3.1. Systém paralelního ozařování světlem

LED jako zdroj paralelního světla vytváří válcovou paralelní osvětlovací plochu, která je podobná původnímu kondenzátoru s výhodami nízkých nákladů, dlouhého životního cyklu, dokonalého světelného výkonu a malého měřítka . Jak je znázorněno na obrázku 3, skutečné paralelní světlo lze získat díky lomu čočky . V ozařovací oblasti LED může čočka měnit směr a rozložení světla nastavením příslušné čočky tak, aby bylo získáno skutečné paralelní světlo (Obrázek 3).

Obrázek 3

Princip systému ozařování paralelního světla. Čočka 1 a čočka 2 zaostřují světlo vyzařované LED diodou. Poté zaostřené světlo prochází optickým tunelem a clonou a promítá se do čočky 3. Nakonec je skutečné paralelní světlo získáno čočkou.

3.2. Objektivy pro paralelní světlo jsou určeny k ozáření. Zobrazovací systém s vysokým rozlišením a automatickým zaostřováním

Tento systém se skládá z vysokorychlostní digitální kamery a systému automatického zaostřování. V současné době přesáhla rychlost zobrazování některých komerčních digitálních fotoaparátů 10 000 snímků za sekundu . Proto může zobrazovací systém s vysokým rozlišením dosáhnout sledování dynamických změn RI v roztoku v reálném čase. CCD kamera s vysokým počtem pixelů hraje důležitou roli při získávání obrazu mikročoček s vysokým rozlišením . Jádra systému automatického zaostřování se skládají z částí pro identifikaci obrazu, zpracování obrazu a řízení . Snímky shromážděné kamerovým systémem jsou analyzovány a je zobrazeno vyhodnocení zřetelnosti. Podle tohoto vyhodnocení je systém automaticky řízen do příslušné oblasti nebo směru, dokud rozlišení pořízených snímků nevyhoví předem nastavenému požadavku.

3.3. Automatický inteligentní systém rozpoznávání a analýzy obrazu

Automatický inteligentní systém analýzy provádí především rozpoznávání obrazu a analýzu dat na snímku mikročočky tak, aby sledoval okamžitou změnu v jejím obraze, a tím odvodil změnu indexu lomu roztoku vzorku během procesu reakce antigen-protilátka. Jeho přesnost úzce souvisí s kvalitou obrazu a parametry, jako jsou pixel, velikost pixelu a rozlišení, přímo ovlivňují měření RI . Pokud se využije digitální kamera CCD s ≥ 10 miliony pixelů a malou velikostí pixelu, která dosahuje méně než 3 nm, a mikročočka s poloměrem 600 μm, změna indexu lomu se určuje pomocí změn poměru středové jasné skvrny a poměru poloměru vnějšího prstence, takže měřená změna indexu lomu může dosáhnout 10-6 .

3,4 . Systém regulace teploty

Systém regulace teploty je tvořen průhlednou deskou z tvrzeného skla s tenkou vrstvou oxidu india a řízen vysokou přesností PID (proporcionálně-integračně-derivačního) regulátoru teploty. Umožňuje, aby teplota vzorku ve vícejamkové mikrotitrační destičce rychle dosáhla nastavené hodnoty během 2 min a byla udržována v rozmezí změn 0,1 °C pro zefektivnění reakce antigen-protilátka .

3.5. Mikrotitrační testovací destička

Mikrotitrační destička s více jamkami je speciálně navržena pro mikrotitrační imunoanalytický přístroj. Je vyrobena z polymethylmetakrylátového (PMMA) materiálu a je obvykle připravena jako 2 nebo 16 lichoběžníkových jamek, aby vyhovovala různým požadavkům na detekci. Uvnitř každé jamky je na jejím dně mikročočka o poloměru několika set mikrometrů. Použití destičky s mikročočkami poskytuje objektivní podmínky pro vícekanálovou detekci. Vzhledem k tomu, že průměr spodní strany jamky je jen asi 2 mm, stačí k utopení mikročočky pro detekci antigenu a protilátky několik mikrolitrů roztoku vzorku.

4. Aplikace zobrazovacího systému imunitních mikrosfér

4.1. Zobrazovací systém imunitních mikrosfér Měření reakce antigen-protilátka

Huang a jeho kolegové detekovali různé typy reakcí antigen-protilátka a zjistili jejich pravidelné vlastnosti. Za prvé, index lomu se v procesu reakce antigen (Ag)-protilátka (Ab) měnil s reakční dobou. Za druhé, ve změně RI s reakční dobou existovaly tři fáze, včetně rychle rostoucího, relativně stabilního a pomalu klesajícího období. První fáze souvisela s kombinací Ag a Ab, takže RI se náhle zvýšil při rychlé kombinaci Ag a Ab za vzniku komplexů. Maximum RI je ve druhé fázi. Za třetí, koncentrace Ag nebo Ab měla velký vliv na RI. Získáním změny RI v závislosti na koncentraci Ag nebo Ab lze tedy pomocí fitovací křivky vypočítat jejich obsah v testovaných vzorcích. Za čtvrté, různé protilátky, jako jsou zachycující Ab a sondážní Ab, by rovněž ovlivnily změnu RI. Při použití této techniky k měření reakcí antigen-protilátka pomocí několika systémů Ag-Ab byly zjištěny vztahy mezi změnou indexu lomu a koncentrací několika typů roztoků antigen-protilátka (interferon-γ (IFN-γ) Ag-Ab, placentární alkalické fosfatázy (PAP) Ag-Ab, kallikreinu 6 (KLK6) Ag-Ab, lidského choriového gonadotropinu (HCG) Ag-Ab, srdečního troponinu (cTnI) Ag-Ab, proteinů vázajících mastné kyseliny (FABP) Ag-Ab a C-reaktivního proteinu (CRP) Ag-Ab) (obrázek 4). Jelikož víme, že asociace a disociace komplexu antigen-protilátka je dynamický proces, na základě křivky závislosti RI vs. času a výpočtu derivace s časem lze také získat informace o konstantách rychlosti asociace a disociace a (obrázek 4 a)) a dalších termodynamických parametrech pomocí následující rovnice:

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Obrázek 4

Změny indexu lomu s antigenem-reakcí s protilátkami. (a) Vztahy mezi indexem lomu reakce IFN-γ nebo PAP antigen-protilátka a její dobou. (b) Vztahy mezi a koncentrací antigenu KLK6 nebo CRP byly stanoveny, když byla k příslušnému antigenu přidána jeho monoklonální Ab nebo polyklonální Ab. (c) Byly analyzovány vztahy mezi a HCG a koncentracemi antigenu cTnI nebo FABP, resp. když byla k odpovídajícímu antigenu přidána jeho záchytná Ab nebo sondážní Ab. Ag: antigen; Ab: protilátka; : změna indexu lomu; IFN-γ: interferon-γ; PAP: placentární alkalická fosfatáza; KLK6: kallikrein 6; HCG: lidský choriový gonadotropin; cTnI: srdeční troponin; FABP: proteiny vázající mastné kyseliny; CRP: C-reaktivní protein.

4.2. Ukázka z obrázku č. 1. Měření klinických vzorků

K testování klinických vzorků byla dále využita technika zobrazování imunitních mikrosfér. Pomocí této bylo zjištěno 36 klinických vzorků na koncentrace CRP Ag. Její relativní směrodatná odchylka je ve srovnání s imunochromatografií přibližně 2-10 % a korelační koeficient mezi výsledky získanými oběma způsoby dosahuje hodnoty až 0,989 (obr. 5). Je dobře známo, že klinicky hemolyzované vzorky séra mohou výrazně ovlivnit přesnost výsledků zjištěných tradičními metodami. Naopak obrazy mikročoček v hemolyzovaných vzorcích jsou touto technikou stále zřetelné. Relativní chyby mezi zjištěnými hodnotami antigenu ve vzorcích s hemolýzou a bez hemolýzy jsou jen asi 2 %, což ukazuje na menší vliv hemolyzovaných vzorků séra na přesnost výsledků .

Obrázek 5

Měření 36 klinických vzorků na antigen C-reaktivního proteinu pomocí zobrazování imunitními mikročočkami ve srovnání s imunochromatografií

5. Proveditelnost zobrazování imunitními mikrosférami pro detekci antigenů a protilátek

Většina antigenů jsou proteiny, zatímco několik z nich jsou polysacharidy, nukleové kyseliny a jiné látky, a všechny protilátky jsou proteiny. Protože bílkovina obsahuje velké množství amido a karboxylových skupin, způsobují tyto polární skupiny, že koloidní částice vytvářejí elektrický náboj v důsledku elektrostatického působení a částice se stejným nábojem se navzájem odpuzují. Současně polární skupiny, které jsou silně hydrofilní, reagují s molekulami vody a vytvářejí hydratační vrstvu za vzniku hydrofilního koloidu, což zajišťuje, že protein neaglomeruje a nevytváří sraženinu, takže koloidní částice jsou rovnoměrně rozptýleny v roztoku .

Při kombinaci antigenu s protilátkou se elektrický náboj koloidních částic snižuje nebo mizí a hydratační vrstva také mizí nebo se ztenčuje. Protein se změní z hydrofilního na hydrofobní koloid . V prostředí elektrolytu koloidní částice dále aglomerují a vytvářejí komplexy antigen-protilátka, které si lze uvědomit očima . Indexy lomu hydrofilního a hydrofobního koloidu se nápadně liší. Proto lze touto technikou sledovat dynamické změny indexu lomu a posoudit, zda v roztoku dochází k reakcím antigenu a protilátky. Podle vztahu mezi koncentrací antigenu a protilátky a jejich reakční dobou lze stanovit standardní křivku. S procesem reakce antigenu a protilátky se komplex zvětšuje a změna indexu lomu je rovněž zřetelnější. Pomocí standardní křivky lze snadno kvantifikovat koncentraci detekované protilátky nebo antigenu.

Bylo prokázáno, že protilátka, která je komplementární k epitopům různých antigenů, skutečně vyvolá podobný přírůstek RI v reakci Ag-Ab při zobrazovací imunoanalýze mikročočkami. Jak je znázorněno na obrázcích 4b) a 4c), měření antigenu bylo provedeno s použitím záchytné Ab a sondovací Ab nebo monoklonální Ab a polyklonální Ab pro určitý antigen. Z křivek je patrné, že mezi oběma druhy protilátek nebyl významný rozdíl v indukci změny během reakce Ag-Ab, což naznačuje, že mikročočková zobrazovací imunoanalýza může pro detekci používat různé druhy protilátek, buď záchytné nebo sondovací Ab a monoklonální nebo polyklonální Ab. Nicméně monoklonální Ab se pro mikročočkovou zobrazovací imunoanalýzu upřednostňuje, protože nejenže vyvolává větší reakci díky své vyšší afinitě k antigenu, ale také snižuje možnost falešné pozitivity křížové reakce, takže antigeny lze detekovat při nižších koncentracích. Celkově je křížová reakce u této techniky teoreticky nevyhnutelná, stejně jako u jiných prostředků používaných v imunoanalýze. Jinými slovy, specifičnost zobrazování imunitními mikročočkami zcela závisí na specifičnosti vybraných protilátek proti cílovému antigenu. Proto je velmi důležité provést screening vhodných protilátek a optimalizovat reakční systém Ag-Ab.

6. Závěry

Tato technika zobrazování imunitními mikročočkami může rychle a přesně měřit RI různých vzorků a sledovat změny RI v reálném čase v procesu reakce antigenu a protilátky. RI se mění se změnami koncentrace Ag nebo Ab. Podle změny RI v závislosti na koncentraci Ag nebo Ab lze tedy kvalitativně a kvantitativně vypočítat obsah vzorků bez jakéhokoli značení, předmodifikace, promývání a drahých enzymů. Ve srovnání s běžnými způsoby detekce jsou výhody této metody přesné, spolehlivé, rychlé (hotové během několika minut) a jednoduché bez znečištění. Kromě toho je její detekční limit pouhých pg/ml, což k provedení detekce vyžaduje pouze několik μl, a je vhodná i pro hemolyzované klinické vzorky, které se tradičními metodami obtížně detekují. Navíc je neinvazivní vůči vzorkům. Přístroj pro mikrosférickou imunoanalýzu tvoří paralelní světelný ozařovací systém, kamerový systém s vysokým rozlišením, automatický inteligentní analytický systém, systém automatického zaostřování, systém řízení teploty a porézní detekční deska s mikročočkami. Je malý a snadno přenosný.

Je dobře známo, že reakce antigen-protilátka je značně ovlivněna vlastní koncentrací, teplotou, pH a roztokem elektrolytu. Z tohoto důvodu jsou tyto faktory v zobrazovacím systému s mikročočkami zohledněny, aby byla data stabilní díky vyrovnávání jejich změn. Tento systém lze optimalizovat například výběrem vhodných materiálů pro testovací destičku, která nabízí místo reakce antigen-protilátka, a tím, že destička bude hydrofilní, aby se zabránilo hydrofobním interferencím. Přesnost detekce lze dále zlepšit úpravou poměru antigen-protilátka, výběrem vhodného ředidla, modifikací pomocí iontů kovů atd.

Detekce antigenu a protilátky je poměrně významná v oblastech biomedicínského vyšetřování, klinické diagnostiky, analýzy léčiv, bezpečnosti potravin a monitorování životního prostředí. Vzhledem k obavám lidí o zdraví životního prostředí, bezpečnost potravin a zdravotní péči se vývoj citlivého přístroje s nízkými náklady, vysokou přesností, malými rozměry, přenosností a jednoduchou obsluhou stal naléhavou společenskou potřebou. Tato technika zobrazování imunitními mikročočkami je tedy slibná pro široké použití v různých oblastech a je vhodné ji popularizovat zejména v komunitě a na venkově.

Konflikty zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke střetu zájmů.

Příspěvky autorů

Jiahui Liang a Xiaotian Ye se na této práci podíleli stejnou měrou.

Poděkování

Děkujeme Guangzhou City Science and Technology Program Synergistic Innovation Major Project (číslo grantu: 201604020146) a National Natural Science Foundation of China (čísla grantů: 81172824 a 30971465) za jejich finanční podporu.

Příspěvky autorů

Příspěvky autorů

Příspěvky autorů

Příspěvky autorů

Příspěvky autorů

Poděkování