Od Elizabeth Burkeové

Úterý, 9. srpna 2016

Vědci používají ke zkoumání genetických příčin lidských nemocí různé laboratorní techniky. Ve výzkumu se často využívají buňky nebo vzorky tkání pacientů, ale ke zjištění, zda mutace v určitém genu může způsobit příznaky pacienta, často potřebujeme experimentální zvířecí modely.

Zatímco v minulosti byly běžnou volbou pro modelování lidských onemocnění myši a potkani, využití zebřiček rychle získává na popularitě. Překvapuje vás to? Dovolte mi to vysvětlit.

Co jsou to zebřičky?

Zebřičky jsou tropické sladkovodní ryby z čeledi mihulovitých. Ve volné přírodě se vyskytují v indických řekách a rybnících, v současné době jsou však často k dostání v obchodech se zvířaty. Název „zebřičky“ je odvozen od vodorovných modrých pruhů na obou stranách jejich těla.

Zebřičky, pojmenované tak kvůli svým pruhům, žijí nejraději ve velkých skupinách, kterým se říká hejna.

Jak lze na rybách modelovat lidská onemocnění?

Ačkoli se může zdát, že lidé jsou extrémně odlišní od zebřiček, ve skutečnosti jsme jim mnohem podobnější, než by se mohlo zdát. Ve skutečnosti se 70 % lidských genů nachází u zebřiček.

Mimo to mají zebřičky dvě oči, ústa, mozek, míchu, střeva, slinivku, játra, žlučovody, ledviny, jícen, srdce, ucho, nos, svaly, krev, kosti, chrupavky a zuby. Mnoho genů a kritických drah, které jsou nezbytné pro růst těchto znaků, je mezi lidmi a zebřičkami vysoce konzervováno. Jakýkoli typ onemocnění, který u člověka způsobuje změny v těchto částech těla, by tedy teoreticky mohl být modelován na zebřičkách.

Proč používat zebřičky, když můžete použít myši?

Přestože jsou myši evolučně podobnější lidem, protože jsou to savci, mají zebřičky oproti svým chlupatým konkurentům několik výhod.

Jednou z důležitých výhod zebřiček je, že dospělí jedinci jsou malí a preferují umístění ve velkých skupinách neboli „hejnech“. Díky tomu potřebují mnohem méně místa a jejich chov je levnější než chov myší.

V centru NIH Zebrafish Core jsou umístěny stovky tisíc zebřiček v nejmodernějším zařízení.

Další výhodou je, že dospělé zebřičky se snadno rozmnožují (přibližně každých 10 dní) a mohou produkovat až 50 až 300 vajíček najednou. To je zcela odlišné od myší, protože ty obvykle produkují vrhy o jednom až deseti mláďatech a za svůj život mohou mít jen přibližně tři vrhy. Vědecké experimenty se obvykle opakují několikrát, aby se prokázalo, že výsledky jsou správné, takže je užitečné mít zvíře, které může stále dokola produkovat velké množství potomků.

Zárodky zebřiček jsou také kladeny a oplodňovány externě, což umožňuje snadnou manipulaci s nimi různými způsoby. V případě potřeby lze provést oplodnění in vitro. Do oplozených vajíček v jednom buněčném stadiu lze snadno vpravit DNA nebo RNA a trvale tak změnit jejich genetickou výbavu za účelem vytvoření transgenních nebo knock-out linií zebřiček. Práce s myšmi tímto způsobem je mnohem složitější. Myší embrya se vyvíjejí uvnitř matky a pro přístup k nim a manipulaci s nimi by musela být matka obětována. Aby se embrya po oplodnění nebo injekci udržela naživu, musela by být transplantována i do jiné myší samice.

Larva zebřičky, vývojové stadium od tří do třiceti dnů po oplodnění, dorůstá délky přibližně od 3,5 do 8 milimetrů.

Embrya zebřiček jsou navíc průhledná, což vědcům umožňuje sledovat pod mikroskopem, jak z oplodněných vajíček vyrůstají plně zformovaná rybí mláďata. Jejich průhlednost také umožňuje vizualizaci fluorescenčně značených tkání u transgenních embryí zebřiček. Myší embrya průhledná nejsou a vyvíjejí se uvnitř matky, takže pozorování vývoje embrya v přímém přenosu jako u zebřiček není možné.

Je však omezeno, jaké typy onemocnění lze u zebřiček studovat. Lidská onemocnění způsobená geny, které u zebřiček neexistují, vyžadují jiný zvířecí model. Navíc zebřičky nejsou užitečným modelem pro lidská onemocnění, která se odehrávají převážně v typu tkáně nebo části těla, které zebřičky nemají (např. prostata, mléčné žlázy, plíce).

Jak přesně používáte zebřičky ke zkoumání lidských onemocnění?

Často se sekvenuje DNA pacienta, aby se našla mutace v genu, která by mohla potenciálně způsobovat příznaky jeho onemocnění. Aby se zjistilo, zda by ztráta funkce tohoto genu mohla způsobit příznaky pozorované u pacienta, je stejný gen zmutován nebo „vyřazen“ u zebřiček a poté jsou rybky vyšetřeny na podobné příznaky. Ačkoli je to mnohem obtížnější, lze přesnou mutaci, kterou má pacient, vnést i do zebřičky – tomu se říká „knock-in“.

Pokud se u modelu zebřičky knock-out nebo knock-in objeví jeden nebo více příznaků pacienta, lze zebřičku použít pro další studie, které pomohou určit, proč mutace v daném genu způsobuje onemocnění. Například struktura svalových vláken může být zkoumána na abnormality pod mikroskopem, pokud pacient trpí svalovým onemocněním. Nebo pokud příznaky onemocnění pacienta začaly během vývoje v děloze, lze u knock-out nebo knock-in embryí zebřiček zkoumat změny genové exprese (ve srovnání s embryi bez mutace), které by mohly vést k abnormálnímu vývoji. U pacienta s neurologickým onemocněním lze fluorescenčně označit neurony knock-out embryí a zjistit, zda se tvoří nesprávně.

Kromě využití modelů onemocnění zebřiček k charakterizaci lidských onemocnění mohou vědci také identifikovat a testovat nové léky k léčbě modelovaných onemocnění. Schopnost zebřiček vytvářet mnoho embryí při každém rozmnožování je činí obzvláště užitečnými pro vysoce výkonný screening léčiv.

Jaké jsou příklady lidských onemocnění, která byla úspěšně modelována na zebřičkách?

Bylo prokázáno, že vytvoření knock-out genu dystrofinu u zebřiček se velmi podobá závažnosti a průběhu lidského onemocnění Duchenneova svalová dystrofie. Bylo zjištěno, že pacienti s Duchennovou svalovou dystrofií nesou mutace v dystrofinu a vykazují v dětství svalovou slabost, která se postupně zhoršuje. Jak u lidí, tak u modelu zebřičky vede ztráta dystrofinu postupně k nekrotickým svalovým vláknům, která jsou nahrazována zánětlivými buňkami, fibróze a abnormální velikosti svalových vláken.

Tento obrázek ukazuje vizuální rozdíly ve svalech mezi larvou zebřičky divokého typu (A, B, C) a dystrofickou larvou (A‘, B‘, C‘). Zdroj: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3484855/

Lidský melanom byl také úspěšně modelován u zebřiček. Nejčastěji identifikovaná mutace u lidských melanomů – změna jedné aminokyseliny v genu BRAF – byla vytvořena u zebřiček jako knock-in model. Protože rakovina je způsobena kombinací několika genetických změn, byla tato knock-in linie zebřiček použita ke screeningu dalších potenciálních mutací způsobujících rakovinu. Když byla k BRAF knock-in zebřičce přidána další běžně pozorovaná melanomová mutace genu SETDB1, došlo k rychlému rozvoji melanomu. Tyto výsledky pomohly prokázat, že SETDB1 je důležitým genem při růstu melanomu.

Tyto příklady toho, jak se u lidí a zebřiček může projevit stejné onemocnění, přestože se zdánlivě lišíme, umožňují snadno pochopit, proč se zebřičky stávají dobře přijímaným zvířecím modelem. Zde v programu NIH Undiagnosed Diseases Program provádíme studie s využitím zebřiček jako jeden z několika přístupů ke zkoumání potenciální účasti změněných genů u extrémně vzácných onemocnění našich pacientů. Zatímco v minulosti byly převládajícím zvířecím mostem mezi pracovním stolem a lůžkem pacienta myši, nedávné studie ukázaly, že zebřičky mají potenciál sloužit jako schůdná alternativa k myším. Načasování přijetí zebřiček jako nově vznikajícího modelového organismu nemohlo být lepší, protože studie na myších se často nedaří převést na člověka. Ačkoli žádné zvíře nemůže dokonale modelovat lidskou nemoc, věřím, že tito malí pruhovaní plavci mají velký potenciál pro rozvoj lékařského výzkumu v budoucnosti.

Chcete-li se dozvědět více o tom, jak zebřičky přispívají k biomedicínské vědě a lidskému zdraví, navštivte webové stránky iniciativy Trans-NIH Zebrafish Initiative a NICHD Zebrafish Core.

.