Enkle ubalancerede translokationer og inversioner (klasse A og C): oprindelsesmekanismer
Det direkte resultat af denne undersøgelse er, at i 20 ud af 37 af de novo ubalancerede translokationer har duplikationen en moderlig oprindelse (Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2). Da undersøgelsen af den forældrenes oprindelse ikke var informativ eller ikke mulig i seks tilfælde (tilfælde 7, 14, 23, 24, 33 og 35), repræsenterer de novo ubalancerede translokationer, hvor den duplikerede region er af moderlig oprindelse, 64,5 % (20/31) af de fuldt informative tilfælde. Ved at kombinere disse data med den konstatering, at der i otte af disse tilfælde (tilfælde 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 og 32) er tre alleler (Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2), to maternelle og en faderlig, var til stede i det mindste i en del af duplikationsregionen, er det nye scenarie, at i ikke mindre end 25% (8 ud af 31) er den primære drivkraft for forekomsten af de novo ubalancerede translokationer en moderlig meiotisk non-disjunktion efterfulgt af en delvis trisomi redning af det overtallige moderlige kromosom (Fig. 1a). Den mest sandsynlige forklaring på tilstedeværelsen af tre alleler inden for den duplikerede region, to maternelle og en faderlig, ville være non-disjunktion ved den maternelle meiose I (mat-MI) (Fig. 1A.I). Alternativt må en meiotisk rekombination tæt på eller ved translokationsbrudpunktet være gået forud for en non-disjunktion i den maternelle meiose II (mat-MII). I modsætning hertil kan man i de 12 tilfælde (4-6, 10, 12, 13, 13, 17, 22, 26, 30, 34 og 37) med den samme maternelle duplikerede haplotype ikke udelukke andre mekanismer (Fig. 1b), selv om de også kunne skyldes enten mat-MI non-disjunktion (Fig. 1A.I), efter en telomerisk crossing-over, i overensstemmelse med den præferentielle forekomst af telomeriske crossovers, der er påvist for nogle ikke-disjoined kromosomer (Oliver et al. 2014) eller en maternel MII (mat-MII) non-disjunktion (Fig. 1A.II), som rapporteret i en række tilfælde af trisomy rescue (gennemgået i Chantot-Bastaraud et al. 2017).
Det er velkendt, at anafaseforsinkelse af det overtallige kromosom efterfulgt af dets indfangning i en mikronukleus ligger til grund for mange kromothripsishændelser (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). Som følge heraf elimineres det overtallige kromosom i den ene dattercelle, mens i den anden kan splintringen af det mikronukleære genomiske materiale efterfulgt af genindlejring af alle eller nogle fragmenter inde i hovedkernen resultere i en massiv reorganisering af det oprindelige kromosom, der enten bevarer det meste af sit materiale, selv om det er reorganiseret i en ny rækkefølge, eller mister nogle af sine dele (Fig. 1a); hvilke dele af det oprindelige overtallige kromosom der går tabt, og hvilke der bevares, kan afhænge af stokastiske hændelser, af de afbrudte enders tilbøjelighed til at integrere sig med hinanden eller med andre dele af genomet og/eller af den efterfølgende udvælgelse af celler, der kan overleve og formere sig under tilstedeværelse af minimale segmentale ubalancer. I teorien kan centriske fragmenter bevares som overtallige markørkromosomer ved cirkularisering med dannelse af ringkromosomer, hvorved fraværet af telomerisk sekvens i begge ender overvindes. Bevarelsen af overtallige interstitielle acentriske fragmenter kræver også dannelse af et neocentromer eller alternativt indfangning af fragmentet af et andet kromosom med dannelse af en de novo insertionel translokation. Faktisk rapporterede Kato et al. (Kato et al. 2017) for nylig et tilfælde af de novo interstitial translokation afledt af kromothripsis af et overtalligt kromosom, der er til stede i en trisomisk zygote. Endelig kræver bevarelsen af supernumerære fragmenter udstyret med en telomer i den ene ende enten en telomerindfangning, f.eks. et transloceret supernumerært markørkromosom som rapporteret i Vetro et al. (2012) (tilfælde 2 og 3) eller dets indfangning af et andet kromosom, det modtagende kromosom, der mister sin distale del og dermed danner en 46-kromosomcelle med en ubalanceret de novo translokation, som beskrevet her. Faktisk illustrerer tilfælde 6 med duplikation af den samme maternelle haplotype (Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2) forekomsten af en kromothripsishændelse (Fig. 1a), som det fremgår af tilstedeværelsen af to ikke-sammenhængende duplikerede regioner, der er adskilt af ~ 1,3 Mb, hvoraf den interstitielle har en omvendt orientering (Online Resource 2: Figur S15). Chromothripsis-hændelser er blevet observeret i en række tilfælde af de novo ubalancerede translokationer (Weckselblatt et al. 2015), og de fleste af dem er blevet rapporteret til at være af faderlig oprindelse og til at involvere mere end to kromosomer (Marcozzi et al. 2018). I modsætning hertil var den ubalancerede translokation i vores tilfælde 6 af moderlig oprindelse og faktisk de novo, hvilket stemmer overens med FISH-undersøgelser af forældrenes metafaser. Desuden involverede den, i det mindste som vurderet af de højopløselige (1M) aCGH- og FISH-undersøgelser, kun to kromosomer, mens en mere kompleks rearrangement blev udelukket. Det er derfor fristende at spekulere i, at zygoten eller det tidlige embryo var trisomisk for kromosom 8 på grund af enten en meiotisk eller postzygotisk maternel non-disjunktion. Efter splittelsen af det overtallige kromosom 8 blev kun to ikke-sammenhængende dele genoprettet, herunder den telomeriske del, som, da de allerede var syet sammen igen, blev erhvervet af recipienten 18q (Fig. 1a).
Modellen for dannelsen af de novo ubalancerede translokationer, der starter fra en trisomisk zygote, passer også med tilfælde 24, selv om vi ikke kunne foretage nogen understøttende molekylær undersøgelse. Tilstedeværelsen af en resterende cellelinje trisomisk for kromosom 9 sammen med en hovedlinje med normal karyotype og en tredje med den ubalancerede t(14;9)-translokation tyder imidlertid på, hvordan der med udgangspunkt i en trisomisk zygote kan dannes forskellige cellelinjer, nogle med totalt tab af det overtallige kromosom og andre med tab af en del af det (9p) og dets resterende del (hele 9q), der er fanget af et andet kromosom. Denne type mosaik med tre cellelinjer er sjældent blevet dokumenteret (Phillips et al. 1997), men ved prænataldiagnostik er mosaikker med én normal cellelinje og en anden med en de novo ubalanceret translokation relativt almindelige, og en øget moderlig alder kan påvises i de fleste af dem (Kovaleva og Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).
En uafhængig støtte til hypotesen om, at maternel non-disjunktion er en hovedudløser for de novo ubalancerede translokationer, er en øget moderlig alder. Faktisk blev der i vores otte tilfælde (tilfælde 1, 2, 9, 11, 11, 15, 19, 28 og 32), hvor duplikationen uden tvivl var forbundet med en moderlig meiotisk non-disjunktion (to forskellige moderlige alleler inden for duplikationsområdet), dokumenteret en stigning i den gennemsnitlige moderlige alder (34,75 år, Online Resource 1: Tabel S1), idet der tages hensyn til, at den gennemsnitlige moderlige alder i Italien i 2016 var på 31,8 år (ISTAT, https://www.istat.it/). En stigning (33,5 år) blev også anerkendt i de 12 tilfælde (tilfælde 4, 5, 6, 10, 12, 13, 13, 17, 22, 22, 26, 30, 34 og 37) med duplikation af samme maternelle allel, hvilket er foreneligt med en maternel non-disjunktion som en initierende begivenhed. Selv i de tilfælde, hvor duplikeringen var faderlig, blev der vist en stigning, om end meget mere begrænset, i den gennemsnitlige moderlige alder (32,6 år), hvilket muligvis tyder på, at andre mekanismer end moderlig non-disjunktion kan spille en rolle i dannelsen af disse ubalancerede translokationer. Faktisk var der i de fire tilfælde (3, 8, 29 og 36), der blev analyseret ved hjælp af SNP-array, ingen maternel hetero-isodisomi til stede i den ikke-duplikerede del af de homologe kromosomer (Online Resource 1: Tabel S2), som man ville have forventet for en trisomisk zygote, hvor det overtallige faderlige kromosom havde gennemgået kromothripsis med redning af kun den telomeriske del. Hvis man således også tager hensyn til den ubetydelige frekvens af trisomier, der stammer fra fejlsammensætning i faderlig meiose (Nagaoka et al. 2012), forekommer forekomsten af ubalancerede translokationer antændt af delvis trisomisk redning af en trisomisk zygote af faderlig oprindelse meget usandsynlig. I stedet synes andre mekanismer, såsom et nedarvet eller postzygotisk dobbeltstrenget faderligt brud, der kræver at blive repareret ved telomerindfangning, mere plausible (Fig. 1b). Faktisk passer tilfælde 25, som er mosaisk for to cellelinjer, der er til stede i blod og i fibroblaster, med en terminal 2q-deletion og et afledt kromosom der(2)t(2q;14q) af faderlig oprindelse (Online Resource 2:Figur S9), med denne hypotese. I tilstedeværelsen af en terminal deletion kan forskellige reparationsmekanismer således forekomme på forskellige tidspunkter i forskellige celler i det tidlige embryo, hvilket i sidste ende fører til en mosaiktilstand. I denne model initierer det slettede kromosom translokationsbegivenheden og fungerer som modtager, mens det duplikerede kromosom er donor og fungerer som skadereparerende (fig. 1b). Det er imidlertid ikke muligt at afgøre, om deletionen faktisk er den første begivenhed, der fører til translokationen, eller om den i stedet er sekundær i forbindelse med dannelsen af et dicentrisk kromosom (fig. 1BIII og IV), der som følge af dets asymmetriske brud genererer et inv-dup del-kromosom og et simpelt slettet kromosom, idet sidstnævnte derefter repareres ved telomerindfangning (fig. 1b). Det er muligt, at den dikentriske persistens ud over de første embryonale divisioner resulterer i brud af forskellig størrelse i de forskellige celler, som igen repareres enten af telomerase eller telomerindfangning.
Mærkværdigt nok blev der uanset mekanismen påvist en høj prævalens af tilfælde, hvor begge ubalancer har samme forældreoprindelse (Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2), på trods af at en biparental oprindelse af deletion og duplikation ville være forventet i halvdelen af tilfældene, i henhold til en postzygotisk endelig begivenhed. Demonstrationen af en tydelig kompartmentalisering af de to sæt af forældrekromosomer i musembryoner indtil 8-cellestadiet (Du et al. 2017) kan give en forklaring. Da denne periode falder sammen med meget høj kromosomal ustabilitet, (McCoy et al. 2017), er det fristende at spekulere i, at en mekanisme som telomerindfangning, der er nødvendig for stabilisering af en tidligere strukturel abnormitet, forekommer på det samme forældrenes kromosomale sæt af den oprindelige anomali. I modsætning hertil ville yderligere senere genjusteringer forventes at forekomme tilfældigt og involvere kromosomer af begge forældrenes oprindelse, hvilket ville føre til et ubalanceret transloceret kromosom af biparental oprindelse, som vi faktisk fandt i fem tilfælde (tilfælde 10, 12, 27, 30 og 31; Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2).
Som for klasse C-omlægninger fandt vi ikke nogen ejendommelighed ved krydsningsbrudpunkterne, der kunne afklare, om deres stabilisering ved telomerindfangning af den kromosomale del modsat den slettede del skyldes en anden mekanisme sammenlignet med de tilfælde, hvor indfangningen af telomeren er afhængig af et andet kromosom. Denne analyse kunne dog kun foretages i to tilfælde. Konstateringen af, at i 4 ud af 5 tilfælde var både deletion og duplikation af faderlig oprindelse, tyder på, at de enten stammer fra en oprindelig deletion eller fra bruddet på et dicentrisk kromosom.
Komplekse ubalancerede translokationer og inversioner (klasse B og D)
Der er almindelig enighed om, at disse rearrangementer skyldes et mellemliggende dicentrisk kromosom efter dets asymmetriske brud, der fører til en inv-dup del og et simpelt slettet kromosom (fig. 1B.III). Erhvervelse af en stabiliserende telomerisk sekvens kan ske ved en række modaliteter: telomerase-medieret tilføjelse af de novo TTAGGG-sekvenser, telomerindfangning af den distale del af et andet kromosom (Yu og Graf 2010) eller af den modsatte del af det samme kromosom (Buysse et al. 2009; Fan og Siu et al. 2001), eller endda dannelse af et ringkromosom (Rossi et al. 2008). De to translocerede inv-dup del(8p) tilfælde, som vi kunne genotype (tilfælde 42 og 44), stammede som forventet (Giglio et al. 2001) fra NAHR ved mat-MI, som det fremgår af tilstedeværelsen af to maternelle og en faderlig allel i 8p-duplikationsregionen (Online Resource 1: Tabel S2). Denne tilbagevendende unormale rekombination formidles af meget identiske segmentale duplikationer placeret ved 8p23 inden for et normalt og et omvendt kromosom 8 (Giglio et al. 2001). I zygoten vil det resulterende dicentriske kromosom sandsynligvis gennemgå forskellige brudhændelser i forskellige celler, hvilket nogle gange fører til en mosaiktilstand med en del(8p)-cellelinje og en anden med inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), eller i undtagelsestilfælde endda en tredje med inv-dup del(8p), der ender med den distale region af et andet kromosom (Pramparo 2004). Disse mosaikker påvises hyppigere ved prænatal diagnose, mens en enkelt cellelinje med inv-dup del(8p), enten translokation eller ej, er det hyppigste fund i det mindste i blodet i postnatallivet. I vores tre translocerede tilfælde (tilfælde 42, 43 og 44) blev telomererne doneret af henholdsvis 6q, 17p og Xq, alle af moderlig oprindelse, og med den samme duplikationshaplotype af de maternelle kromosomer 6, 17 og X, som forventet for en stabiliseringsbegivenhed, der fandt sted postzygotisk. I de resterende tre tilfælde (tilfælde 39, 40 og 45), der som alle inv-dup del-rearrangementer, der ikke involverer 8p, ikke er tilbagevendende, var det translocerede inv-dup af faderlig oprindelse med identiske faderlige alleler i duplikationsregionen, mens telomerindfangning blev leveret af et kromosom af faderlig oprindelse i to tilfælde (tilfælde 39 og 49, Online Resource 2: Figurer S3, S4) og et moderligt i det tredje tilfælde (tilfælde 45), et foster, hvor det translokerede kromosom t(inv-dup5p;3q) var i mosaik med en cellelinje, der indeholdt et ikke-translokeret inv-dup del(5p) (Online Resource 2: Figur S12). Især er 5p-duplikationen af forskellig størrelse i de to cellelinjer (Online Resource 1: Tabel S1), hvilket faktisk viser, at det oprindelige dicentriske kromosom formentlig er til stede i zygoten eller i det meget tidlige embryo (Fig. 1b), undergik forskellige brud i de forskellige celler, ud over embryonet i spaltningsstadiet.
Identiske duplikerede alleler er blevet rapporteret bona fide i alle inv-dup del-rearrangementer, der ikke involverer 8p, hvilket således indikerer en intrachromosomal oprindelse af disse rearrangementer (Hermetz et al. 2014). Følgelig synes disse inv-dup translokationsomlægninger at være det endelige resultat af en indledende mitotisk begivenhed, muligvis i det tidlige embryo (Voet 2011), såsom et dobbeltstrengsbrud efterfulgt af intrastrandparring på relativt tætte steder med inverterede homologe sekvenser, hvilket fører til dannelsen af det dikentriske kromosom med en indskudt normal kopiregion (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Som allerede nævnt kan det gensidige produkt af inv-dup del, nemlig et slettet kromosom, repareres og stabiliseres ved at indfange den distale del af et ikke-homologt kromosom eller den modsatte arm af det samme kromosom, hvilket resulterer i henholdsvis en simpel ubalanceret translokation eller inversion, som vi foreslår for nogle af de rearrangementer, der er opført i klasse A og C (Fig. 1b).
Breakpoint junctions
Sequencelering af breakpoint translokationsjunction kunne foretages i 26 tilfælde (Online Resource 1: Tabel S1, Online Resource 2: Figur S1), selv om kryptisk kompleksitet i 4 tilfælde (tilfælde 4, 10, 28 og 51) hindrede en fin sekventering. Alternative non-homologous end joining (alt-NHEJ) eller microhomology-mediated break-induced replication (MMBIR) træk såsom microhomologies og templated eller non-templated små insertioner blev påvist i 16 tilfælde (tilfælde 3, 5, 6, 7, 8, 8, 9, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 og 52) (Online Resource 2: Figur S1). Det er bemærkelsesværdigt, at selv om rearrangementet i tilfælde 18 og 40 fandt sted inden for Alu-sekvenser, viste tilstedeværelsen af henholdsvis 5 bp kort templated insertion og 4 bp mikrohomologi, at rearrangementet ikke udførte en NAHR-medieret mekanisme, men snarere en alt-NHEJ eller MMBIR. Kanonisk NHEJ (c-NHEJ, blunt ends junctions) optrådte i fire tilfælde (tilfælde 26, 29, 31 og 43). I tilfælde 2 og 38 var brudpunktsforbindelserne ved kanten af homologe retrotransposoner (Online Resource 2: Figur S13). Dette resultat tyder på, at disse sekvenser i et mindretal af tilfældene gør reparationsmekanismer som f.eks. telomerindfangning lettere ved hjælp af disse sekvenser. Selv om Robberecht et al. fandt, at de fleste af deres de novo ubalancerede translokationer blev formidlet af NAHR mellem LINEs, HERVs eller segmentale duplikationer (Robberecht et al. 2013), kan vi udelukke en NAHR-hændelse i det mindste i tilfælde 2, hvor tilstedeværelsen af to duplikerede maternelle haplotyper, hvoraf den ene er transloceret til modtagerkromosomet, klart indikerer en mat-MI-non-disjunktion (Fig. 1, Online Resource 1: Tabel S2), hvilket gør det umuligt at tilskrive translokationen til en meiotisk hændelse. Faktisk er LINE-1-medierede retrotranspositionsbegivenheder blevet vist at forekomme i somatiske celler i det tidlige menneskelige embryon, i menneskelige embryonale stamceller og i det mindste i mus hovedsageligt i embryogenese (for en gennemgang Kazazian og Moran 2017), hvilket understøtter, at i vores tilfælde var dannelsen af translokationen også en postzygotisk begivenhed.
Kombineret indikerer disse træk, at reparationsbaserede mekanismer (c-NHEJ og alt-NHEJ) og replikative reparationsmekanismer (MMBIR) er ansvarlige for sammenføjningen af donor-kromosomet med modtager-kromosomet eller den modsatte del af det samme kromosom (Fig. 1).
Genotype-fænotypeforhold
Men selv om genotype-fænotypekorrelationer i store ubalancerede rearrangementer, som dem, der er rapporteret i vores undersøgelse, generelt er ret grove, tilføjer de data, vi rapporterer, nogle yderligere detaljer også i denne sammenhæng.
Det stærke bevis for, at nogle ubalancerede translokationer stammer fra en zygote med et overtalligt kromosom, der gennemgår en kromothriptisk begivenhed, tyder på, at duplikationsregionen, selv om den tilsyneladende kun består af den distale region af det kromothriptiske kromosom, kan indeholde fragmenter fra andre dele, som det er tilfældet i vores tilfælde 6, og som det er vist af Weckselblatt et al. (2015). I disse tilfælde, hvis størrelsen af de splittede stykker er under den størrelse, der kan påvises ved array CGH, er der risiko for kun at tilskrive den unormale fænotype til de gener, der synes duplikeret eller slettet, mens yderligere morbiditet kan skyldes unormal genekspression genereret af TAD-disruption (Fukami et al. 2017).
Dertil kommer, at i ubalancerede translokationer, der stammer fra delvis trisomy rescue, hvis kromotripsis ville forekomme på det overtallige kromosom af faderlig oprindelse, kan den efterfølgende maternelle hetero/isodisomi for de resterende to kromosomer generere yderligere patogenicitet (Niida et al. 2018) enten ved at reducere sygdomsfremkaldende varianter, der er til stede i moderen i heterozygot tilstand, til homozygot tilstand, eller på grund af tilstedeværelsen af præget gene, der kun udtrykkes af den faderlige allel.
Som en sidste overvejelse er det fristende at spekulere i, at valget af, hvilken telomer der er fanget til stabilisering af det ødelagte kromosom, måske ikke er tilfældigt, men påvirket af dereguleringen af de oprindelige TAD’er (Topologically Associated Domains), hvilket igen skaber et gunstigt substrat for specifikke inter-kromosomale kontakter og rumlig 3D-kromatinkompartmentalisering (Dekker og Mirny et al. 2016).