V posledním desetiletí umožnil pokrok v genomových technologiích identifikaci molekulárních mechanismů biologických procesů a onemocnění, což má dopad na všechny oblasti klinického výzkumu, zejména na rakovinu. Intratumorální heterogenita, dynamické změny v genomu nádorových buněk a genetické aberace jsou jedinečnými otisky prstů pro každý typ rakoviny . Tyto rysy rakoviny v kombinaci s prognostickou klasifikací podtypů a stratifikací rizika ukázaly, že profilování genové exprese umožňuje lépe pochopit molekulární pozadí například prognózy a citlivosti na terapii u rakoviny. Kromě toho je profilování genové exprese účinným molekulárním přístupem k předvídání citlivosti na léky .

S cílem vytvořit katalogy genomických změn u různých typů rakoviny se rozvíjejí koordinované rozsáhlé projekty genomiky rakoviny. Dva hlavní projekty jsou Cancer Genome Atlas (TCGA) a International Cancer Genome Consortium (ICGC) , zahrnující mnoho center využívajících různé platformy k poskytování informací z oblasti genomiky rakoviny, jako je genová exprese, mutace DNA, metylace DNA, exprese proteinů a klinické údaje. Tyto projekty poskytují velké množství genomických údajů, které pomáhají výzkumným pracovníkům při vytváření nebo testování nových hypotéz, jež mohou v konečném důsledku pomoci při vývoji nových způsobů léčby rakoviny, diagnostických metod a preventivních strategií . Zkoumání, integrace a analýza velkého množství komplikovaných dat je však náročná, zejména pro vědce, kteří nemají zázemí ve výpočetním programování nebo informatice.

Efektivní využití velkého množství dat o nádorových genomech zůstává výzvou kvůli omezením výpočetních metodik a nedostatečným pokynům. Vizualizace dat je pro efektivní analýzu dat velmi užitečná a byly vyvinuty pokročilé nástroje, které vizualizaci dat usnadňují, například volně přístupné portály cBioPortal, UCSC Cancer Browser a canEvolve (tabulka 1). Portály s otevřeným přístupem však usnadňují především zkoumání velkých souborů dat a někdy jsou omezené při jejich hlubším zkoumání. Zde popisujeme jednoduchou, ale účinnou metodu pro zkoumání podskupin vzorků nebo pacientů se specifickým genetickým, biologickým nebo klinickým zájmem. Zaměřujeme se na profilování genové exprese a představujeme metodu pro analýzu údajů o genové expresi ve vztahu k metylaci DNA a expresi proteinů (tabulka 2), kterou lze integrovat k testování výzkumných hypotéz pro specifické typy rakoviny.

Materiály & metody

Protokol pro in silico profilování genové exprese

Profilování genové exprese je výkonná technika pro studium biologických procesů na molekulární úrovni. Aktivitu nebo expresi genů lze hodnotit pomocí identifikace proteinů, ale exprese genů se obvykle zkoumá pomocí zkoumání zprávy nebo transkriptu RNA. Dvě vysoce výkonné metody, které se běžně používají pro komplexní profilování genové exprese, jsou sekvenování RNA pomocí sekvenování nové generace (NGS) a DNA mikročipy .

V obecné rovině existují dva typy přístupů ke genové expresi u nádorových onemocnění: diferenciální a relativní analýza. Při diferenciálním přístupu se objasňují profily nádorové exprese vzhledem ke srovnatelným nebo nesrovnatelným vzorkům normální tkáně, zatímco relativní přístup porovnává hladiny transkriptů napříč typy nádorů nebo vzorky buněk a tkání. V závislosti na konkrétním přístupu může profilování genové exprese vzorků a vzorků poskytnout poznatky nejen o biologii, ale také podrobnosti o struktuře, změnách a variacích transkriptů . Mnoho portálů s otevřeným přístupem usnadňuje nástroje pro zkoumání dat o genové expresi. Náš protokol je ilustrován nástrojem, který poskytuje cBioPortal . Pro zkoumání genomických dat lze podobně použít i další portály s otevřeným přístupem, jako je UCSC Cancer Browser a canEvolve. V dalších kapitolách uvádíme protokol krok za krokem (Supplemental Protocol):

	Přehled a výběr souboru dat o rakovině, který je předmětem zájmu (cBioPortal);
	Vytvoření souborů případů/podsouborů zájmu v rámci jedné studie;
	Integrativní analýza genů v rámci jedné studie. Po definování zájmové studie rakoviny v oddíle 1 a vytvoření podskupin vzorků/pacientů s klinickými nebo genetickými údaji, které jsou předmětem zájmu, v oddíle 2. Tento oddíl klasifikuje každý gen v každém vzorku a používá se pro veškerou analýzu a vizualizaci genomických dat;
	Sběr dat o expresi genů a proteinů;
	Sběr metylačních dat;
	Korelační analýza. Za účelem zkoumání korelace mezi expresí genu a buď metylačním stavem, nebo hladinou proteinu poskytuje tato část nástroj pro vykreslení vztahu;
	Grafická vizualizace a statistická analýza. Vizualizace a analýza případových souborů dat exprese mRNA, metylace nebo exprese proteinů shromážděných v oddíle 5 nebo dat korelační analýzy oddílu 6.

Výsledky & diskuse

Reprezentativní výsledky

Mutace v genu IDH1 jsou ancestrální událostí při vzniku gliomu nízkého stupně a sekundárního glioblastomu . Přítomnost mutace IDH1 (IDH1MUT) je spojena s prodlouženým přežitím pacientů s gliomem ve srovnání s pacienty s divokým typem IDH1 (IDH1WT) . S využitím možností klinických výsledků portálu cBioPortal je přežití znázorněno v grafu celkového přežití s přibližně šestinásobným prodloužením přežití pacientů s gliomem IDH1MUT ve srovnání s pacienty s gliomem IDH1WT (obrázek 1).

IDH1MUT vyvolává metabolické změny, které nejsou zcela pochopeny, ale zkoumání rozdílů v hladinách exprese metabolických enzymů je slibným výzkumným přístupem. Vliv IDH1MUT na expresi genů, které kódují metabolické enzymy, nabízí příležitost demonstrovat možnosti portálu cBioPortal k provádění integrace, průzkumu a analýzy dat. TCGA nabízí ke zkoumání a integraci pro analýzu data 112 vzorků IDH1WT versus 399 vzorků IDH1MUT gliomů nízkého stupně (LGG) a 157 vzorků IDH1WT versus devět vzorků IDH1MUT glioblastomů.

V oblasti metabolismu glukózy byly vybrány geny, které kódují metabolické enzymy omezující rychlost: GLUT1/3, HK1, HK2, HK3, PKLR, PKM2, LDHA a LDHB. Ve vzorcích IDH1WT versus IDH1MUT LGG a pacientů s glioblastomem byly pozorovány vyšší úrovně genové exprese pro GLUT3, HK2, PKM2 a LDHA (obr. 2), což naznačuje, že IDH1WT gliomy jsou při produkci ATP více závislé na glykolýze než IDH1MUT gliomy.

Jelikož se mutace v IDH1/2 vyskytují také u 20 % pacientů s myeloidními nádory včetně AML, je na obrázku 3 uveden příklad analýzy exprese mRNA tří skupin, IDHWT, IDH1MUT a IDH2MUT. Studie akutní myeloidní leukemie (AML; TCGA, Provisional) nabízí 136 IDHWT, 16 IDH1MUT a 16 IDH2MUT vzorků AML ke zkoumání profilů genové exprese. Na obrázku 3 jsou uvedeny hladiny exprese mRNA genu ATM, proteinu reagujícího na poškození DNA , ve vzorcích AML IDHWT, IDH1MUT a IDH2MUT, což ukazuje, že exprese mRNA ATM je u AML IDH1MUT výrazně snížena.

Další příklad ilustruje obrázek 4, na kterém je graf exprese genu v závislosti na metylaci DNA genu LDHA v LGG. Nižší hladiny exprese genu LDHA pozorované u gliomu IDH1MUT souvisely s hypermetylací jeho promotoru (obrázek 4A), ale nižší hladiny exprese genu LDHB u IDH1WT s metylací nekorelovaly (obrázek 4B).

Pro zkoumání, zda hladiny exprese genů korelují s množstvím proteinů, je na obrázku 5 uveden názorný příklad. U gliomu IDH1MUT byly pozorovány nižší hladiny genové exprese G6PD ve srovnání s gliomem IDH1WT (obrázek 5A), zatímco hladiny proteinu G6PD byly u IDH1MUT a IDH1WT LGG stejné (obrázek 5B), což naznačuje působení dalších posttranslačních mechanismů .

Neustálé inovace výrazně napomohly rozšíření našich znalostí o rakovině, ale také proměnily výzkum rakoviny v jednu z nejnáročnějších oblastí biologie na data. Dobře strukturované a organizované projekty nádorové genomiky nabízejí výzkumným pracovníkům obrovské množství vzorků nádorů, které jsou podobným způsobem připravovány, normalizovány a zpracovávány pro výpočetní analýzu s cílem rozšířit naše chápání genetiky rakoviny. Protokol, který je zde uveden, v kombinaci s nástroji s otevřeným přístupem snižuje bariéry přístupu k těmto komplexním datům a nabízí dolování dat do větší hloubky, aby se urychlil převod genomických dat do nových biologických a klinických poznatků.

Projekt nádorové genomiky gliomu byl jedním z prvních projektů TCGA, který poskytl dobře strukturovaná data nádorových vzorků z více platforem. Genomická analýza těchto dat identifikovala klinicky relevantní podtypy glioblastomu a vymezila tři různé molekulární třídy u gliomů nízkého stupně, včetně třídy s mutací IDH . Portály s otevřeným přístupem usnadňují přístup k těmto souborům dat, ale jsou omezené při zkoumání specifických skupin. Protokol, kterým se zabývá tento článek, popisuje jednoduchou metodu zkoumání podskupin vzorků nebo pacientů se specifickým genetickým, biologickým nebo klinickým zájmem, jako jsou vzorky nádorů s mutací IDH. Za druhé protokol popisuje, jak v této konkrétní podskupině vzorků vytvořit expresní profily genů zapojených do určité dráhy nebo procesu, jako je metabolismus. To umožňuje výběr jednotlivých genů zájmu namísto zkoumání všech genů a klasifikuje každý gen v každém vzorku, který je použit pro analýzu a vizualizaci. Nakonec je k dispozici vícerozměrná analýza, která umožňuje zkoumat expresi genů ve vztahu k metylaci DNA a expresi proteinů.

V porovnání s jinými dostupnými nástroji využívá tento protokol nástroje webového rozhraní, které nevyžadují další software. Kritickým krokem protokolu je výběr správné studie nebo projektu nádorové genomiky, který obsahuje údaje, jež jsou předmětem zájmu. V současné době mnoho portálů uchovává data ze souborů dat z literatury a portálu TCGA. Jako příklad lze uvést portál cBioPortal, který v současné době poskytuje 76 projektů nádorové genomiky genové exprese (RNAseq a microarray) v kombinaci s 21 projekty metylace a 41 projekty exprese proteinů. Validita porovnání genomických dat závisí na tom, jak dobře je vzorek přizpůsoben referenci z hlediska technických (např. typ zpracování dat) a biologických (např. molekulární podtyp) zkreslení. Proto použití portálů, které poskytují genomická data z dobře strukturovaných onkologických genomických projektů, nevyžaduje žádné pokročilé normalizační techniky a dávkové korekce.

V souhrnu naše metoda umožňuje import a integraci selektivní podskupiny vzorků se specifickým genomickým, biologickým nebo klinickým zájmem, jako jsou genomické změny, mutace, podtypy nádorů nebo vlastnosti přežití. Tato metoda obsahuje jedinečnou koncepci generování profilů genové exprese a propojení těchto profilů s metylací DNA a expresí proteinů, které lze integrovat k testování výzkumných hypotéz u specifických podtypů rakoviny.

Perspektiva do budoucna

Výzkum rakoviny se vyvinul v jednu z nejnáročnějších disciplín biologie na data. Projekt GENIE (Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange) patří k dosud největším plně veřejným souborům genomických dat o rakovině. Snadno spravovatelné portály, jako je cBioPortal, budou v této disciplíně hrát stále zásadnější roli.

.