3 amylasehæmmere

α-amylase (1,4-α-d-glucan-glucanohydrolase, EC3.2.1.1) er en endoglucanase, der katalyserer hydrolysen af de endo α-(1,4)-glycosidiske bindinger i stivelse og beslægtede polysaccharider. Hydrolysen af stivelse katalyseres først af α-amylase, der findes i menneskets spyt, efterfulgt af pancreatisk amylase i duodenum. Human pancreatisk α-amylase (HPA) er et vigtigt farmakologisk mål for behandling af type 2-diabetes. Udgifterne til HPA er imidlertid relativt høje til forskningsformål. I stedet anvendes α-amylase fra svinepankreas (PPA) til in vitro-måling af fordøjelsen. PPA består af 496 aminosyrerester og viser 83 % identitet med sin menneskelige modpart HPA (Pasero, Mazzéi-Pierron, Abadie, Chicheportiche, & Marchis-Mouren, 1986). PPA er en endo-type amylase, og den katalyserer hydrolysen af interne α-(1,4)-glykosidbindinger i amylose og amylopectin gennem flere angreb mod den ikke-reducerende ende (Robyt & French, 1970). Hydrolyseprodukterne fra pancreatisk α-amylase fra svin er hovedsageligt maltose, maltotriose og maltotetraose (Yook & Robyt, 2002). PPA har to isomerer PPA isozyme-I (PPA-I) og PPA-II, som har samme molekylvægt, men adskiller sig en smule i aminosyresammensætning og isoelektrisk punkt (Pasero et al., 1986).

Naturligt forekommende α-amylasehæmmere omfatter proteinbaserede og sekundære metabolitter. Førstnævnte er ikke omfattet af denne artikel, fordi de har en tendens til at denaturere ved termisk eller sur (mavesyre) behandling og mister deres aktivitet, når de når tyndtarmen. Heri opsummerer vi den seneste litteratur om α-amylasehæmmere. De metoder, der er anvendt til måling af deres hæmningsaktivitet, er også anført, fordi forskellige metoder kan resultere i forskellige IC50-værdier. I sammenligning med α-glucosidase findes der færre rapporter om α-amylase, og de fleste af undersøgelserne er om polyfenoler.

Isookanin (57) (Fig. 3.8) isoleret fra spanske nåle, Bidens bipinnata, blev vist moderat hæmningsaktivitet på HPA (IC50 på 0,447 mg/mL eller 156 μM) målt ved hjælp af iodometrisk assay (Yang et al., 2012). Det skal bemærkes, at isookanin indeholder to catecholiske enheder, og derfor forventes det at være et godt reduktant, som kan reducere jod, hvilket kan forårsage falsk positive resultater.

Figur 3.8. Kemiske strukturer for amylasehæmmere, forbindelser 57-59, 5-caffeoylkinesyre og 4,5-dicaffeoylkinesyre.

Fra bladet af vandansøgning (Syzygium aqueum) blad, myricetin-3-O-rhamnosid (9) og europetin-3-O-rhamnosid (10) (fig. 3.2) blev isoleret, og hæmningsaktiviteten på α-amylasehæmning blev målt ved hjælp af DNSA-assay for at være 10 gange (EC50 på ~ 2,0 μM) stærkere end acarbose (EC50 på 19 μM). En så høj aktivitet er ret sjældent set i polyfenolforbindelser og berettiger til yderligere undersøgelser, især af hæmningsmekanismen og selektiviteten, når disse forbindelser udfordres med komplekse fødevarematrixer. Myricetin er en stærk radikalfanger, og derfor er stabiliteten af 9 og 10 også et problem. Forfatterne rapporterede, at quercetin havde en EC50 (17 μM), der var sammenlignelig med acarbose (19 μM). Ved hjælp af den turbiditetsassay, som vi udviklede i vores laboratorium, kunne vi ikke påvise nogen hæmningsaktivitet af quercetin mod pancreatisk α-amylase ved hjælp af acarbose som referencestandard (Huang et al., upublicerede resultater). Det skal derfor verificeres, om den rapporterede EC50 er metodeafhængig for at udelukke potentielle artefakter (Manaharan et al., 2012). Cleistocalyx operculatus hører også til Myrtaceae-familien. Hu, Luo, Li, Joshi og Lu (2012) isolerede og rensede 2′4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′5′-dimethylchalcone (DMC) fra de tørrede blomsterknopper af C. operculatus. Forbindelsen viste en ikke-kompetitiv hæmmende mekanisme over for PPA (Hu et al., 2012).

Tilirosid (58) (Fig. 3.8), isoleret fra frøene af hunderose, Rosa canina L., hæmmer PPA med IC50 på 280 mM, og kinetisk undersøgelse viser, at det er en ikke-kompetitiv inhibitor med Ki værdier på 84,2 μM kvantificeret ved hjælp af p-nitrophenyl-alpha-d-pentaglucosid som et substrat. I modsætning til acarbose viser tilirosid ingen hæmningsaktivitet over for α-glucosidase. Måske på grund af dets svage α-amylasehæmmende aktivitet i dyremodellen er det nødvendigt med en høj dosering tilirosid (600 mg/kg) for at reducere den postprandiale plasmaglukosekoncentration hos mus, der behandles med stivelse på 2 g/kg. Tilirosid kan udvise antihyperglykæmi gennem hæmning af både natriumafhængig glukosetransportør 1 og glukosetransportør 2 medieret glukoseoptagelse i enterocytter (Goto et al., 2012).

Curcumin og dets derivater er blevet foreslået som multitargetingforbindelser, der har en meget bred vifte af sundhedsmæssige fordele. Som et potentielt middel til afbødning af stivelsesfordøjelseshastighederne har bisdemethoxycurcumin (59) (Fig. 3.8) fra rhizomet af Curcuma longa HPA- og PPA-hæmmende aktivitet med IC50-værdier på ca. 25 μM ved hjælp af DNSA-assay. Kinetisk undersøgelse viser, at det er en ukompetitiv hæmmer af HPA med en tilsyneladende Ki på 3,0 μM (Ponnusamy et al., 2012).

Mono- og disubstituerede caffeoylquininsyrer er de vigtigste polyphenolforbindelser, der findes i grønne kaffebønner. På grund af tilstedeværelsen af tre sekundære hydroxylgrupper i quininsyreringen findes der tre interkonverterende positionsisomerer af monosubstituerede caffeoylquininsyrer og tre dicaffeoylquininsyrer, som alle blev oprenset fra grønne kaffebønner. Deres hæmningsaktivitet på PPA-I (Narita & Inouye, 2011) blev målt ved hjælp af p-nitrophenyl-diglucosid, som ved hydrolyse producerer p-nitrophenol og maltose. Det er bemærkelsesværdigt, at den hæmmende aktivitet er stærkt afhængig af placeringen af caffeoylgrupper i monocaffeoylkinesyre. 5-caffeoylkinesyre (eller almindeligvis kendt som chlorogensyre) (fig. 3.8) har den højeste inhiberende aktivitet med en IC50 på 80 μM sammenlignet med 4-caffeoylkinesyre (120 μM) og 3-caffeoylkinesyre (230 μM). For de tre dicaffeoylkinesyreisomerer er den hæmmende aktivitet meget højere og er ikke så følsomme over for estergruppernes position, fordi 3,4- og 4,5-dicaffeoylkinesyre (fig. 3.8) har de samme IC50-værdier (20 mM), og 4,5-dicaffeoylkinesyre har en IC50 på 30 μM (Narita & Inouye, 2011).