Abstrakt

Chronická aktivní infekce virem Epsteina-Barrové (CAEBV) je závažné onemocnění s neobvyklou aktivací EBV, která přetrvává několik let, a její patogeneze je z velké části neznámá. Po vytvoření přesného a reprodukovatelného systému polymerázové řetězové reakce pro kvantifikaci EBV DNA byla stanovena virová nálož v lymfocytech periferní krve (PBL) u 54 dětí: 15 s CAEBV, 16 s infekční mononukleózou (IM) a 23 zdravých dětí. Děti s CAEBV a děti s IM měly vysokou virovou zátěž. Nižší nálož byla zjištěna u 47 % séropozitivních zdravých dárců. Mezi dětmi s CAEBV a dětmi s IM byly dva výrazné rozdíly: U prvně jmenovaných byla virová replikace vyšší (103-107 kopií/PBL)2,5 × 105 PBL) než u osob s IM a virová replikace u dětí s IM klesala, zatímco u osob s CAEBV přetrvávala aktivní replikace po celé roky. Přetrvávající vysoká virová nálož je možným diagnostickým kritériem pro CAEBV. EBV loads may enable classification and prognosis of EBV infections.

Epstein-Barrové virus (EBV) je původcem infekční mononukleózy (IM) a chronické aktivní EBV infekce (CAEBV). CAEBV je závažné onemocnění s neobvyklou aktivací EBV, které může být smrtelné s mnohočetným orgánovým selháním, a je spojeno s maligním lymfomem bez předchozí imunosuprese . Klinické příznaky CAEBV a sérologické abnormality odpovídající aktivní replikaci EBV, jako jsou výrazně zvýšené protilátky anti-EA-DR a absence protilátek proti jadernému antigenu Epsteina-Barrové (EBNA), přetrvávají měsíce až roky. EBV se replikuje v NK , T a B buňkách.

Po vzniku infekce EBV obvykle přebývá v B lymfocytech po celý život hostitele, aniž by vyvolával jakékoli klinické příznaky (označuje se jako latentní infekce). Proto je pro vyšetřování onemocnění EBV nezbytná nejen detekce, ale i kvantifikace EBV v postižených tkáních.

Pro objasnění stavu replikace EBV u osob s CAEBV jsme použili semikvantitativní DNA polymerázovou řetězovou reakci (PCR) k vyhodnocení a porovnání virové nálože v lymfocytech periferní krve (PBL) u 3 skupin dětí: jedné s CAEBV, jedné s IM a zdravých kontrol. Náš detekční systém byl považován za přesný a spolehlivý pro kvantifikaci EBV, protože jsme amplifikovali oblast EBV s jednou kopií. Většina předchozích studií se zaměřila na oblast BamHI-W, u níž je frekvence opakování tandemových repetic nestálá. Domníváme se, že tato studie je první a nejrozsáhlejší studií virové zátěže v PBL dětí s CAEBV.

Materiál a metody

Pacienti a kontroly

Vyšetřili jsme 16 dětí s IM (11 chlapců, 5 dívek; věk 0-8 let), 15 dětí s CAEBV (11 chlapců, 4 dívky; věk 4-19 let), 19 imunokompetentních EBV-seropozitivních zdravých osob (10 chlapců, 9 dívek; věk 1-19 let) a 4 séronegativní zdravé děti (3 chlapci, 1 dívka; věk 1-10 let). Všechny osoby s IM měly typické klinické projevy (např. horečku, tonzilitidu, lymfadenopatii, hepatosplenomegalii, jaterní dysfunkci a atypickou lymfocytózu). Diagnóza IM byla stanovena na základě sérologického nálezu protilátek IgM proti virovému kapsidovému antigenu (VCA) nebo sérokonverze VCA IgG a/nebo EA a negativních protilátek EBNA . Dvacet dva vzorků krve bylo odebráno 16 dětem s IM 8 dní až 8 měsíců po začátku onemocnění (počátečním příznakem byla u všech pacientů horečka). CAEBV byl diagnostikován podle Rickinsonových kritérií . Děti s CAEBV měly přerušovanou nebo přetrvávající horečku po dobu >16 měsíců, s hepatosplenomegalií, lymfadenopatií a/nebo kožní vyrážkou. Laboratorní nálezy vykazovaly zvýšené hladiny transamináz, anémii, trombocytopenii a/nebo polyklonální hypergamaglobulinémii. Sérologické vyšetření odhalilo výrazné zvýšení titrů protilátek proti VCA a EA. Infekce virem lidského imunodeficitu a revmatické onemocnění byly vyloučeny. Žádný subjekt neprodělal transplantaci ani nepodstoupil protinádorovou léčbu.

Vzorky

Byly odebrány 2ml heparinizované vzorky periferní krve. PBL byly izolovány pomocí ficollu-hypaqu a lyzovány pomocí 0,15 μg/μl proteinázy K (Boehringer-Mannheim, Indianapolis); DNA byla extrahována srážením fenol-chloroform-etanol. Extrahovaná DNA byla kvantifikována spektrofotometrem, upravena na 0,25 μg/μl DNA a použita jako PCR templáty.

Citlivost PCR

EBV DNA byly ze tří zdrojů: Raji, obsahující 50 kopií EBV na buňku ; Akata, obsahující 20 kopií na buňku; a klonované fragmenty BamHI-L, které byly smíchány s DNA z buněk pupečníkové krve a použity jako pozitivní standard. Pro stanovení citlivosti systému PCR byly sériové desetinásobné ředění (10°-104 kopií EBV) extrahované DNA podrobeny PCR.

PCR

Byla navržena vnořená dvojitá PCR k amplifikaci konzervované oblasti kódující gp220 (v rámci fragmentu BamHI-L) . Vnější pár primerů amplifikuje 302-bp fragment pomocí oligonukleotidů 5′-GCGAACTGGTGGACACATGA a 5′-AA-GTCCACAGGCAAATGCCA, které odpovídají pozicím 2870-3171 B95-8 (GenBank M10593). Vnitřní pár amplifikuje fragment o délce 239 bp . PCR byla provedena v 50 μl reakci obsahující 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 μM dNTP, 0,5 μM každého primeru, 2,5 U Taq DNA polymerázy (Boehringer-Mannheim) a 4 μl DNA vzorku. Amplifikované produkty byly naneseny na 2% agarózu a obarveny ethidium bromidem a k potvrzení specifity byl použit Southern blotting s použitím fragmentu BamHI-L jako sondy. Každá reakce PCR byla provedena ve třech opakováních a zahrnovala negativní kontrolu, aby se vyloučila křížová kontaminace. Pro potvrzení specifičnosti PCR byla analyzována DNA viru herpes simplex typu 1 a 2, viru varicella-zoster, lidského cytomegaloviru a lidských herpesvirů-6 a -7. Nebyla zaznamenána žádná specifická amplifikace.

Kvantifikace genomu EBV

Kvantita DNA EBV v PBL byla stanovena pomocí pokusů s limitním ředěním. Sériová desetinásobná ředění (1-10-6μg) genomové DNA extrahované z každého vzorku DNA byla podrobena vnořené PCR, jak je popsáno výše, a minimální hranice pro pozitivní výsledek byla převedena na virovou nálož (kopie/2,5 × 105 buněk).

Výsledky

Citlivost systému PCR byla pečlivě stanovena desetinásobným ředěním tří zdrojů DNA EBV: Raji a Akata, které oba obsahují konstantní počet kopií DNA EBV na buňku, a klonovaného fragmentu BamHI-L. Raji obsahuje 50 kopií genomu EBV na buňku a 1 μg genomové DNA z buněk Raji se rovná DNA extrahované z 2,5 × 105 buněk: tedy 1,25 × 107 kopií DNA EBV. DNA z Raji byla vhodně naředěna a DNA obsahující 10n kopií (sériové ředění 10°-104 kopií viru) byla podrobena amplifikaci. Byla zkoumána minimální hranice pro pozitivní výsledek PCR. Opakovaná vyšetření ukázala, že citlivost je 100 kopií na reakci s reprodukovatelností. Výsledky byly stejné při použití DNA Akata a při experimentu s ředěním s použitím 10n kopií fragmentů BamHI-L smíchaných s 105μg, 102μg a žádnou DNA z buněk pupečníkové krve.

Všechny PBL od subjektů s IM a CAEBV byly pozitivní na genom EBV. Devět (47 %) z 19 vzorků od zdravých osob se séropozitivitou na EBV bylo pozitivních. Všechny PBL od séronegativních osob byly negativní.

EBV DNA v PBL byla kvantifikována a porovnána u EBV-seropozitivních zdravých kontrol, dětí s IM a dětí s CAEBV (obrázek 1). U zdravých EBV-seropozitivních dětí byla virová nálož 100-1000 kopií na 2,5 × 105 PBL. V PBL dětí s IM se nejnižší hranice pozitivních výsledků PCR pohybovaly od 10° μg (2,5 × 105 PBL) do 10∼3μg (2,5 × 102/PBL) genomové DNA, což naznačuje, že nálož viru byla 100-100 000 kopií/2,5 × 105 PBL. Tři vzorky krve odebrané během měsíce po začátku onemocnění obsahovaly vyšší zátěž (1000-100 000 kopií/2,5 × 105 PBL). PBL odebrané >11 měsíců po začátku IM měly tendenci obsahovat snížené množství viru. Nálože viru jsme sledovali u 4 pacientů s IM (obr. 2A). U všech 4 se virová nálož během klinického průběhu snížila, ale byla vyšší (100-10 000 kopií/2,5 × 105 PBL) než u séropozitivních zdravých hostitelů.

V PBL dětí s CAEBV bylo zjištěno více EBV DNA než ve vzorcích od dětí s IM. Čtyři pacienti s CAEBV byli sledováni po dobu >16 měsíců (obrázek 2B znázorňuje nálezy u 2 pacientů). U dalších dvou pacientů se virová nálož po dobu 2-3 let neměnila (105 a 106 kopií/2,5 × 105 PBL). Všichni tito pacienti měli na rozdíl od nálezů u IM trvale vysokou virovou zátěž. Když jsme zkoumali vztah mezi klinickými projevy a náloží EBV, korelovala s náloží viru pouze horečka. Nebyla zjištěna korelace s hepatosplenomegalií, lymfadenopatií, exantémem, alergií na komáry, jaterní dysfunkcí, anémií, trombocytopenií ani titry sérových protilátek proti VCA, EA-DR a EBNA.

Diskuse

PCR kvantifikující EBV DNA prokázala, že PBL od dětí s CAEBV nebo IM měly vysokou virovou nálož, což svědčí o aktivní replikaci EBV v lymfocytech. Replikace viru byla považována za aktivnější u CAEBV než u IM; ve skupině IM replikace postupně klesala, zatímco u pacientů s CAEBV aktivní replikace přetrvávala roky.

Náš systém PCR amplifikuje sekvence specifické pro EBV kódující gp220, což je gen s jednou kopií ve viru, zatímco předchozí studie se zaměřovaly na vnitřní dlouhé opakování nacházející se v oblasti BamHI-W. Vzhledem k tomu, že při polyklonálním šíření EBV je počet opakování této oblasti nestálý, je náš systém považován za přesnější pro kvantifikaci EBV, i když méně citlivý pro detekci. Nedostatek nízké citlivosti byl překonán použitím vnořené PCR. Citlivost byla 100 kopií na reakci ve srovnání s 10 kopiemi v předchozí zprávě . Kvantifikovali jsme genomy EBV v PBL pomocí sériového ředění extrahované DNA. Náš systém kvantifikace EBV DNA pomocí sériového ředění extrahované DNA se ukázal jako reprodukovatelný a spolehlivý.

PBL odebrané dětem s IM a s CAEBV obsahovaly větší množství genomu EBV než PBL od zdravých séropozitivních kontrol. Z posledně jmenovaných mělo 47 % detekovatelnou EBV DNA (100-1000/2,5 × 105 PBL). U 2 subjektů byl EBV detekován ve vyšším množství než v předchozích studiích (1-50/106 PBL) . Vzhledem k tomu, že jsme studovali děti, může kratší doba po primární infekci přispívat k vyšší náloži EBV, než jaká byla pozorována v předchozích studiích u dospělých, což nám připomíná, že zejména u dětí zahrnují pozitivní výsledky PCR i asymptomatickou latentní infekci EBV.

Děti s IM měly velké množství EBV. Nálož EBV dosáhla vrcholu během měsíce po začátku onemocnění (1000-100 000 kopií/2,5 × 105 PBL) a poté postupně klesala, ale zůstala vysoká několik měsíců (⩽8) po začátku onemocnění ve srovnání s hladinami u zdravých kontrol. I po vymizení klinických projevů pokračovala v PBL relativně vysoká hladina replikace EBV.

U pacientů s CAEBV přetrvávalo velké množství EBV, což naznačuje, že chronická neregulovaná aktivní replikace EBV v PBL vede k závažnému onemocnění se špatnou prognózou. Faktory a mechanismy vedoucí k překvapivě aktivní replikaci viru zůstávají nejasné. Byly popsány různé heterogenní nedostatky v obranných systémech hostitele jak humorální, tak buněčné imunity, které by mohly umožnit aktivní replikaci viru. Vysoká virová nálož v PBL (>1300 000 EBV/105 PBL) byla prokázána u EBV asociovaného postransplantačního lymfoproliferativního onemocnění (PTLD), komplikace po transplantacích , ačkoli virová nálož během jednoho roku poklesla souběžně se zotavením z imunosuprese. Kvantitativní rozdíl v cirkulující náloži EBV koreloval s hladinou protilátek EBNA u PTLD, ale ne u CAEBV. Proto bylo chování EBV u PTLD považováno za podobné i odlišné od chování u CAEBV. Vzhledem ke klinickým projevům se CAEBV zdá být podobný lymfoproliferativnímu syndromu vázanému na chromozom X (XLP) , u kterého byl nedávno identifikován odpovědný gen. Na rozdíl od syndromu XLP však CAEBV není dědičné onemocnění a mohou jím být postiženy i ženy. K objasnění predispozičních faktorů pro aktivaci viru je nutná další imunologická analýza CAEBV.

K léčbě CAEBV byly použity – s neuspokojivými výsledky – acyklovir, interferon-α a interleukin-2 . Naše výsledky naznačují, že cytotoxické léky, které vyvolávají imunosupresi a zvyšují aktivaci viru, je třeba volit opatrně, přestože klinické příznaky jsou podobné jako u hematologických malignit. Přetrvávající vysoká nálož EBV v PBL je možným diagnostickým kritériem pro CAEBV a může být užitečná pro sledování aktivity onemocnění, pro klasifikaci onemocnění a pro předpověď prognózy.

Poděkování

Děkujeme Georgi Kleinovi (Mikrobiologické a tumorbiologické centrum, Karolinska Institute, Stockholm) za recenzi rukopisu a Sachi Takemoto a Ai Kitamura za zručnou technickou pomoc.

.