Biologie p38 kinázy
Signální dráha p38 MAPK je od své první identifikace před více než 10 lety jedním z nejintenzivněji studovaných témat v biologii. Míra zájmu o tuto dráhu je dána především dvěma faktory. Za prvé, tato signální dráha je aktivována širokou škálou podnětů a podílí se na mnoha onemocněních, zejména zánětech. Za druhé, brzká dostupnost selektivních inhibitorů p38 poskytla kritické nástroje potřebné k dalšímu vymezení úlohy, kterou proteinkinázy hrají v signálních drahách, a prostředky k využití terapeutického potenciálu inhibice p38. Během posledních pěti let skutečně vstoupilo do klinických studií velké množství inhibitorů p38.
V době objevu p38 MAP kinázy byl již identifikován první člen rodiny MAP kináz, extracelulárním signálem regulovaná kináza (ERK). Nebylo však doceněno, že existují další dvě podrodiny threonin/tyrozin kináz s dvojí specifitou (p38 a JNK). V roce 1994 několik výzkumných skupin nezávisle na sobě identifikovalo novou kinázovou aktivitu (Freshney et al., 1994; Han et al., 1994; Rouse et al., 1994;) a následně klonování lidské cDNA vedlo k identifikaci p38 α (Lee et al., 1994). Krátce poté byly identifikovány další tři sestřihové varianty rodiny p38, p38β, P38y a p38h (Jiang et al., 1996, Jiang et al., 1997, Kumar et al., 1997). Dva členové rodiny, p38α a β, jsou exprimováni všudypřítomně, ale jsou různě regulováni v různých typech buněk, zatímco další dva mají omezenější tkáňovou distribuci. Dosud nejlépe poznaným členem rodiny je p38α, který se podílí na řadě onemocnění (přehled v Kumar et al., 2003 a Saklatvala, 2004).
Aktivace p38 byla pozorována u různých organismů jako odpověď na mnoho podnětů. Ortologové p38α u kvasinek, červů a žab se podílejí na osmoregulaci, reakcích na stres a regulaci buněčného cyklu. Regulace p38α v savčích buňkách byla také dobře prozkoumána (přehled v Zarubin a Han, 2005). Nyní je zřejmé, že signální dráha p38α je komplexní, ovlivňovaná nejen podněty a typem buňky, ale také různými regulátory a kombinacemi předcházejících aktivačních kináz. Je dobře známo, že existují dvě hlavní upstream aktivační kinázy pro p38α, MKK3 a MKK6. Kromě toho existuje mechanismus aktivace p38α nezávislý na MKK, který zahrnuje proteinovou kinázu aktivovanou transformujícím růstovým faktorem 1 (TAK1) – vazebný protein (TAB) (Ge et al., 2002). Aktivace p38α může být dosaženo autofosforylací po interakci s TAB1. Předpokládá se také, že p38 negativně reguluje signalizaci TAK1 fosforylací TAB1 (Cheung et al., 2003). Za signalizací TAK1 stojí IKK, která slouží jako základní aktivační krok kinázy Tpl2 a jejích následných cílů, MEK1 a ERK (Waterfield et al., 2004). Inhibice p38 tedy vede k upregulaci TAK1, což vede k aktivaci ERK. To vysvětluje, proč je aktivace ERK často pozorována u buněk léčených inhibitory p38α. Toto zjištění zdůrazňuje potřebu porozumět potenciálnímu nelineárnímu vzájemnému ovlivňování signálních drah kináz. Kromě TAK1 se na aktivaci p38α a jeho blízkého souseda, JNK, podílejí i další kinázy v horním proudu (MAP3K). K procesu aktivace přispívají také malé GTP-vázající proteiny, jako jsou Rac1 a Cdc42, a jejich interakce s PAK (p21-aktivované kinázy) a MLK1.
Downstream substráty p38 MAP kináz jsou MAPKAPK2 (Kotlyarov et al., 2002) a MAPKAPK3 (McLaughlin et al., 1996), které fosforylují různé substráty – včetně malého proteinu tepelného šoku 27 (HSP27), lymfocytárně specifického proteinu 1(LSP1), proteinu CREB (cAMP response element-binding protein), transkripčního faktoru (ATF1), SRF a tyrozinové hydroxylázy. Zvláště zajímavý je substrát MAPKAPK2 tritetraprolin, protein, který destabilizuje mRNA (Tchen et al., 2004). MNK je dalším substrátem p38, který se zřejmě podílí na iniciaci translace, protože fosforyluje eIF-4E (Waskewicz et al., 1997). Kromě toho je známo, že p38 aktivovaná kináza (PRAK) a mitogenem a stresem aktivovaná proteinová kináza (MSK1) jsou také aktivovány p38α, ačkoli MSK1 je aktivována také ERK (Deak et al., 1998). Není překvapením, že existuje velké množství transkripčních faktorů, které jsou regulovány p38 (přehled v Zarubin a Han, 2005). Mezi příklady patří aktivační transkripční faktory 1, 2 a 6, SRF akcesorní protein (Sap1), GADD153, p53, c/EBPb, myocyte enhancing factor 2C (MEF2C), MEF2A, DIT3, ELK1, NFAT a high mobility group-box protein (HBP1). Ukázalo se, že substráty pro p38α jsou i další nepříbuzné proteiny, jako je cPLA1, Na+/H+ exchanger isoform-1 (NHE-1), tau, keratin 8 a stathmin.
Mechanismus, jakým inhibitory p38 MAP kinázy potlačují expresi zánětlivých cytokinů, je nepochopitelný. Exprese zánětlivých genů je vysoce regulována na transkripční i posttranskripční úrovni. První studie zkoumající účinky inhibitorů p38 v lidských monocytech naznačovaly, že regulace biosyntézy zánětlivých cytokinů (především IL-1 a TNF) probíhá na posttranskripční úrovni. Následně se ukázalo, že stabilita mRNA může být negativně ovlivněna inhibicí dráhy p38 (Frevel et al., 2003). Toto pozorování podnítilo další studie, které ukázaly, že podobným způsobem jsou ovlivněny i další proteiny zánětlivé odpovědi, například COX-2 (Lasa et al., 2000). Mezi další mRNA, které jsou stabilizovány p38, patří MIP-1a, gm-CSF, VEGF a MMP-1 a -3 (Dean et al., 2004). Zajímavé je, že MAPKAPK-2, substrát pro p38, se také podílí na stabilizaci mRNA pomocí p38. Katalyticky aktivní formy MAPKAPK-2 stabilizují reportérovou mRNA, zatímco dominantně negativní MAPKAPK-2 blokuje její expresi (Winzen et al., 1999).
Společným znakem strukturních rysů, které ovlivňují stabilitu mRNA, je motiv bohatý na AU v prodlouženém 3′UTR. Tento motiv poprvé popsali Shaw a Kamen (1986). Existují tři odlišné třídy těchto prvků bohatých na AU (ARE): jedna obsahuje malý počet ARE (např. c-Fos), druhá obsahuje větší počet ARE, které mají několik pentamerů (např. TNFα, COX-2 atd.), a třetí třída obsahuje ARE, které postrádají pentamery, ale obsahují oblasti bohaté na U. V první třídě jsou ARE bohaté na AU. ARE se zaměřují na mRNA, která je v buňkách rychle deadenylována. Obecně mají ARE regulované p38 podobné strukturní motivy s více překrývajícími se pentamery v 3′UTR. Existují však výjimky, jako jsou MMP-1 a -3 (Reunanen et al., 2002) a tristetraprolin (Mahtani et al., 2001, Tchen et al., 2004), mRNA, které obsahují alespoň jeden pentamer a sekvence bohaté na U. Tyto mRNA se mohou lišit od jiných mRNA. Přesný mechanismus, kterým p38 reguluje stabilitu mRNA, zůstává nejasný. Předpokládá se, že se na něm podílí navazující kináza MAPKAPK-2 a také nepolapitelný protein vázající ARE. Existuje řada kandidátů (Dean et al., 2004), ale žádný z nich nesplňuje všechna kritéria pro to, aby byl proteinem, který spojuje dráhy p38 a mRNA obsahující ARE. Z nich je zajímavou možností tristetraprolin, i když slouží především jako „vypínač“ při stabilizaci mRNA.
Velké množství údajů z preklinických studií naznačuje ústřední roli p38 v imunologických a zánětlivých reakcích (Dong et al., 2002; Kracht a Saklatvala, 2002; Kumar et al., 2003). Nyní je známo, že dráha p38 je selektivně aktivována v efektorových T lymfocytech Th1 v odpovědi na IL-12 a IL-18. Produkce cytokinů Th1, jako je interferon gama, je inhibitory p38 inhibována, zatímco produkce IL-4, cytokinu Th2, nikoli. V makrofázích je řada zánětlivých cytokinů – například TNF, IL-1, IL-6 a IL-8 – regulována cestou p38. Fibroblast myšího embrya s knock-out MKK3 reaguje na TNF, ale ne na IL-1, UV záření nebo sorbitol, což naznačuje roli MKK3 v působení TNF, ale ne IL-1. U p38α knock-outovaných myších embryonálních fibroblastů je však produkce IL-6 indukovaná IL-1 značně narušena. Tyto údaje naznačují, že různé ligandy vyvolají funkci různých kináz v dráze p38. Spolu s velkým množstvím genetických a in vivo farmakologických důkazů tyto výsledky podporují p38 jako platný cíl, jehož inhibice by mohla přinést terapeutický prospěch u různých zánětlivých onemocnění, zejména revmatoidní artritidy (Foster et al., 2000). Další možnosti farmakologického zásahu zahrnují srdeční hypertrofii, Alzheimerovu chorobu, poškození cév, psoriázu a zánětlivé onemocnění střev.