DR. EDWIN B. ASTWOOD byl vizionářem moderní endokrinologie. Biografická vzpomínka Roye Greepa a Monte Greera končila slovy: „Kromě specifického přínosu k výzkumu se Dr. Edwinu B. Astwoodovi podařilo v takové míře, jaké dosáhl málokdo, obsáhnout širokou oblast mezi přírodními vědami a klinickou medicínou.“ Pro mě je to nejvyšší poslání v endokrinologii.

Konec šedesátých a začátek sedmdesátých let se vyznačoval neuvěřitelnými úspěchy dvou skupin, skupin doktorů Andrewa Schally a Rogera Guillemina, kteří izolovali, charakterizovali a sekvenovali hypotalamické regulační hormony. Prvním sekvenovaným hypotalamickým regulačním hormonem byl TRH (tripeptid), druhým gonadotropin uvolňující hormon (dekapeptid) a třetím somatostatin se 14 aminokyselinami. Existenci GHRH naznačily již počátkem 60. let minulého století některé klasické pokusy Reichlina (1); ten provedl léze v hypotalamu a prokázal, že obsah GH v hypofýze klesá. Na základě těchto údajů vyslovil domněnku, že v hypotalamu musí existovat GHRH.

Své lékařské vzdělání jsem absolvoval v Londýně v Anglii, přičemž endokrinologický výcvik jsem absolvoval u profesora G. Michaela Bessera. Jednou z nejpříjemnějších konferencí, kterých jsme se pravidelně účastnili, byla prezentace klinických případů v Královské lékařské společnosti. Do paměti se mi vrylo, že pokaždé, když byl prezentován pacient s akromegalií, profesor Peter Sonksen se ptal, zda pacient nemá známky karcinoidního nádoru. V publiku to bylo vnímáno slovy: „Proč se ten člověk pořád na něco takového ptá?“ Protože takové případy pravděpodobně neexistují, a pokud ano, tak jen velmi zřídka!“

V roce 1977 jsem se přestěhoval z nemocnice svatého Bartoloměje (Londýn, Anglie) na Virginskou univerzitu. Mým hlavním zájmem v té době byly nádory hypofýzy vylučující PRL a jejich léčba.

V říjnu 1980 mi byl Dr. Ann Johansonovou doporučen 21letý pacient. Tato pacientka měla amenoreu a galaktoreu při užívání perorální antikoncepce pro náhradu gonadálních steroidů. Měla agenezi gonád v důsledku Turnerova syndromu.

Při vyšetření byla zjištěna zvětšená jamka hypofýzy na rentgenovém snímku lebky, útvar hypofýzy s mírným supraselárním rozšířením na počítačové tomografii a zvýšená hodnota PRL v séru 68 μg/L. Její zvýšený GH v séru 95 μg/l nebyl tlumen perorální glukózou, zvyšoval se při podávání TRH a byl tlumen infuzí dopaminu. Její sérová hladina růstového faktoru podobného inzulinu (IGF)-I byla zvýšená na 11 U/ml (norma 0,41-2,2 U/ml).

Na základě těchto výsledků byla diagnóza akromegalie jasná. Je zajímavé, že výška pacientky byla 180 cm, což je na pacientku s Turnerovým syndromem velmi vysoká výška. V tomto ohledu bylo štěstí, že byla zachována séra z předchozích 7 let. Její sérové koncentrace GH byly po celou tuto dobu zvýšené (tabulka 1).

Pacientka byla odeslána k transsfenoidální operaci, která byla provedena 15. ledna 1981. Sedm týdnů po operaci se ukázalo, že má stále akromegalii; GH v séru byl 52 μg/l a IGF-I byl stále zvýšen na 7,7 U/ml.

V rámci probíhající spolupráce byly vzorky patologie hypofýzy zaslány Dr. Kalmanu Kovacsovi (St. Michael’s Hospital, Toronto, Kanada). O něco později mi Dr. Kovacs zavolal, aby mi sdělil výsledky svého vyšetření tkáně. Z jeho zprávy vyplynulo, že tento pacient má somatotropní hyperplazii, nikoliv nádor hypofýzy. Důvody vedoucí k této diagnóze byly následující: 1) retikulinový vzor byl zachován (u nádorů bývá zničen) (obr. 1); 2) převažovaly somatotrofy, i když se mezi nimi vyskytovaly tyreotrofy, gonadotrofy a kortikotrofy; 3) elektronová mikroskopie somatotrofů odhalila dobře vyvinuté endoplazmatické retikulum a Golgiho aparát, což svědčí o aktivní syntéze hormonů (obr. 2). Protože somatotrofy byly hustě zaplněny sekrečními granulemi, naznačovalo mi to, že to odráží inhibici uvolňování hormonů v důsledku zpětné vazby vylučovaného GH, pravděpodobně zvýšením sekrece somatostatinu (a/nebo IGF-I).

Na základě histologie hypofýzy bylo jasné, že hypofýza je stimulována vnějším faktorem. Bylo nepravděpodobné, že by to bylo způsobeno mutací v receptoru GHRH nebo konstitutivní aktivací G proteinu spojeného s receptorem GHRH, protože k tomu by pravděpodobně došlo v jediné buňce, což by vedlo k rozvoji nádoru a rozpadu retikulinové struktury. Proto bylo mnohem pravděpodobnější, že hypofýza byla stimulována vnějším faktorem, buď GHRH pocházejícím z hypotalamu, nebo z periferie. Za druhé, kvůli přetrvávající akromegalii bylo nutné najít příčinu akromegalie tohoto pacienta. V této době vyšel článek Frohmana a kol (2), který informoval o částečné purifikaci a charakterizaci peptidu s GH uvolňující aktivitou z extrahypofyzárních tumorů od pacientů s akromegalií.

Počítačová tomografie břicha prokázala tumor o průměru 5 cm v ocase pankreatu. Dne 26. srpna 1981 byl nádor odstraněn. Byl dobře zapouzdřený a při histologickém vyšetření byl určen jako nádor z ostrůvkových buněk. Nejednalo se však o nádor z β ani α buněk. Byl silně pozitivní na neuron-specifickou enolázu a při imunochemickém barvení byl negativní na GH, inzulín, glukagon, kalcitonin a ACTH, s nejednoznačným barvením na somatostatin.

Nádor imunocytochemicky neobsahoval GH. V prvních 2 hodinách po odstranění nádoru došlo k rychlému poklesu sérových hladin GH ze 70 μg/l na 3 μg/l (obr. 3) (3). Pacientka je nyní sledována již 18 let a zůstává vyléčená z akromegalie.

Další otázkou bylo, co dělat s nádorem pankreatu. V té době jsem měl to štěstí, že mým kolegou na Virginské univerzitě byl zesnulý Dr. Michael Cronin. Michael se mnou přišel na operační sál, aby mi pomohl realizovat naši pečlivě vypracovanou strategii, jak s nádorem naložit. Polovina nádoru byla nakrájena na kostky a okamžitě uložena do tekutého dusíku a druhá polovina byla připravena pro tkáňovou kulturu. Ta byla odeslána několika skupinám, které byly odborníky na vytváření stabilních buněčných linií. Michaelu Croninovi se podařilo prokázat, že médium, ve kterém se tento nádor koupal, obsahovalo aktivitu GHRH a stimulovalo adenylátcyklázu (4). Nádor byl původně poskytnut Dr. Wylie Valeovi ze Salk Institute (La Jolla, Kalifornie) a ten následně předal jeho část Dr. Guilleminovi. Obě skupiny nezávisle na sobě zjistily, že obsahuje vysokou aktivitu GHRH, a podařilo se jim GHRH z nádoru izolovat, charakterizovat a sekvenovat (5-8). GHRH z tohoto nádoru byl peptid o 40 aminokyselinách, který má homologii s členy rodiny peptidů glukagonu/sekretinu/VIP.

Vybral jsem si endokrinologii jako svůj obor, protože moji učitelé mi vtiskli důležitost aplikace fyziologie pro pochopení patofyziologie a terapie pacientů s endokrinním onemocněním.

Každý pacient, kterého člověk vidí, je experiment přírody. Měl jsem velké štěstí, že mi byl doporučen tento pacient, který mně a mým kolegům umožnil poskytnout nádor dvěma předním skupinám, které pak byly schopny izolovat, charakterizovat a sekvenovat dlouho hledaný GHRH. Ve skutečnosti byl GHRH jedním z prvních hledaných hypotalamických hormonů, ale bylo mnoho falešných startů.

Důvodů, proč se v roce 1982 podařilo úspěšně charakterizovat a sekvenovat GHRH, bylo několik. Za prvé, metody hodnocení aktivity nádorových extraktů byly zdokonaleny a byly mnohem citlivější. Za druhé, metody mikrosekvenování se za předchozích 10 let značně zdokonalily. Ale třetím a pravděpodobně nejdůležitějším důvodem bylo, že tento nádor obsahoval vysoké koncentrace GHRH a velmi málo somatostatinu. Somatostatin inhibuje uvolňování GH v biologickém testu, a proto jeho přítomnost ztěžovala sledování purifikace GHRH. Extrakt z tohoto nádoru tento proces značně zjednodušil (protože obsahoval vysoké koncentrace GHRH a somatostatinu bylo přítomno málo) ve srovnání s dřívějšími pokusy využívajícími statisíce zvířecích hypotalamů, které byly bohaté na somatostatin a měly velmi malé koncentrace GHRH. Jednalo se o první příklad použití jediného lidského nádoru k identifikaci a izolaci hormonu. Protein související s PTH byl izolován podobnou technikou s použitím lidské nádorové buněčné linie.

Jako kliničtí lékaři máme všichni povinnost identifikovat experimenty přírody a využít příležitosti položit si otázky, na které by bylo velmi obtížné odpovědět jiným způsobem. Přírodní experimenty jsou často jedinečné a jistě 15 nebo 20 pacientů, kteří přišli před tímto, poskytlo vodítko, že nádor od pacienta s ektopickou sekrecí GHRH by mohl odpovědět na otázku povahy a struktury GHRH. Ve skutečnosti se skupina Dr. Guillemina následně dozvěděla o jiném nádoru od Dr. Genevieve Sassolasové (Centre de Medecine Nucleaire, Hôpital Cardiologique, Lyon, Francie), a protože měli více tkáně z tohoto nádoru, studovali jej agresivněji než ten z Charlottesville. Nicméně právě původní nádor z Charlottesville naznačil, že takový nádor by mohl nabídnout klíč k hledání GHRH.

Následné studium fyziologie GHRH a jeho terapeutického potenciálu jako léčby nedostatku GH u dětí bylo předmětem práce naší skupiny v posledních 17 letech (9, 10). Zpočátku jsme podávali GHRH normálním dobrovolníkům a prokázali jeho účinnost a specifičnost při zvyšování sérových koncentrací GH (11). Poté jsme stanovili odpověď GH na akutní injekci GHRH u dětí s idiopatickým deficitem GH (obr. 4). U mnoha dětí došlo k velmi výraznému zvýšení GH, zatímco u některých bylo zvýšení malé nebo žádné (12); odpověď na GHRH byla větší než na arginin a l-dopu. Na základě těchto výsledků jsme navrhli, že mnoho dětí s idiopatickým nedostatkem GH skutečně trpí nedostatkem GHRH.

Poté byla zahájena multicentrická studie léčby GHRH. To se zdálo být obzvláště vhodné, protože GH používaný k léčbě nedostatku GH pocházel z mrtvol a byl zapleten do přenosu Jacobovy Creutzfeldovy choroby. Celkem bylo léčeno 24 dětí; u 10 dětí byla použita pumpa k podávání bolusu GHRH každé 3 h. Tento způsob a dávka byly zvoleny tak, aby napodobovaly normální fyziologii přibližně jednoho pulzu GH každé 3 h u rostoucích dětí. Kromě toho bylo 10 dětí léčeno pumpou každé 3 h pouze přes noc a 4 děti dostávaly dvakrát denně sc injekce GHRH. Rychlost růstu dětí před léčbou a po 6 měsících léčby je znázorněna na obr. 5 (13).

Na základě výsledků této studie zahájila společnost Serono Laboratories, Inc. 12měsíční multicentrickou studii s GHRH(1-29)-NH2 podávaným sc jednou denně (14). U dětí, které rostly nejpomaleji, došlo k největšímu zvýšení rychlosti růstu (obr. 6). To naznačuje, že GHRH může obnovit fyziologickou sekreci GH. GHRH je schválen Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv pro diagnostické použití i pro léčbu nedostatku GH u dětí. GHRH je bezpečný a účinně urychluje rychlost růstu u většiny pacientů s deficitem GH.

V době, kdy byl GHRH syntetizován, byl velký zájem o down-regulaci gonadotropinové odpovědi na gonadotropin uvolňující hormon. Zaujalo nás pozorování u jiného pacienta s ektopickou sekrecí GHRH z metastazujícího karcinoidního nádoru, který dal vzniknout akromegalii. Navzdory trvale zvýšeným hladinám GHRH po celých 24 hodin byl vzorec uvolňování GH stále pulzující, což naznačuje, že pravděpodobně existují další faktory, které se podílejí na regulaci pulzujícího vzorce sekrece GH (15). Předpokládá se, že to může být způsobeno vysazením somatostatinu. Ektopická sekrece GHRH tedy jednoznačně ukazuje, že dlouhodobě působící agonista GHRH může zvýšit pulzující sekreci GH. Studie kontinuální iv infuze GHRH u normálních jedinců prokazují stejný jev, a je tedy zřejmé, že depotní preparát GHRH může být užitečným terapeutickým prostředkem.

Naše skupina (16) a Mayo (17) klonovali receptor GHRH. Je zajímavé, že receptor GHRH je členem třídy B receptorů spřažených s G proteinem, která zahrnuje receptory pro peptidy ze skupiny glukagon/sekretin a také CRH, kalcitonin a parathormon. Jejich struktura je zcela odlišná od struktury větších rodopsinových receptorů (rodina A). I v této rodině receptorů je však sedm transmembránově se rozprostírajících domén.

Kritickou roli GHRH dokládá trpasličí myš lit, která má bodovou mutaci v receptoru GHRH (18, 19). Wajnrajch a kol (20) popsali nesmyslnou mutaci (Glu 72stop) v lidském receptoru GHRH způsobující poruchu růstu a nedostatek GH u dvou dětí ze stejného indického muslimského rodu. Maheshwari et al. (21) popsali rod v údolí Sindh v Pákistánu se stejnou mutací. Členové tohoto rodu jsou extrémně malého vzrůstu. Další mutace v receptoru byla popsána u velkého brazilského rodu, který zahrnuje více než 110 jedinců postižených těžkým deficitem GH a extrémně nízkým vzrůstem (22). Tyto přírodní pokusy ukazují, že defekt v receptoru GHRH narušuje normální růst, a zdůrazňují zásadní význam GHRH.

Karikatura receptoru GHRH je na obr. 7 (10). Asparagová kyselina na pozici 60 od start kodonu je místem mutace u myšího lit. Ke studiu membrán z buněk HEK293 transfekovaných komplementární DNA pro receptor GHRH bylo použito Western blotting s použitím C-terminálního antiséra receptoru GHRH, které bylo vzneseno na peptid založený na sekvenci lidského receptoru GHRH. Studie ukazují, že myší receptor je přeložen do proteinu a je skutečně přítomen v membráně buněk hypofýzy u myší. Navrhli jsme, že tato mutace vede ke změně terciární struktury receptoru, která brání vazbě (23). Pomocí fotoafinitních sond naše důkazy naznačují, že další místa jsou v těsné blízkosti vázaného GHRH, což naznačuje, že k přenosu signálu je pravděpodobně zapotřebí několik míst interakce. Dostupnost rekombinantního receptoru umožňuje hledání nepeptidových agonistů GHRH.

Závěrem lze říci, že poznatky získané pečlivým pozorováním jediného pacienta s akromegalií vedly k izolaci, charakterizaci a syntéze GHRH. Další studie vedly k zavedení léčby nedostatku GH pomocí GHRH. Následně se nám spolu s dalšími podařilo naklonovat receptor pro GHRH. Studie s GHRH potvrdily, že je nezbytný pro syntézu GH a normální růst. Toto stanovisko je nyní potvrzeno pozorováním, že mutace receptoru GHRH, které vedou k jeho inaktivaci, vedou k hlubokému nedostatku GH a těžkému malému vzrůstu a uzavírají kruh našeho chápání regulace GH pomocí GHRH.

Poděkování

Děkuji mnoha svým kolegům, kteří významně přispěli k této práci, a také paní Suzan Pezzoli za pomoc při přípravě tohoto rukopisu.

Tato práce byla částečně podpořena granty NIH HD-13197, DK-32632 a DK-45350 (pro M.O.T.) a grantem RR-00847 (pro General Clinical Research Center a CDMAS Laboratory na University of Virginia.