Celledyrkning omfatter grundlæggende fordeling af celler i et kunstigt miljø (in vitro), som består af de nødvendige næringsstoffer, den ideelle temperatur, gasser, pH-værdi og fugtighed for at give cellerne mulighed for at vokse og formere sig.

• In vivo – Når undersøgelsen omfatter levende biologiske enheder i organismen.

• In vitro – Når undersøgelsen gennemføres ved hjælp af biologiske enheder (celler, væv osv.), der er blevet isoleret fra deres naturlige biologiske miljø. F.eks. væv eller celler, der er isoleret fra leveren eller nyren.

Hvor stykker af væv kan sættes i en passende kultur for at producere celler, der derefter kan anvendes til dyrkning (eksplosivkultur), kan celler fra væv (blødt væv) opnås ved hjælp af enzymatiske reaktioner. Sådanne enzymer som trypsin og proname anvendes til at nedbryde vævet og frigøre de ønskede celler.

Når celler er blevet udvundet direkte fra organismen/dyrets væv (eller endog plantevæv) ved hjælp af enzymatiske eller mekaniske teknikker, betegnes sådanne celler som primære celler. Celler, der fortsætter med at formere sig på ubestemt tid (efter den første subkultur) under særlige betingelser, kaldes cellelinjer.

Disse særlige celler er normalt blevet passeret i lang tid, hvilket får dem til at erhverve homogene (lignende) genotypiske og fænotypiske egenskaber.

Morfologi

Baseret på deres udseende kan celler i kultur kategoriseres i tre hovedgrupper:

• Fibroblastisk – Dette omfatter celler, der har en tendens til at være bipolære/multipolære med langstrakte former. Disse celler er knyttet til substratet, mens de vokser.

• Epithelial – Epithellignende celler opnår en polygonal form med regelmæssige dimensioner. Selv om de har tendens til at vokse i diskrete pletter, vokser disse celler også fast til substratet.

• Lymphoblast – Disse celler er sædvanligvis kugleformede og fastgør sig ikke til substratets overflade. Derfor dyrkes de i suspension.

* Til faste plader anvendes størkningsmidler (f.eks. agar), hvor det flydende medie anvendes sammen med agar.

Betydning af cellekultur

Cellekultur er en vigtig teknik inden for både cellulær- og molekylærbiologi, da den giver den bedste platform til undersøgelse af cellers normale fysiologi og biokemi. En celle er den grundlæggende strukturelle, funktionelle og biologiske enhed i alle levende væsener.

For at forstå en organisme eller et givet væv er det vigtigt at forstå, hvordan dens celler fungerer. Ved hjælp af cellekultur bliver dette muligt, især fordi de primære celler ligner de oprindelige celler fra organismen/vævet.

Hvad man end lærer om cellerne in vitro, er repræsentativt for det, der sker med organismen/vævet. Dette gør cellekultur meget vigtig for udvikling af vacciner, screening (lægemidler osv.) og diagnosticering af givne sygdomme/tilstande.

Da forskellige celletyper kræver forskellige miljøer til formering, er der forskellige typer medier, der anvendes til dyrkning, f.eks. serumfrie medier og serumholdige medier m.m.

Når de rette forudsætninger er tilvejebragt, vil cellerne vokse i antal og kan danne kolonier, som så let kan ses og identificeres.Alt dette kræver dog, at man forstår formålet med proceduren.

Hvis man har en god forståelse af, hvad proceduren skal opnå, bliver det lettere at forberede kulturen med de rette komponenter. Ved at forstå, hvad proceduren har til formål, vil forskeren vide, om han/hun skal forberede et selektivt medie (som tillader bestemte celler at vokse) eller et differentielt medie (som tillader forskellige typer af celler at vokse).

Primær cellekultur

Cellekultur er en proces, hvor celler (dyre- eller planteceller) fjernes fra organismen og indføres i et kunstigt miljø med gunstige vækstbetingelser. Dette giver forskerne mulighed for at studere og lære mere om cellerne.

Der findes tre hovedtyper af cellekultur, som omfatter:

• Primær cellekultur
• Sekundær cellekultur, og
• Cellelinje

Her skal vi fokusere på primær cellekultur.

Der findes to typer primære celler:

Adherente celler – også kaldet forankringsafhængige celler, er den type celler, der kræver fasthæftning for at vokse. Adherente celler er ubevægelige, og de fås f.eks. fra organer som nyrer.

Suspensionsceller – Det er den type celler, der ikke kræver tilknytning for at vokse. De betegnes derfor også som forankringsuafhængige celler og omfatter celler som f.eks. lymfocytter, der findes i blodsystemet.

I primær cellekultur introduceres celler fra sådanne modervæv (levende væv) som lever og nyre i passende medier til vækst. Når cellerne er fremstillet, kan de enten dyrkes som eksplantater, som suspension eller som monolag.

* Ved primær cellekultur skal cellerne være fremstillet af det forældede/levende væv. Det vil sige, at de ikke stammer fra en anden dyrkningsproces.

Hvor cellerne dyrkes, underkastes de først enzymatisk behandling med henblik på dissociation. Det skal dog kun ske i et minimalt tidsrum for at undgå at beskadige eller dræbe cellerne. Når der er opnået enkeltceller, dyrkes de derefter på passende vis i medier, så de kan vokse (dele sig) og nå det ønskede antal.

I første omgang er kulturen ofte heterogen, idet den er sammensat af forskellige typer celler fra vævet.Selv om dette kan opretholdes gennem in vitro-processen (i en kultur i et egnet medie), vil det kun være i en begrænset periode.

Gennem transformationsprocessen kan de primære celler anvendes i en lang periode, hvorved kulturen ændres med tiden. Disse celler betegnes som kontinuerlige cellelinjer.

Primære celler foretrækkes dog typisk frem for kontinuerlige cellelinjer, fordi de (fysiologisk set) minder mere om invivoceller (celler fra det levende væv). Desuden kan kontinuerlige cellelinjer undergå visse ændringer (fænotypiske og genotypiske ændringer), hvilket vil medføre uoverensstemmelser under analysen. Som sådan kan de ikke anvendes til at bestemme, hvad der sker med in vivo-cellerne. Det er derfor, at primære celler foretrækkes.

Da de primære celler i høj grad ligner cellerne fra levende væv, er de vigtige til forskningsformål, idet de kan anvendes til at studere deres funktioner, metaboliske reguleringer, cellefysiologi, udvikling, defekter og forhold, der påvirker det pågældende væv.

Også anvendes de bl.a. til fremstilling af vacciner, screening af genteknologiske lægemidler, toksicitetstest og prænatal diagnose.

Cellekulturmedier

I cellekulturteknikker fjernes celler (eller væv)fra en plante eller et dyr og indføres i et nyt, kunstigt miljø, der kan understøtte deres spredning (overlevelse og vækst).

Nogle af de krav, som et sådant miljø stiller til cellernes formering, er bl.a:

• Et substrat (næringskilde)
• Ideal temperaturområde (kontrolleret)
• Vækstmedium og
• Ideal pH-værdi blandt andet

Her, vil vi fokusere på mediet (cellekulturmediet)

Og selv om der findes forskellige typer af kulturmedier (til forskellige celletyper), består de typisk af:

• Glukose
• Aminosyrer
• Vitaminer
• Uorganiske salte
• Tilhæftningsfaktorer osv.

Der findes to hovedtyper af dyrkningsmedier.Disse omfatter:

Naturlige medier – Naturlige dyrkningsmedier består af biologiske væsker, der er naturligt forekommende. Selv om denne type medie kan anvendes til en række celler, er dets største ulempe, at det kan mangle de nøjagtige komponenter, som bestemte celler har brug for, hvilket i høj grad kan påvirke reproducerbarheden.

Kunstmedier – Kunstige medier, også kaldet syntetiske medier, henviser til den type medie, der er fremstillet ved at tilsætte næringsstoffer som vitaminer, gasser (ilt og kuldioxid) og protein. Disse organiske og uorganiske næringsstoffer tilsættes for at opfylde bestemte cellers specifikke behov og dermed skabe det ideelle miljø for deres vækst.

Som sådan kan de anvendes til en række formål, herunder:

• Sørge for cellernes umiddelbare overlevelse
• Gøre det muligt at forlænge cellernes overlevelse
• Gøre det muligt for cellernes vækst på ubestemt tid
• Sørge for specialiserede funktioner

På den anden side kan dyrkning kategoriseres som:

Selektivt medie – Dette er en særlig type medie, som kun tillader visse celler at vokse. F.eks. kan blodagar (der anvendes til at isolere Streptococcus & Moraxella-arter) forvandles til et selektivt medie ved at tilsætte antibiotika.

Differentielle medier – Denne type medier tillader forskellige typer celler/mikroorganismer at vokse afhængigt af deres metabolisme.

Som nævnt ovenfor fremstilles forskellige typer syntetiske medier på en sådan måde, at de giver et ideelt spredningsmiljø for bestemte celler. Derfor kan syntetiske medier opdeles i fire hovedkategorier.

Disse omfatter:

Serumholdige medier – I disse typer medier anvendes serum (føtalt kvægserum) som bærestof for bl.a. næringsstoffer og vækstfaktorer, der har tendens til at være uopløselige i vand.

Serumfri medier – Disse typer medier fremstilles typisk med henblik på at understøtte en enkelt celletype af kulturer og tilvejebringer derfor specifikke næringsstoffer og andre faktorer, der kræves af celletypen. I disse medier er serum ikke til stede, da det har visse ulemper og kan resultere i fejlfortolkning af immunologiske resultater.

Kemisk definerede medier – Som navnet antyder, består denne type medier af forureningsfrie, rene organiske og uorganiske ingredienser. Bestanddelene i denne type medier produceres typisk ved hjælp af genteknologi i bakterier/gær.

Proteinfrie medier – Proteinfrie medier er typisk uden nogen form for protein. Det anvendes i vid udstrækning til at fremme bedre vækst af cellerne samt proteinekspression ud over at gøre det lettere at rense et eventuelt udtrykt produkt.

Nogle af de vigtigste komponenter i cellekulturmedier omfatter:

• Næringsstoffer – tilvejebragt ved hjælp af peptider og aminosyrer, som er byggestenene i proteiner
• Kulhydrater til energi
• Væsentlige mineraler som f.eks. calcium, magnesium, fosfater og jern, bl.a. buffermidler som acetater til stabilisering af kulturmediet
• Vitaminer
• PH-ændringsindikatorer som f.eks. phenolrød

Cellekulturmedier anvendes til spredning af celler, som derefter kan identificeres og studeres. Som sådan kan det anvendes til forskellige formål, herunder til uddannelse, diagnose og behandling af en sygdom blandt andet.

Cellesuspension

I kulturmetoder henviser cellesuspension til en dyrkningstype, hvor celler er suspenderet i et flydende medium.

For at opnå enkelte celler anbringes en sprød callus (lille væv, der let falder fra hinanden) i et omrørt flydende medium (omrøring giver mulighed for udveksling af gasser i modsætning til et fast medium), hvorved det splittes op. Dette giver mulighed for at frigøre de enkelte celler, som derefter overføres til et andet frisk medium.

Celle-suspensionskulturer har en stor fordel i forhold til stationære kulturer, da de giver mulighed for at bade cellerne ensartet. Da mediet har tendens til at blive omrystet, giver det desuden mulighed for at belufte mediet og tilføre cellerne gasser. Da mediet er en suspension, bliver det også let at manipulere kulturens indhold.

Som enhver anden kultur skal suspensionscellekultur foregå under kontrollerede forhold, hvilket giver cellerne et ideelt miljø til at formere sig. Når de når omkring 80 procent konfluens, er det tid til at subkulturere for at sikre fortsat korrekt vækst.

* 80 procent konfluens henviser til den tilstand, hvor80 procent af kulturoverfladen er dækket af de voksende celler.

I nogle tilfælde kan cellerne i suspension klæbe fast til kulturkolbens plastikoverflade eller endda danne klumper. I sådanne tilfælde kan man bruge en pipette til at samle disse celler og fjerne dem på kolbens overflade og dermed væk fra plastoverfladen. Dette hjælper med at opnå enkeltceller, da de ikke klæber til plastoverfladen.

Røde blodcellesuspension

• (til venstre: uden hæmolyse) Suspension af røde blodceller (0,5 % fåre-RBC’er i saltvand), virker rød og uigennemsigtig.
• (i midten: uden hæmolyse) RBC’er sedimenterede spontant i 60 minutter. Bemærk, at supernatanten ikke er farvet.
• (til højre: hæmolyse) RBC-suspension behandlet med hæmolysin af S. pyogenes ved 37C i 30 min, bliver gennemsigtig ved hæmolyse.

Se mere om røde blodlegemer

Tælling af celler

Tælling af antallet af celler i en opslæmning eren proces, der involverer brug af en farvestof. Når der f.eks. anvendes trypanblåt, trænger det ind i de døde cellers cellemembran, men ikke i de levendecellers cellemembran.

Cellerne uddrives derefter forsigtigt i et hæmocytometer (indeholder tællekammeret) under dækglasset og observeres i et mikroskop. Cellerne tælles derefter inden for et givet antal felter til beregninger.

Betydning

Denne metode foretrækkes i vid udstrækning, fordi den gør det muligt at suspendere cellerne i en opløsning i stedet for at holde dem i et fast medie. Her bliver det derfor lettere at manipulere indholdet, hvorved det forhindres, at de danner klynger. Med cellesuspensioner er det også lettere at observere de enkelte celler under mikroskopet.

I dette tilfælde er det ikke kun muligt at studere cellernes struktur, men også at se, hvor godt de har differentieret sig. Døde og levende celler kan ses under mikroskopet.

Cell Culture Protocol

Cellkulturprotokoller skal sikre, at kulturprocedurerne udføres efter de krævede standarder. Dette skal ikke kun forhindre forurening af cellerne, men også sikre, at forskerne selv er beskyttet mod enhver form for forurening.

Det forventes desuden, at arbejdets art er i overensstemmelse med de relevante etiske retningslinjer. Derfor er det først og fremmest vigtigt at sikre, at hele proceduren er i overensstemmelse med både de medicinsk-etiske retningslinjer og de dyreforsøgsretningslinjer. Dette skyldes, at overtrædelse af denne lovgivning og disse retningslinjer kan medføre strenge straffe og endog lukning af laboratoriet.

Før arbejdet påbegyndes, skal følgende procedure gennemføres:

• Sørg for, at arbejdsområdet er desinficeret (ved hjælp af 70 % ethanol)
• Brug altid et par nye handsker. Hvis et par handsker skal bruges til en anden cellekulturprocedure, skal de desinficeres med 70 procent ethanol og lufttørres.
• Alt udstyr, der var blevet taget ud af skabet, skal også desinficeres for at forhindre forurening
• Sådan udstyr som pipetter, glaskrukker og plast, der skal bruges til proceduren, skal autoklaveres

Og selv om der findes et bredt udvalg af kulturmedier til celler, er det vigtigt at huske på, at cellekulturer, især primære cellekulturer, let kan blive kontamineret og desuden risikerer at indeholde uopdagede vira. Derfor bør alt materiale behandles som potentielt smitsomt for at undgå infektioner.

Dertil kommer, at arbejdet med cellekulturer af sikkerhedshensyn bør udføres i en passende laminarflowhætte, hvor luften ledes væk fra forskeren.

Protokoller for forberedelse af cellekulturer

Kontroller altid oplysningerne på beholderen for at sikre, at mediet er egnet til den celle, der skal dyrkes,

når det er forberedt, skal cellekulturen holdes under det anbefalede temperaturområde,

Overvåg kulturen hver 30- 48 time, og kontrollér for konfluens (når cellerne dækker kulturens overflade fuldstændigt) – Dette afhænger dog i høj grad af celletypen.

Når proceduren er afsluttet, og cellerne er blevet analyseret, bør kulturen kasseres på passende vis. Her er det vigtigt at udvise stor forsigtighed, da cellerne på dette tidspunkt allerede er blevet formeret og øget i antal. Desuden er der store chancer for, at prøven er blevet kontamineret, hvilket øger risikoen for at forårsage infektioner hos forskeren, hvis den ikke håndteres korrekt.

Bortskaffelse

• For sådanne genstande som skalpeller,glasobjektsglas og dækglasblade blandt andet kan de-kontaminering indebære autoklavering ved 121 grader Celsius og 15 psi (tryk) i mindst 30minutter. Hvis de imidlertid skal kasseres, er det vigtigt, at de lægges i en plastikpose og i en passende beholder til senere forbrænding.
• Med flydende affald er kemisk desinfektion en af de bedste metoder til aktivering af affaldsproduktet. Kemikalier som f.eks. blegemiddel kan anvendes til dette formål, inden væsken hældes ned i vaskebækkenet.
• Fra fast affald samles det i en plastikpose med henblik på forbrænding. På den anden side kan de først autoklaveres, inden de forbrændes.

Konklusion

Generelt indebærer cellekultur, uanset om det drejer sig om anvendelse af en suspension eller et stationært medie, vækst af celler i et kunstigt miljø med gunstige betingelser. Selv om enzymatisk virkning kan anvendes til at opnå celler til dyrkning, er det den mekaniske opløsningsmetode, der foretrækkes mest, da den giver en enklere og mindre traumatisk måde at opnå celler på.

Denne metode indebærer simpelthen, at et væv skæres i mindre stykker, hvorfra de udløbne celler derefter opsamles. Der kan også anvendes primær eksplantatteknik til at udtage cellerne. Denne metode er dog mest nyttig til opdeling af mindre vævsmængder.

Selv om alle celler kan anvendes i kulturer for at observere deres adfærd, foretrækkes embryonale væv (for primære celler) i forhold til voksne celler, fordi de giver celler, der er mere levedygtige og hurtigt kan formere sig.

Her er det også vigtigt at sikre, at cellerne er af større mængde, da deres overlevelsesrate har tendens til at være lavere i forhold til subkulturerne. I

for at øge kulturernes succes er det også vigtigt at sikre, at skaderne på cellerne minimeres både undercelleindsamling og behandling. Dette er ud over at anvende det passendeemedium til de pågældende celler.

I samme forbindelse kan du tage et kig på typer og teknikker til vævskultur.

Kig på MicroscopeMasters valg af tilbehør til mikroskoper.

Såvel som oplysninger om celledeling, celledifferentiering og cellefarvning og få et indblik i celleteori.

For de mere avancerede og en god læsning er Molecular Biology of the Cell. Samt at lære om cytokemi.

Måske er du studerende, lærer eller hobbyist og ønsker at følge MicroscopeMasters oplysninger om sjove mikroskopeksperimenter.

Se også Mikroskopikultur og følsomhedstest

Vend tilbage fra Cell Culture til Cell Biology Main Page

Vend tilbage fra Cell Culture til MicroscopeMaster Home