. Billederne blev brugt til at måle arealet af kolonivækst (cm2) af den mutualistiske svamp i ImageJ v. 1.38 .

De myceliale vækstarealer af L. gongylophorus i dobbeltkulturforsøgene blev analyseret ved hjælp af tovejs blandet ANOVA med svampeisolater (Escovopsioides og Escovopsis) versus kontrol som mellem-emner-variabel og tid (dage) som indenfor-emner-variabel, hvorved der blev taget hensyn til de repetetiske målinger af tid i behandlingerne. Dataene blev kontrolleret for normalitet og variansens homogenitet ved hjælp af henholdsvis Shapiro-Wilk- og Levene-test. På grund af overtrædelser af disse kriterier blev dataene om nødvendigt transformeret ved hjælp af logaritme eller kvadratrod. Flere sammenligninger med forskellige filamentøse svampe blev udført ved hjælp af t-test med Bonferroni-korrektion.

Til sammenligning mellem isolater blev mycelvækstarealet af L. gongylophorus i kontakt med Escovopsioides-isolater divideret med det gennemsnitlige areal af dens kontrol på dag 10. Dataene blev kontrolleret for normalitet og homogenitet af varianserne. Envejs ANOVA blev udført med det areal, der blev opnået på dag 10 mellem alle testede svampe, og sammenligninger mellem de forskellige behandlinger blev foretaget ved hjælp af post-hoc Tukey-HSD-test. Statistiske analyser blev udført i R v. 2.12.1 .

Bioanalyser på svampehavefragmenter i fravær af arbejdere

Leucoagaricus gongylophorus dyrkes i attine myrekolonier i svampehaver. For at afgøre, om Escovopsioides kan udvikle sig på svampehaven uden de mulige beskyttende virkninger fra arbejderne, udførte vi bioassays med fragmenter af dette substrat uden myrer. Fragmenter af svampehaver blev fremstillet fra en moden og sund A. sexdens rubropilosa-koloni, som blev vedligeholdt på Center for Studier af Sociale Insekter (UNESP, Rio Claro). Svampehavefragmenter på 2 cm3 uden myrer og yngel blev anbragt i sterile petriskåle med fugtet bomuld i kanterne (efter Elizondo-Wallace et al. ). Inden eksperimenterne blev pladerne opbevaret i 1 dag ved 25 °C for at søge efter myrer, der muligvis var tilbage i fragmenterne.

Vi fremstillede en 10 mL suspension af 0,05% Tween 80 med mycelmasse og konidier af hver af de 12 Escovopsioides (isolat LESF 591 blev ikke brugt i dette forsøg) og et Escovopsis-isolat, der blev brugt i dobbeltkulturforsøgene. Denne opslæmning blev filtreret to til tre gange efter Newmeyer-metoden for at adskille konidierne fra de hyferfragmenter, der var i opslæmningen. Derefter blev suspensionen fortyndet til 105 til 2.105 konidier mL-1 , bestemt i et Neubauer-kammer. Der blev inokuleret 100 μL konidiesuspensioner på overfladen af havefragmentet ved hjælp af en mikropipette. Den samme mængde steril 0,05 % Tween 80-opløsning blev tilsat på havens overflade i den negative kontrol. Petriskåle med svampehaven blev opbevaret ved 25 °C i op til 10 dage, idet der blev anvendt fem skåle til hver behandling og fem skåle til hver kontrol. Den mulige udvikling af hyphaer hos de inokulerede svampe blev observeret dagligt i et stereomikroskop (EZ4, Leica). Escovopsioides konidiation på svampehaverne blev observeret ved at tage myceliumfragmenter, der voksede på haverne, og monteret i vand og observeret under mikroskopet (DM500, Leica).

Vækst- og konidiationsdata på svampehaverne blev scoret som: ingen vækst (score 0), vækst kun observeret i stereomikroskopet (score 1), makroskopisk vækst (score 2) og konidiation (score 3) i løbet af 10 dages overvågning (Additional file 1: Figur S1). Vi observerede kun konidiation efter svampens makroskopiske vækst på svampehaverne. Den samlede sum af scorerne for fem Petriskåle på hver dag blev opnået og transformeret i procent af den maksimalt mulige total for direkte sammenligninger.

Effekter af Escovopsioides på haver med arbejdere

Antarbejdere har en vigtig rolle i koloniforsvaret mod patogener og uønskede mikrober i svampehaverne . Derfor udførte vi eksperimenter for at kontrollere indflydelsen af arbejdere i svampehaver, der er podet med konidier af de samme svampe, som blev anvendt i bioassays på svampehaver i fravær af myrearbejdere (12 Escovopsioides-isolater og 1 Escovopsis-isolat).

Bioassays ved hjælp af dronningerige myrekolonier er en udfordring på grund af det store antal kolonier, som denne type eksperiment ville kræve. Derfor udførte vi bioassays med havefragmenter, der indeholder arbejdere, for at vurdere virkningerne af svampeisolaterne in vivo. Selv om denne forsøgsopstilling ikke repræsenterer det, der sker i naturlige kolonier, viste den indikative oplysninger om arbejdernes forsvarsmæssige indsats mod de testede svampe. Dette bioassay blev tilpasset efter metoden af Elizondo-Wallace et al. Der blev anvendt plastbeholdere med et lille lag gips i bunden for at undgå udtørring af svampehaverne. Ca. 20 cm3 svampehave fra den samme koloni, som blev anvendt i det foregående forsøg, blev anbragt i plastbeholderne. Forsøgsopstillingen bestod af i alt 84 beholdere, således at behandlingerne med konidier af de 13 svampe og kontrollen havde seks beholdere hver. Vi udvalgte arbejdermyrer med en diameter på mellem 1,0 og 1,6 mm på den cephale kapsel, hvorefter 50 af disse arbejdere blev anbragt i hver beholder. Arbejdere med mindre end 1,0 mm blev ikke talt, og arbejdere med mere end 1,6 mm blev udelukket. Denne fremgangsmåde blev anvendt for at sikre homogenitet mellem de seks beholdere fra hver behandling og mellem behandlingerne, fordi arbejderne i intervallet mellem 1,0 og 1,6 mm har en betydelig rengøringsaktivitet . Beholderens indvendige overflade blev belagt med Teflon® for at forhindre myrer i at undslippe.

Beholderne blev inkuberet ved 25 °C i 3 dage for at stabilisere svampehaverne. Konidiesuspensioner blev fremstillet som beskrevet ovenfor. I alt 1 mL konidiesuspension blev sprøjtet på overfladen af svampehaverne ved hjælp af en sprøjte. Svampehaverne i den negative kontrol blev kun sprøjtet med 1 mL steril 0,05% Tween 80-opløsning.

Ved forsøgene blev der ført tilsyn efter 0, 5 og 10 dages inokulering for at kontrollere svampehavernes sundhedstilstand. Denne parameter var baseret på et pointsystem, hvor sunde haver fik point 0, delvist nedbrudte haver fik point 1 og helt nedbrudte (“inficerede”) haver fik point 2. Det vigtigste tegn på havernes forringelse, som vi undersøgte, var, at der blev fjernet myrebidder fra svampehaverne og lagt dem på lossepladserne (se Additional file 1: Figur S2). Scorerne fra de seks beholdere i hvert forsøg på de 3 observationsdage blev sammenlignet ved hjælp af Friedman-test.

For at verificere tilstedeværelsen af Escovopsioides-isolater på svampehaverne på dag 0, 5 og 10 efter behandlingen blev fragmenter fjernet fra haverne og inokuleret på MA2% suppleret med 150 μg mL- 1 chloramphenicol. Pladerne blev inkuberet ved 25 °C i 7 dage i mørke. Der blev anvendt fem plader med et havefragment til hver af de seks beholdere fra hver behandling, dvs. i alt 30 plader pr. behandling. Fragmenter med positiv vækst blev talt, og den langsigtede tilstedeværelse af de inokulerede svampe i svampehaverne blev testet ved hjælp af Fisher’s Exact-test. I denne analyse sammenlignede vi andelen af frangementer, der var inficeret med svampekonidier (Escovopsioides og Escovopsis), med kontrollen uden nogen konidier på hver forsøgsdag. Vi sammenlignede også de forskellige behandlinger med inokulerede svampe mellem hinanden på hver forsøgsdag.