Esencialmente, el cultivo celular implica la distribución de las células en un entorno artificial (in vitro) que está compuesto por los nutrientes necesarios, la temperatura ideal, los gases, el pH y la humedad para permitir que las células crezcan y proliferen.

• In vivo – Cuando el estudio implica entidades biológicas vivas dentro del organismo.

• In vitro – Cuando el estudio se realiza utilizando entidades biológicas (células, tejidos, etc.) que han sido aisladas de su entorno biológico natural. Por ejemplo, tejido o células aisladas del hígado o del riñón.

Mientras que los trozos de tejido pueden colocarse en el cultivo apropiado para producir células que luego pueden utilizarse para el cultivo (cultivo explicativo), las células de los tejidos (tejidos blandos) pueden obtenerse mediante reacciones enzimáticas. Se utilizan enzimas como la tripsina y el proname para descomponer el tejido y liberar las células deseadas.

Cuando las células se han obtenido directamente del organismo/tejido animal (o incluso del tejido vegetal) mediante técnicas enzimáticas o mecánicas, dichas células se denominan células primarias. Sin embargo, las células que continúan proliferando indefinidamente (tras el primer subcultivo) en condiciones especiales se denominan líneas celulares.

Estas células concretas suelen haber sido pasadas durante un largo periodo de tiempo, lo que hace que adquieran rasgos genotípicos y fenotípicos homogéneos (similares).

Morfología

En función de su aspecto, las células en cultivo pueden clasificarse en tres grupos principales:

• Fibroblásticas: incluye células que tienden a ser bipolares/multipolares con formas alargadas. Estas células se adhieren al sustrato a medida que crecen.

• Epiteliales – Las células epiteliales alcanzan una forma poligonal con dimensiones regulares. Aunque tienden a crecer en parches discretos, estas células también crecen adheridas al sustrato.

• Linfoblasto – Estas células suelen tener forma esférica y no se adhieren a la superficie del sustrato. En consecuencia, se cultivan en suspensión.

* Para las placas sólidas, se utilizan agentes solidificantes (como el agar) cuando el medio líquido se utiliza con agar.

Significado del cultivo celular

El cultivo celular es una técnica importante tanto en la biología celular como en la molecular, ya que proporciona la mejor plataforma para estudiar la fisiología y la bioquímica normales de las células. Una célula es la unidad estructural, funcional y biológica básica de todos los seres vivos.

Para entender un organismo o unos tejidos determinados, es importante comprender cómo funcionan sus células. Esto es posible gracias a los cultivos celulares, sobre todo porque las células primarias se parecen a las células parentales del organismo/tejido.

Lo que se aprende sobre las células in vitro es representativo de lo que ocurre en el organismo/tejido. Esto hace que el cultivo de células sea muy importante para el desarrollo de vacunas, la selección (de fármacos, etc.) y el diagnóstico de determinadas enfermedades/condiciones.

Dado que los diferentes tipos de células requieren diferentes entornos para la proliferación, existen diferentes tipos de medios utilizados para el cultivo, como los medios sin suero y los que contienen suero, entre otros.

Una vez que se han proporcionado los requisitos adecuados, las células aumentarán en número y pueden formar colonias, que pueden verse e identificarse fácilmente.Sin embargo, todo esto requiere que se comprenda el objetivo del procedimiento.

Al comprender bien lo que se pretende conseguir con el procedimiento, resulta más fácil preparar el cultivo con los componentes adecuados. Al comprender el objetivo del procedimiento, el investigador sabrá si debe preparar un medio selectivo (que permita el crecimiento de células específicas) o un medio diferencial (que permita el crecimiento de diferentes tipos de células).

Cultivo celular primario

El cultivo celular es un proceso en el que las células (animales o vegetales) se extraen del organismo y se introducen en un entorno artificial con condiciones favorables para su crecimiento. Esto permite a los investigadores estudiar y aprender más sobre las células.

Hay tres tipos principales de cultivo celular, que incluyen:

• Cultivo celular primario
• Cultivo celular secundario, y
• Línea celular

Aquí, nos centraremos en el cultivo celular primario.

Hay dos tipos de células primarias:

Células adherentes – También denominadas células dependientes de anclaje, son el tipo de células que requieren sujeción para crecer. Las células adherentes son inmóviles, y se obtienen de órganos como el riñón.

Células en suspensión – Son el tipo de células que no requieren fijación para crecer. Por lo tanto, también se denominan células independientes del anclaje, e incluyen células como los linfocitos que se encuentran en el sistema sanguíneo.

En el cultivo celular primario, las células obtenidas de tejidos parentales (tejidos vivos) como el hígado y el riñón, se introducen en medios adecuados para su crecimiento. Una vez obtenidas las células, se pueden cultivar como cultivo de explantes, en suspensión o en monocapa.

* En el cultivo celular primario, las células deben haberse obtenido del tejido parental/vivo. Es decir, no proceden de otro proceso de cultivo.

Antes de cultivar las células, éstas se someten primero a un tratamiento enzimático de disociación. Sin embargo, tiene que ser por una cantidad mínima de tiempo para evitar dañar o matar las células. Una vez que se obtienen las células individuales, se cultivan adecuadamente en medios que les permitan crecer (dividirse) y alcanzar el número deseado.

Inicialmente, el cultivo tiende a ser heterogéneo, ya que está compuesto por diferentes tipos de células obtenidas del tejido.Aunque esto se puede mantener a través del proceso in vitro (en un cultivo en un medio adecuado) esto sólo sería por un período de tiempo limitado.

A través del proceso de transformación, las células primarias pueden ser utilizadas por un largo período de tiempo, cambiando el cultivo con el tiempo. Estas células se denominan líneas celulares continuas.

Sin embargo, normalmente se prefieren las células primarias a las líneas celulares continuas por el hecho de que son más similares (fisiológicamente) a las células invivo (células del tejido vivo). Además, las líneas celulares continuas pueden sufrir ciertos cambios (cambios fenotípicos y genotípicos) que darían lugar a discrepancias durante el análisis. Por ello, no pueden utilizarse para determinar lo que ocurre con las células in vivo. Por esta razón se prefieren las células primarias.

Dado que las células primarias se asemejan significativamente a las células obtenidas del tejido vivo, son importantes para los fines de la investigación, ya que pueden utilizarse para estudiar sus funciones, las regulaciones metabólicas, la fisiología celular, el desarrollo, los defectos y las condiciones que afectan al tejido de interés.

También se utilizan para fines tales como la producción de vacunas, el cribado de fármacos mediante ingeniería genética, así como las pruebas de toxicidad y el diagnóstico prenatal, entre otros.

Medios de cultivo celular

En las técnicas de cultivo celular, las células (o tejidos) se extraen de una planta o un animal y se introducen en un nuevo entorno artificial que puede favorecer su proliferación (supervivencia y crecimiento).

Algunos de los requisitos de dicho entorno para la proliferación de las células incluyen:

• Un sustrato (fuente denutrición)
• Gama de temperatura adecuada(controlada)
• Medio de crecimiento, y
• PH adecuado entre otros

Aquí, nos centraremos en el medio (medio de cultivo celular)

Aunque hay diferentes tipos de medios de cultivo (para diferentes tipos de células) suelen estar compuestos por:

• Glucosa
• Aminoácidos
• Vitaminas
• Sales inorgánicas
• Factores de fijación Etc.

Hay dos tipos principales de medios de cultivo:

Medios naturales – Los medios de cultivo naturales están compuestos por fluidos biológicos que se producen de forma natural. Aunque este tipo de medio puede utilizarse para una serie de células, su mayor desventaja es que puede carecer de los componentes exactos que requieren las células, lo que puede afectar en gran medida a la reproducibilidad.

Medios artificiales – También denominados medios sintéticos, los medios artificiales se refieren al tipo de medio que se produce añadiendo nutrientes como vitaminas, gases (oxígeno y dióxido de carbono) y proteínas, entre otros. Estos nutrientes orgánicos e inorgánicos se añaden para satisfacer las necesidades específicas de determinadas células y proporcionar así el entorno ideal para su crecimiento.

Como tal, pueden ser utilizados para un número de propósitos incluyendo:

• Proporcionar la supervivencia inmediata de las células
• Permitir la supervivencia prolongada de las células
• Permitir el crecimiento indefinido de las células
• Proporcionar funciones especializadas

Por otra parte, el cultivo puede clasificarse como:

Medios selectivos- Se trata de un tipo especial de medio que sólo permite el crecimiento de determinadas células. Por ejemplo, el agar sangre (utilizado para aislar especies de Streptococcus & Moraxella) puede convertirse en un medio selectivo mediante la adición de antibióticos.

Medios diferenciales- Este tipo de medios permite el crecimiento de diferentes tipos de células/microorganismos en función de su metabolismo.

Como se ha mencionado anteriormente, los diferentes tipos de medios sintéticos se preparan de manera que proporcionen el entorno de proliferación ideal para determinadas células. Por esta razón, los medios sintéticos pueden dividirse en cuatro categorías principales.

Estos incluyen:

Medios que contienen suero – En estos tipos de medios, el suero (suero bovino fetal) se utiliza como portador de nutrientes y factores de crecimiento entre otros que tienden a ser insolubles en agua.

Medios sin suero – Estos tipos de medios se producen normalmente con el fin de apoyar el cultivo de un solo tipo de célula y proporcionan nutrientes específicos y otros factores requeridos por el tipo de célula. En estos medios, el suero está ausente porque presenta algunas desventajas y puede dar lugar a una interpretación errónea de los resultados inmunológicos.

Medios químicamente definidos – Como su nombre indica, este tipo de medios está compuesto por ingredientes orgánicos e inorgánicos puros libres de contaminación. Los componentes de este tipo de medios suelen producirse mediante ingeniería genética en bacterias/levaduras.

Medios sin proteínas – Los medios sin proteínas suelen carecer de cualquier tipo de proteína. Se utilizan en gran medida para promover el crecimiento superior de las células, así como la expresión de proteínas, además de facilitar la purificación de cualquier producto expresado.

Algunos de los principales componentes de los medios de cultivo celular incluyen:

• Nutrientes – proporcionados por péptidos y aminoácidos, que son los bloques de construcción de las proteínas
• Carbohidratos para la energía
• Minerales esenciales como calcio, magnesio, fosfatos y hierro, entre otros, agentes amortiguadores como los acetatos para estabilizar el medio de cultivo
• Vitaminas
• Indicadores de cambio de pH como el rojo de fenol

Los medios de cultivo celular se utilizan para la proliferación de las células, que luego pueden ser identificadas y estudiadas. Como tal, se puede utilizar para varios propósitos, incluyendo la educación, el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad, entre otros.

Suspensión celular

En los métodos de cultivo, la suspensión celular se refiere a un tipo de cultivo en el que las células están suspendidas en un medio líquido.

Para obtener células individuales, se pone un callo friable (tejido pequeño que se deshace fácilmente) en un medio líquido agitado (la agitación permite el intercambio gaseoso a diferencia del medio sólido), rompiéndolo. Esto permite que se liberen células individuales, que luego se transfieren a otro medio fresco.

Los cultivos en suspensión de células tienen una gran ventaja sobre los estacionarios, ya que permite que las células se bañen uniformemente. Además, dado que el medio tiende a agitarse, permite la aireación del medio, proporcionando gases a las células. Dado que el medio es una suspensión, también resulta fácil manipular el contenido del cultivo.

Como cualquier otro cultivo, el cultivo de células en suspensión tiene que estar bajo condiciones controladas, proporcionando a las células un entorno ideal para proliferar. Una vez que alcanzan aproximadamente el 80 por ciento de confluencia, es el momento de subcultivar para garantizar un crecimiento adecuado continuado.

* El 80 por ciento de confluencia se refiere al estado en el que el 80 por ciento de la superficie del cultivo está cubierta por las células en crecimiento.

En algunos casos, las células en suspensión pueden adherirse a la superficie de plástico del matraz de cultivo o incluso formar grupos. En estos casos, se puede utilizar una pipeta para recoger estas células y expulsarlas a la superficie del matraz y, por tanto, lejos de la superficie de plástico. Esto ayuda a obtener células individuales dado que no se adhieren a la superficie de plástico.

Suspensión de glóbulos rojos

• (izquierda: sin hemólisis) suspensión de glóbulos rojos (0,5% de glóbulos rojos de oveja en solución salina), parece roja y opaca.
• (centro: sin hemólisis) Los glóbulos rojos sedimentaron espontáneamente durante 60 minutos. Obsérvese que el sobrenadante no está coloreado.
• (derecha: hemólisis) Suspensión de glóbulos rojos tratada con la hemolisina de S. pyogenes a 37C durante 30 min, se vuelve transparente por hemólisis.

Ver más sobre los glóbulos rojos

Contar las células

Contar el número de células en una suspensión es un proceso que implica el uso de una tinción. Por ejemplo, cuando se utiliza el azul tripán, éste penetra en la membrana celular de las células muertas, pero no en la de las células vivas.

Las células se expulsan suavemente a un hemocitómetro (que contiene la cámara de recuento) bajo el cubreobjetos y se observan al microscopio. A continuación, se cuentan las células dentro de un número determinado de cuadrados para los cálculos.

Significado

Este método se prefiere en gran medida debido a que permite suspender las células en una solución en lugar de mantenerlas en un medio sólido. Por lo tanto, aquí es más fácil manipular el contenido, evitando así que se formen grupos. Con las suspensiones celulares, también es más fácil observar células individuales bajo el microscopio.

En este caso, no sólo es posible estudiar la estructura de las células, sino también observar cómo se han diferenciado, viendo las células vivas y muertas bajo el microscopio.

Protocolo de Cultivo Celular

Los protocolos de cultivo celular están pensados para asegurar que los procedimientos de cultivo se llevan a cabo según los estándares requeridos. Esto no sólo pretende evitar la contaminación de las células, sino también garantizar que los propios investigadores estén protegidos de cualquier forma de contaminación.

Además, se espera que la naturaleza del trabajo se ajuste a las directrices éticas adecuadas. Por lo tanto, antes de nada, es esencial asegurarse de que todo el procedimiento se ajusta a las directrices éticas médicas y de experimentación con animales. Esto se debe a que ir en contra de dicha legislación y directrices puede dar lugar a fuertes sanciones e incluso al cierre del laboratorio.

Antes de comenzar cualquier trabajo, lleve a cabo el siguiente procedimiento:

• Asegúrese de que el área de trabajo está desinfectada (utilizando etanol al 70%)
• Utilice siempre un par de guantes nuevos. Si un par de guantes tiene que ser utilizado para otro procedimiento de cultivo celular, deben ser desinfectados utilizando etanol al 70 por ciento y dejar que se sequen al aire.
• También debe desinfectarse todo el equipo que se haya sacado de la cabina para evitar cualquier contaminación
• Tales equipos como la pipeta, los frascos de vidrio y los plásticos que se vayan a utilizar para el procedimiento deben esterilizarse en autoclave

Aunque existe una amplia gama de medios de cultivo para las células, es importante tener en cuenta que los cultivos celulares, y en particular los cultivos celulares primarios, son fácilmente propensos a la contaminación, además del riesgo de contener virus no detectados. Por esta razón, todo el material debe manejarse como potencialmente infeccioso para evitar cualquier infección.

Además, por razones de seguridad, el trabajo con cultivos celulares debe llevarse a cabo en la campana de flujo laminar adecuada, donde el aire se dirige lejos del investigador.

Protocolos para la preparación de cultivos celulares

Compruebe siempre la información del envase para asegurarse de que el medio es apropiado para la célula que se va a cultivar,

Una vez preparado el cultivo celular debe mantenerse en el rango de temperatura recomendado,

Supervise el cultivo cada 30- 48 horas y compruebe la confluencia (cuando las células cubren completamente la superficie del cultivo) – Sin embargo, esto depende en gran medida del tipo de células.

Una vez completado el procedimiento y analizadas las células, el cultivo debe desecharse adecuadamente. Aquí, es importante tener mucha precaución dado que para este momento, las células ya han proliferado y aumentado en número. Además, hay muchas posibilidades de que la muestra se haya contaminado, lo que aumenta los riesgos de causar infecciones al investigador si no se maneja adecuadamente.

Eliminación

• En el caso de elementos como bisturíes, portaobjetos y cubreobjetos, entre otros, la descontaminación puede implicar la esterilización en autoclave a 121 grados centígrados y 15 psi (presión) durante al menos 30 minutos. Sin embargo, si se van a desechar, es importante que se coloquen en una bolsa de plástico y en el contenedor adecuado para su posterior incineración.
• En el caso de los residuos líquidos, la desinfección química es uno de los mejores métodos para desactivar los residuos. Para ello, se pueden utilizar productos químicos como la lejía antes de verter el líquido por el desagüe del fregadero.
• En el caso de los residuos sólidos, se recogen en una bolsa de plástico para su incineración. Por otro lado, se pueden esterilizar en autoclave antes de ser incinerados.

Conclusión

En general, el cultivo celular, ya sea en suspensión o en un medio estacionario, implica el crecimiento de células en un entorno artificial con condiciones favorables. Mientras que la acción enzimática puede utilizarse para obtener células para el cultivo, es el método de desagregación mecánica el que se prefiere dado que proporciona una forma más simple y menos traumática de obtener células.

Este método simplemente implica el corte de un tejido en trozos más pequeños de los cuales se recogen las células derramadas. También se puede utilizar la técnica de los explantes primarios para obtener las células. Sin embargo, este método es útil sobre todo para la disgregación de cantidades más pequeñas de tejido.

Aunque se puede utilizar cualquier célula en cultivos para observar su comportamiento, se prefieren los tejidos embrionarios (para las células primarias) en comparación con las células adultas porque proporcionan células que son más viables y pueden proliferar rápidamente.

Aquí, también es importante asegurarse de que las células son de mayor cantidad dado que su tasa de supervivencia tiende a ser menor en comparación con los subcultivos. I

Para mejorar el éxito de los cultivos, también es importante asegurarse de que se minimiza el daño a las células tanto durante la recogida como el procesamiento de las mismas. Esto se suma a la utilización del medio apropiado para las células en cuestión.

En la misma línea, eche un vistazo a los tipos y técnicas de cultivo de tejidos.

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