HypaCas9 a Cas9-HF1 vykazují pomalé pozorované rychlosti štěpení

Naší kinetickou analýzu jsme zahájili měřením koncentrace aktivního místa enzymu pro každou z variant Cas923,24,25. Měření množství produktu vzniklého při titraci enzymu s rostoucí koncentrací DNA odhalilo koncentrace aktivního místa 31 nM, 26 nM, 23 nM pro SpCas9, HypaCas9 a Cas9-HF1, resp. pro vzorky enzymu s nominální koncentrací 100 nM na základě absorbance při 280 nm (doplňkové obr. 1a-d). Měřili jsme také koncentrace aktivního místa SpCas9 a HiFiCas925 od Integrated DNA Technologies (IDT) a pozorovali jsme podobné koncentrace aktivního enzymu (doplňkový obr. 1e-f). Je důležité poznamenat, že v každém případě se koncentrace DNA potřebná k nasycení signálu rovnala koncentraci vytvořeného produktu, což vylučuje obavy, že by část enzymu mohla vázat DNA, ale nereagovat. Všechny následné experimenty byly nastaveny s použitím koncentrace aktivního enzymu stanovené při titraci aktivního místa.

Pro porovnání kinetiky on- nebo off-target substrátů DNA enzymu SpCas9 s upravenými variantami jsme nejprve zkoumali časový průběh štěpení cílového řetězce (HNH) pro každý enzym (obr. 1 a doplňkový obr. 2). Data byla fitována buď jedno-, nebo dvouexponenciální funkcí pomocí rovnice (1), resp. rovnice (2).

kde Y představuje koncentraci produktu štěpení, A1 představuje amplitudu a λ1 představuje pozorovanou rychlost rozpadu (vlastní číslo)17.

kde Y představuje koncentraci produktu štěpení, A1 představuje amplitudu a λ1 představuje pozorovanou rychlost pro první fázi. A2 představuje amplitudu a λ2 představuje pozorovanou rychlost pro druhou fázi.

Srovnání pozorovaných rychlostí rozpadu štěpení on- a off-target substrátů pomocí SpCas9 ukazuje, že 3 bp PAM-distální neshoda zpomaluje enzym 13krát (z 1 s-1 na 0,076 s-1). Obě vysoce věrné varianty Cas9 dramaticky snižují pozorovanou rychlost rozpadu při štěpení on-target substrátů DNA 21- až 35krát ve srovnání s variantou SpCas9 (0,028 s-1 pro HypaCas9 a 0,047 s-1 pro Cas9-HF1 oproti 1 s-1 pro SpCas9). HypaCas9 a Cas9-HF1 navíc dále snižují rychlost rozpadu při štěpení necílové DNA 8 až 290krát (rychlost 0,0033 s-1 a 0,00016 s-1) ve srovnání s jejich příslušnými rychlostmi s cílovou DNA. Tyto údaje ukazují dramatické změny v pozorovaných rychlostech štěpení upravenými variantami s on- a off-target DNA. Tato měření však sama o sobě nedefinují změny ve specifičnosti, která je funkcí kinetického rozdělení štěpení DNA oproti disociaci, zahrnující všechny kroky vedoucí k prvnímu ireverzibilnímu kroku v dráze17 , včetně reverzibilní vazby DNA, tvorby R-smyčky, dokování HNH domény a štěpení DNA.

Rozmotávání DNA se u variant Cas9 z velké části nemění

Protože naše předchozí práce identifikovala tvorbu R-smyčky jako rychlost limitující pro štěpení na cíli a jiní následně naznačili, že rychlost tvorby R-smyčky a převíjení může diktovat specifitu enzymu pro SpCas9 a Cas9-HF116, testovali jsme, zda HypaCas9 bude vykazovat podobnou kinetiku. K přímému měření rychlosti tvorby R-smyčky pro všechny enzymy jsme použili test se zastaveným průtokem založený na měření fluorescence tCo na -16 nt, fluoreskujícího tricyklického analogu cytosinu, který je zhášen stohováním bází v dsDNA, takže otevření duplexu vede k velkému zvýšení fluorescence. Naše kontrolní experimenty s použitím našich substrátů s analogy bází značených tCo i 2-AP v polohách -16, -9 a -1 nt (doplňkový obr. 3) ukazují, že ani jeden z analogů neovlivňuje pozorovanou rychlost rozpadu při štěpení DNA. Chemické struktury tCo a 2AP jsou mnohem méně objemné než větší značky Cy3 a Cy5 a je méně pravděpodobné, že budou zasahovat do enzymové kinetiky (doplňkový obr. 4). V přítomnosti Mg2+ SpCas9, HypaCas9 a Cas9-HF1 odštěpují cílový substrát DNA s téměř identickou rychlostí rozpadu (~2 s-1) (obr. 2). Překvapivě byla rychlost rozpadu tvorby R-smyčky pro necílové substráty DNA u všech variant Cas9 také téměř stejná (mezi 0,85 s-1 a 2,59 s-1). Odvíjení DNA tedy neomezuje rychlost a na rozdíl od varianty SpCas9 s vysokou věrností nekoreluje s pozorovanou rychlostí štěpení.

R-loop formation decay rates were measured by the monitoring the fluorescence increase from tCo (position -16 in non-target strand) as function of time after mixing enzyme (28 nM) with DNA (10 nM) in the presence of 10 mM Mg2+. Data byla přizpůsobena dvojité exponenciální funkci, aby se získaly uvedené rychlosti rozpadu. a, b SpCas9 (28 nm) s on-target (a) a off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 s on-target (c) a off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 s on-target (e) a off-target (f) DNA.

Vzhledem k umístění tCo na -16 nt je pravděpodobné, že naše měření odrážela pozdní krok v procesu odvíjení. Pro srovnání jsme měřili rychlost rozpadu pro tvorbu R-smyčky pomocí tCo značeného v poloze bezprostředně proximální k PAM (poloha -1 nt). Po rychlém smíchání Cas9-RNA s cílovým substrátem DNA jsme pozorovali výrazný nárůst fluorescence, jak se DNA odvíjela od analogu báze tCo. Data jsme přizpůsobili dvojité exponenciále, abychom určili hlavní rychlost rozpadu 10 s-1 (obr. 3a-f). Je zajímavé, že tyto výsledky naznačují, že po zapojení místa PAM enzymem je počáteční odvíjení DNA rychlejší, než bylo pozorováno u -16 nt. Tato data naznačují, že pozorovaná čistá rychlost rozpadu odvíjení pozorovaná na -16 nt může být funkcí několika rychlých kroků odvíjení vedoucích k úplnému odvíjení. Protože však v kinetice nebylo pozorováno žádné zpoždění, zdá se, že rychlejší, dřívější dílčí kroky odvíjení vedou ke konečnému kroku omezujícímu rychlost úplného odvíjení, měřeného v poloze -16 nt. Ačkoli je zapotřebí dalších studií ke zkoumání vlivu neshod v dřívějších fázích odvíjení, naše současné měření poskytuje nejlepší odhad čisté rychlosti tvorby R-smyčky. Rychlost rozpadu změřená pro tvorbu R-smyčky pomocí tohoto značení je nerozlišitelná jak pro SpCas9, tak pro varianty s vysokou věrností na všech testovaných substrátech, takže se zdá, že rychlost odvíjení DNA se upravenými enzymy Cas9 nemění.

R-loop formation decay rates were measured by the monitoring the fluorescence increase from tCo (position -1 in the non-target strand) as function of time after mixing enzyme (28 nM) with DNA (10 nM) in the presence of 10 mM Mg2+. Data byla přizpůsobena dvojité exponenciální funkci, aby se získaly zobrazené rychlosti rozpadu. a, b SpCas9 (28 nm) s on-target (a) a off-target (b) DNA, c, d HypaCas9 s on-target (c) a off-target (d) DNA. e, f Cas9-HF1 s on-target (e) a off-target (f) DNA. g Karikatura přestavby HNH domény. h FRETSpCas9 značený párem Cy3 a Cy5 na C867 a C355 byl použit k měření pohybu HNH domény během štěpení on-target substrátů.

Pro korelaci rychlosti tvorby R-smyčky s kroky, které se podílejí na dokování HNH-domény na cílové vlákno, jsme měřili konformační změnu enzymu pomocí analýzy zastaveného toku na Cas9, který byl značen Cy3 a Cy5, jak bylo popsáno dříve18. Stručně řečeno, verze Cas9 s lehkým cysteinem byla označena Cy3 na aminokyselině 355 a Cy5 na aminokyselině 867. Účinnost FRET se zvyšuje, když se doména HNH přeskupí do katalyticky aktivního stavu (obr. 3g). Po rychlém smíchání párem FRET značeného Cas9 s dokonale odpovídající cílovou DNA jsme pozorovali zvýšení účinnosti FRET, což naznačuje, že se doména HNH přeskupuje do katalyticky aktivního stavu. Naměřili jsme, že rychlost rozpadu pro dokování HNH je ~2,5 s-1 (obr. 3h), což je podobné jako při měření FRET s jednou molekulou. Překvapivě jsou pozorované rychlosti tvorby R-smyčky (1,5 s-1) a dokování HNH domény velmi podobné, což naznačuje, že tyto kroky mohou být kineticky propojeny. Mírně rychlejší pozorovaná rychlost rozpadu pro pohyb domény HNH by mohla být způsobena zpětnou reakcí, protože pohyb domény se dostává do rovnováhy po vytvoření smyčky R nebo současně s ním.

Rychlosti rozpadu odvíjení DNA byly měřeny také pomocí jednomolekulových metod s použitím DNA značené párem FRET, Cy3 a Cy5 byly značeny na pozici -6 nt cílového vlákna, respektive -16 nt na necílovém vlákně16. Proto jsme testovali také substráty DNA spárované pomocí FRET ve snaze korelovat signál FRET s pozorovanou rychlostí štěpení DNA. Nejprve jsme testovali substrát dříve použitý ve studiích s jednou molekulou bez značek Cy3/Cy516 , který se od našeho substrátu liší o dva nukleotidy, konkrétně o substituci T v polohách -16 a -18. V tomto případě jsme použili substrát, který se liší o dva nukleotidy. Rychlost rozpadu štěpení cílového vlákna (HNH) je podobná jako u našeho substrátu (0,7 s-1 vs 1 s-1, doplňkový obr. 5a), takže sekvenční kontext v této pozici nemá významný vliv. Testovali jsme také štěpení pomocí Cy3/Cy5 značené DNA s touto jinou sekvencí a ta vykazovala podobnou rychlost rozpadu jako naše sekvence (0,05 s-1 vs 0,06 s-1, doplňkové obr. 5b a 6a). Později jsme zkoumali časový průběh štěpení cílového vlákna (HNH) DNA značené Cy3/Cy5 s naší sekvencí pro každý enzym (doplňkový obr. 6). U SpCas9 sleduje reakce DNA značené Cy3/Cy5 jedinou exponenciálu s výrazně sníženou rychlostí rozpadu (0,06 s-1 oproti 1 s-1), což ukazuje ~17násobné snížení pozorované rychlosti rozpadu při štěpení DNA ve srovnání s neznačeným substrátem. Upravený HypaCas9 a Cas9-HF1 rovněž vykazovaly sníženou rychlost štěpení DNA 0,0046 s-1 a 0,0016 s-1, což je 5,9krát a 28,75krát pomalejší než u neznačených substrátů měřených za identických podmínek. Je zřejmé, že interference značek Cy3/Cy5 mění vliv variant s vysokou věrností na rychlost štěpení DNA. V souhrnu značení DNA objemnými značkami Cy3 a Cy5 dramaticky ovlivnilo enzym. Z těchto důvodů nebyly provedeny žádné další studie s použitím DNA značené páry FRET.

Specifita enzymu Cas9 se řídí kinetickým rozdělením

Protože specifita enzymu je funkcí všech kroků vedoucích k prvnímu převážně nevratnému kroku, je třeba vzít v úvahu všechny události předcházející štěpení DNA17. Abychom změřili vnitřní rychlost štěpení, obešli jsme obvykle rychlost limitující krok tvorby R-smyčky tím, že jsme SpCas9 předem inkubovali s necílovou DNA v nepřítomnosti Mg2+, aby se vazba a konformační změny dostaly do rovnováhy a vytvořily komplex SpCas9.DNA. Poté jsme zahájili chemickou reakci přidáním 10 mM Mg2+. V našich předchozích studiích byla tvorba R-smyčky limitující rychlost reakce SpCas9 s cílovou DNA a vlastní rychlost rozpadu štěpení byla rychlejší při měření pomocí předinkubačního protokolu. Zde byly s necílovou DNA naměřeny rychlosti štěpení HNH a RuvC 0,12 s-1, resp. 0,14 s-1 (doplňkové obr. 7c, d a doplňkový obr. 8), které jsou mnohem pomalejší než rychlosti tvorby R-smyčky. Je zajímavé, že tyto výsledky ukazují, že rychlost limitujícím krokem v enzymové dráze SpCas9 s off-targetem je štěpení DNA, protože námi naměřená rychlost rozpadu pro tvorbu R-smyčky byla 0,85 s-1 (obr. 2b). Tyto údaje naznačují, že diskriminace je přinejmenším částečně založena na změně identity kroku omezujícího rychlost při porovnávání on- a off-target DNA.

Tyto experimenty jsme zopakovali s HypaCas9 a Cas9-HF1 s on- nebo off-target DNA. Tyto výsledky definují pozorované rychlosti štěpení HNH 0,035 s-1 a 0,0023 s-1 pro HypaCas9 s on- a off-target substráty (doplňkový obr. 7g, k). Pozorované rychlosti štěpení Cas9-HF1 pro on- a off-target substráty byly naměřeny 0,038 s-1, resp. 0,00014 s-1 (doplňkový obr. 7o, q). Tyto pozorované rychlosti štěpení jsou o něco vyšší než rychlosti naměřené při současném přidání DNA a Mg2+, což naznačuje, že nějaký jiný krok než tvorba R-smyčky, který však předchází štěpení DNA, může pozorovanou rychlost rozpadu zpomalit. Nicméně tyto výsledky ukazují, že pozorované rychlosti štěpení cílové DNA jsou u HypaCas9 i Cas9-HF1 oproti SpCas9 sníženy ~100krát. U necílové DNA jsou pozorované rychlosti štěpení sníženy 50krát, resp. 860krát u HypaCas9 nebo Cas9-HF1 oproti SpCas9.

Diskriminace není definována pouze relativní rychlostí štěpení DNA. Vzhledem k tomu, že tvorba R-smyčky je rychlá, je diskriminace spíše funkcí kinetického rozdělení mezi rychlostmi uvolňování DNA a štěpení17,26,27. Abychom mohli kvantifikovat kinetické rozdělení, inkubovali jsme enzym a značenou DNA v nepřítomnosti Mg2+, který umožňuje tvorbu R-smyčky v rovnováze, ale zabraňuje katalýze15. Poté jsme přidali Mg2+ k zahájení reakce v přítomnosti velkého přebytku identické, neznačené cílové DNA, která slouží jako past. Srovnání paralelních experimentů provedených v přítomnosti a nepřítomnosti pasti DNA poskytuje odhad frakčního kinetického rozdělení pro disociaci versus štěpení vázané DNA (obr. 4a). Jakmile se SpCas9 navázal na cílovou DNA, došlo k jeho rychlému štěpení a past DNA měla jen malý vliv (obr. 4b). Naproti tomu 33 % necílové DNA se od enzymu oddělilo, zatímco ~67 % DNA se štěpilo (obr. 4c a doplňkový obr. 9a). Tyto výsledky ukazují, že SpCas9 diskriminuje PAM-distální neshodnou DNA tím, že snižuje rychlost štěpení, což zvyšuje podíl DNA, která je uvolněna, nikoliv štěpena. Tento účinek je však malý, takže se zdá, že rychlost disociace je pomalejší než štěpení.

a Schéma experimentu s pastí na DNA. b, c Štěpení SpCas9 on-target (z Gong a kol.15) (b) nebo off-target (c) DNA. d, e HypaCas9 štěpení on-target (d) nebo off-target (e) DNA. f, g Cas9-HF1 štěpení on-target (f) nebo off-target (g) DNA. Enzym (28 nM) a značená DNA (10 nM) byly inkubovány v nepřítomnosti Mg2+ a reakce byla zahájena přidáním Mg2+ v přítomnosti nebo nepřítomnosti přebytku neznačené DNA pasti. A- a A◦ představují amplitudu s pastí (vyplněné kroužky), resp. bez pasti (otevřené kroužky). Procento udává podíl předem navázané DNA, která je odhodlána pokračovat ve štěpení, ve srovnání s reakcí v nepřítomnosti pasti.

Dále jsme zkoumali kinetické rozdělení pro HypaCas9 a Cas9-HF1 navázané na cílovou DNA (obr. 4d, f, doplňkový obr. 9b, d). Naše výsledky s HypaCas9 a Cas9-HF1 ukazují, že v přítomnosti pasti bylo rozštěpeno ~75 % a ~92 % cílové DNA. Procento štěpení je menší než u divokého typu SpCas9, protože pozorovaná vnitřní rychlost rozpadu štěpení cílové DNA pomocí HypaCas9 (0,035 s-1) a Cas9-HF1 (0,038 s-1) byla 100krát pomalejší než u SpCas9 (4,3 s-1). Tato pomalejší rychlost štěpení dává čas na disociaci malé části (8 až 25 %) on-target DNA před jejím štěpením.

Kinetické rozdělení ve prospěch disociace bylo posíleno, když HypaCas9 a Cas9-HF1 reagovaly s off-target DNA, protože rychlosti štěpení byly dále sníženy na 0,0023 s-1, resp. 0,00014 s-1 (obr. 4e, g, doplňkový obr. 9c, e). Tyto rychlosti jsou 50- respektive 860krát pomalejší ve srovnání se SpCas9 na necílovém substrátu. V souladu s tím bylo pouze ~24 % a ~10 % navázané necílové DNA určeno k dalšímu štěpení pomocí HypaCas9 a Cas9-HF1 v přítomnosti trap DNA. Celkově tyto výsledky ukazují, že upravené varianty s vysokou věrností získaly lepší specifitu vůči PAM-distální neshodné DNA díky výrazně snížené rychlosti štěpení, která mění kinetické rozdělení ve prospěch uvolnění spíše než štěpení navázaného substrátu pro on- i off-target DNA, ale tento účinek je větší pro off-target DNA. Výpočet zdánlivých rychlostních konstant disociace pomocí rovnice (3) ukazuje, že varianty s vysokou věrností nezvyšují zdánlivou rychlost uvolňování DNA (doplňková tabulka 1).

Zvýšená diskriminace je spíše zcela přičítána poklesu zdánlivé rychlostní konstanty štěpení.

V našich dosavadních popisech kinetiky enzymů Cas9 byly pozorované rychlosti rozpadu reakcí odhadovány na základě přizpůsobení dat exponenciálním funkcím, které dávají vlastní hodnoty, jež jsou obvykle komplexními funkcemi více rychlostních konstant17. Pro úplné pochopení kinetiky a mechanismu byly všechny experimenty pro každý enzym a substrát DNA přizpůsobeny globálně na základě numerické integrace rychlostních rovnic pomocí jediného jednotného modelu (obr. 5 a doplňkové obr. 10-14). Globální přizpůsobení dat ukazuje, že náš minimální model (obr. 5f, vložka) odpovídá našim datům a každá z rychlostních konstant je dobře definována na základě analýzy kontury spolehlivosti testující míru omezení každého parametru daty (obr. 6)17,28 . Všimněte si zejména, že náš model zohledňuje bifázické stopy pozorované v některých experimentech, aniž by se musel odvolávat na heterogenitu, a poskytuje vlastní rychlostní konstanty pro každý krok v dráze včetně tvorby R-smyčky a událostí štěpení HNH a RuvC. Ačkoli je pravděpodobné, že pro zarovnání katalytických zbytků pro štěpení DNA mohou být zapotřebí další, nevyřešené strukturní přestavby, ty zatím nebyly vyřešeny jako kineticky odlišné události. Současný model představuje minimální dráhu, která je nezbytná a dostatečná pro zohlednění všech dostupných údajů, a může být snadno rozšířena, jakmile budou k dispozici nové informace, které definují další kroky v dráze.

a DNA a Mg2+ iniciované štěpení doménou HNH. b DNA a Mg2+ iniciované štěpení doménou RuvC. c Rychlost tvorby R-smyčky. d Mg2+ iniciované štěpení doménou HNH. e Mg2+ iniciované štěpení doménou RuvC. f Vliv pasti DNA na kinetické rozdělení štěpení Cas9. Všechny křivky byly vypočteny na základě globálního přizpůsobení dat podle kinetického modelu (vložka), přičemž rychlostní konstanty jsou uvedeny v tabulce 1. Odhady chyb byly založeny na analýze konfidenční kontury, jak je znázorněno na obr. 6. E je Cas9.gRNA, D je cílová DNA, ED je Cas9.gRNA.DNA, EDH je tvorba R-smyčky s dokováním cílového vlákna na HNH, EDHR a EDP1R je tvorba R-smyčky s dokováním necílového vlákna na RuvC, EDHP2 je štěpení necílového vlákna RuvC, EDP1 je štěpení HNH cílového vlákna, EDP1P2 je štěpení obou vláken, Dtrap je přebytek neznačené, dokonale shodné DNA. EDtrap je Cas9.gRNA.DNAtrap.

Kontury spolehlivosti jsou uvedeny pro fitování dat na obr. 5. Očíslované rychlostní konstanty jsou definovány v našem kinetickém modelu (obr. 5f, vložka). Práh χ2 (čárkovaná čára) byl nastaven na 0,99, aby se definovaly horní a dolní meze pro každou rychlostní konstantu, jak je popsáno17,32. Protože obrysy byly symetrické s dobře omezenými parametry, v tabulce 1 uvádíme ± mezní chyby. Pro tuto analýzu byla vypočtena prahová hodnota χ2 pomocí F-distribuce a byla použita k definování dolních a horních mezí pro každý parametr.

Pro pochopení specifičnosti enzymu musí být rychlostní konstanty interpretovány v kontextu všech kineticky relevantních kroků, jak je znázorněno v profilu volné energie (vypočtené pomocí rov. (4) z rychlostních konstant v tabulce 1).

Přenosový koeficient A = 0,001

Protože globální fitování dat poskytuje rychlostní konstanty pro každý relevantní krok (obr. 5 a 6), můžeme sestavit profil volné energie v dobré víře (obr. 7b a doplňkové obr. 10-14). Profily volné energie porovnávající SpCas9, HypaCas9 a Cas9-HF1 ukazují změnu v krocích limitujících rychlost a určujících specifitu. Specifičnost enzymu je definována pomocí kcat/Km a je dána nejvyšší celkovou bariérou vzhledem k výchozímu stavu, zatímco maximální rychlost, kcat, je definována nejvyšší lokální bariérou vzhledem k předchozímu stavu, oslabenou případnými předchozími rychlými rovnovážnými kroky. Vzhledem k tomu, že rychlostní konstanty pro tvorbu smyčky R se s různými substráty a variantami enzymu výrazně nemění, je specifita řízena převážně kinetickým rozdělením smyčky R Cas9, stavu EDH v našem kinetickém modelu (obr. 5f, vložka), buď dopředu, což vede k nevratnému štěpení, nebo k uvolnění prostřednictvím opětovného sbalení DNA a vypuzení z enzymu. Vyšší celkové bariéry pro štěpení pozorované u variant s vysokou věrností zvyšují pravděpodobnost kinetického rozdělení ve prospěch disociace DNA (obr. 6c).

a Kreslené znázornění reakční dráhy enzymů Cas9. b Profily volné energie pro štěpení SpCas9 on-target (šedá čára) od Gonga a spol.15 . a mimo cíl (červená čára); štěpení HypaCas9 mimo cíl (modrá čára) a štěpení Cas9-HF1 mimo cíl (černá čára). Každý profil byl vypočítán pomocí teorie přechodových stavů s použitím rychlostních a rovnovážných konstant, které byly odvozeny z globálního přizpůsobení každé sady experimentů (tabulka 1). Všimněte si, že vyšší bariéry pro štěpení DNA ve srovnání s nižší bariérou pro předchozí zpětnou reakci zvyšují pravděpodobnost uvolnění DNA. c Souhrnný sloupcový graf pro k2, k3 a kinetické rozdělení (P).

.