Test Limulus Amebocyte Lysate (LAL) je metoda pro detekci a kvantifikaci bakteriálních endotoxinů, která se široce používá ve farmaceutickém a biotechnologickém průmyslu. Biochemický princip testu je založen na srážecí reakci hemolymfy kraba Limulus polyphemus, běžně známého jako podkovář atlantský, v přítomnosti antigenů s mikrobiálním povrchem, jako jsou lipopolysacharidy nebo bakteriální endotoxiny.

Společnost „Wako Chemicals“ patří mezi společnosti, které vyrábějí činidla LAL na mezinárodní úrovni díky svému jedinečnému složení činidla LAL specifického pro bakteriální endotoxiny bez interference beta glukanů ve vzorcích, a to díky přídavku karboximethylovaného kurdlanu (CMC) koliofilizovaného s LAL. Pod značkou PYROSTAR™ tato společnost, která je distributorem výzkumných činidel, vyrábí a prodává činidla a příslušenství LAL, která splňují všechny normy, předpisy a standardy kvality stanovené FDA z USA.

Přiblížíme si nyní různá činidla a příslušenství, kterými společnost Wako přispívá ke studiu bakteriálních endotoxinů:

Nejprve tu máme soupravu Limulus PS Simple Test, která umožňuje detekci a kvantifikaci endotoxinů bez interference jiných koexistujících látek s použitím afinitního adsorbentu pro endotoxiny s názvem Pyrosep™. Pomocí této metody můžeme měřit endotoxiny v lipofilních vzorcích za předpokladu, že je lze rozpustit v ethanolu, jako jsou vitaminy rozpustné v tucích, oleje a tuky, albuminy atd., které nelze běžně měřit běžným Limulusovým testem. Navíc nedochází k plýtvání činidlem LAL, protože se aplikuje jednotlivě v lahvičkách jednoduchého testu a lze jej použít v přesném množství potřebném pro měření.

Řada PYROSTAR™ ES-F je jedinečný přípravek obsahující karboxymethylovaný kurdlan (CMC) koliofilizovaný LAL s cílem odstranit interferenci s β-glukany. Pufr ES vyvinutý společností Wako obsahuje vysoké koncentrace CMC, které se mění v činidlo LAL specifické pro endotoxiny. Toto činidlo je určeno jak pro kvalitativní detekci endotoxinů metodou gelových sraženin, tak pro jejich kvantitativní detekci pomocí kinetických turbidimetrických metod (KTA). K měření rychlosti změny zákalu se používá fotometrický přístroj Toxinometer® vyvinutý společností Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Tento přístroj je určen k měření rychlosti změny zákalu. Soupravy PYROSTAR™ ES-F jsou k dispozici se standardním kontrolním endotoxinem (SCE) nebo bez něj: lyofilizované činidlo rafinované z E.coli, které se používá k potvrzení citlivosti činidla LAL, k validaci metod testování produktů a k přípravě inhibičních kontrol.

K podpoře těchto činidel vyvíjí společnost Wako také roztok pro extrakci endotoxinů, který je schopen extrahovat endotoxiny z povrchů, kde je nelze extrahovat vodou nebo solí. Jeho použití se doporučuje u vzorků endotoxinů na zařízeních a přístrojích, které by mohly přijít do styku s kapalinami obsahujícími krev nebo proteiny.

Toxinometr® ET-6000 je počítačový kinetický inkubační snímač, který může zahrnovat 3 testovací metody: gelový test, KTA a KCA (kinetický chromogenní test). Toto zařízení nám umožňuje získat výsledky gelové sraženiny a KTA ze stejného vzorku. Současně měří až 16 vzorků s rizikem kontaminace, které je mnohem nižší než u mikrotitračních destiček, a umožňuje nám archivovat standardní křivky. Toximaster® QC7 je software, který poskytuje všechny funkce pro zpracování dat a přípravu protokolů pro test LAL s přístrojem Toxinometer® ET-6000.

Mezi příslušenstvím z katalogů LAL společnosti Wako najdeme také zkumavky s hliníkovými víčky a bez nich. Tyto zkumavky se vyrábějí bez endotoxinů, jsou vyrobeny z borosilikátového skla a jsou určeny pro metodu gelových sraženin. Tloušťku skla lze speciálně kalibrovat podle toxinometru pro stabilní intenzitu a propustnost světla.

Dalším činidlem LAL uváděným na trh společností Wako je souprava KY Color Limulus. Toto činidlo bylo navrženo pro metodu KCA a lze jej použít jak v kinetické čtečce, tak v mikrotitrační čtečce. Obsahuje multi-testovací soupravu a jednoduchou testovací soupravu, z nichž každá je určena pro kolorimetrickou analýzu založenou na čase, s použitím syntetického substrátu, který vytváří žluté zbarvení a který může specificky detekovat endotoxin s vysokou citlivostí.

Bibliografie:

1) Iwanaga, S. Biochemical principle of Limulus test for detecting bacterial endotoxins. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 83(4), 110-119. [Sborník Japonské akademie, řada B, 83(4), 110-119]. (2007).

2) Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test of Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Dept. of Health & Human Services, FDA, prosinec (1987).

3) Katsuhito Inoue, Aya Takaoka, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 110 (1992), 6th Annual Meeting of the Japanese Society for Alternatives to Animal Experiments.

4) Katsuhito Inoue, Tomoaki Harada, Masakazu Tsuchiya, Shuji Matsuura: Excerpt 44 (1994), 21st Annual Meeting of the Society for Antibacterial and Antifungal Agents.

5) Tsuchiya, M.; Oishi, H.; Takaoka, A.; Fusamoto, M. y Matsuura, S. Discrimination between endotoxin and (1-3) beta-D-glucan using turbidimetric kinetic assay with Limulus amebocyte lysate. Chem Pahrm Bull (Tokyo), 38(9). 2523. (1990).

LAL PRODUCT LINE

LAL Reagent Kit	LAL Accessories

.