Study design

V této dvouramenné, dvojitě zaslepené, randomizované studii provedeme nábor 60 těhotných žen ve věku 19-42 let žijících ve Vancouveru, BC, Kanada. Účastnice budou randomizovány k dennímu doplňování po dobu 16 týdnů buď 0,6 mg/den kyseliny listové, nebo ekvimolární dávky (0,625 mg/den) kyseliny (6S)-5-methyltetrahydrofolové (obr. 2). Dávka 0,6 mg bude odpovídat hladinám zjištěným v předních komerčních značkách prenatálních vitamínů (Materna®), čímž se zvýší zobecnitelnost našich zjištění. Šestnáctitýdenní intervence byla založena na odhadovaném poločasu rozpadu folátu v RBC a má umožnit měření dlouhodobého stavu folátu v RBC (po 12-16 týdnech) . Všichni účastníci budou rovněž dostávat prenatální multivitamín, který neobsahuje foláty, aby se zajistil dostatek dalších živin (např. železa) během těhotenství. Na začátku a na konci těhotenství budou odebrány vzorky žilní krve nalačno k měření primárních cílových ukazatelů, včetně sérového folátu, RBC folátu a plazmatického UMFA; průzkumné ukazatele budou zahrnovat plazmatický S-adenosyl-methionin, S-adenosyl-homocystein, celkový homocystein, celkový cystein, methionin, vitamin B12, pyridoxal-5-fosfát, volný cholin a betain. Bude rovněž stanoven genotyp variant MTHFR (677 C > T, rs1801133, a 1298 A > C, rs1801131) a DHFR (rs1643649 a rs70991108) a kompletní krevní obraz. Ženy budou mít možnost pokračovat v poporodní (průzkumné) fázi studie, kdy při závěrečné návštěvě dostanou další doplňky stravy, které budou užívat přibližně do 1 týdne po porodu. Ve dnech 5-7 po porodu ženy poskytnou malý vzorek mateřského mléka (3 ml) a vzorek žilní krve bez příjmu potravy. Výsledky hodnocené v mateřském mléce budou zahrnovat formy folátu (UMFA, THF, 5-methyl-THF, 5-formyl-THF a 5,10-methenyl-THF) a mléčný FBP. Výsledky hodnocené ve vzorku krve po porodu budou zahrnovat RBC folát a UMFA v plazmě. Protokol studie byl vypracován v souladu se standardními položkami protokolu z roku 2013: Doporučení pro intervenční studie (SPIRIT) (obr. 3) . Další podrobnosti viz doplňkový soubor 1 (SPIRIT Checklist).

Běhový diagram účastníků

Standardní položky protokolu: Doporučení pro intervenční studie (SPIRIT) plán zařazení, intervencí a hodnocení

Primárním cílem této pilotní studie je získat odhady změny sérového folátu, RBC folátu a UMFA po suplementaci kyselinou (6S)-5-methyltetrahydrofolovou a kyselinou listovou po dobu 16 týdnů těhotenství, aby bylo možné navrhnout dostatečně silnou definitivní studii. Sekundárním cílem je získat údaje o náboru a míře účasti, které pomohou při navrhování a proveditelnosti definitivní studie. Průzkumnými cíli poporodní fáze je kvantifikovat podíl celkového množství folátu v mateřském mléce ve formě kyseliny listové v každé skupině, vyhodnotit korelaci mezi UMFA v plazmě matky po porodu a kyselinou listovou v mateřském mléce a vyhodnotit koncentrace folátu v RBC po porodu v každé skupině.

Účastníci, nábor a informovaný souhlas

Kritéria pro zařazení: (1) těhotná žena (jednočetné těhotenství); (2) žijící v oblasti Vancouveru; (3) ≤ 21. týden těhotenství v době souhlasu; (4) ve věku 19-42 let; a (5) schopná poskytnout informovaný souhlas.

Kritéria vyloučení: (1) již existující zdravotní stavy, o nichž je známo, že ovlivňují stav folátů u matky (malabsorpční a zánětlivá střevní onemocnění, aktivní celiakie, operace žaludečního bypassu, atrofická gastritida, epilepsie, pokročilé jaterní onemocnění, dialýza ledvin, diabetes mellitus 1. nebo 2. typu, srpkovitá anémie) ; (2) faktory životního stylu, o nichž je známo, že ovlivňují stav folátů u matky (současné kouření, konzumace alkoholu, rekreační užívání drog) ; (3) střední až vysoké riziko vzniku těhotenství postiženého NTD (týká se žen nebo jejich mužského partnera: osobní nebo rodinná anamnéza (rodiče nebo sourozenci) jiných vrozených anomálií citlivých na foláty, osobní anamnéza NTD nebo předchozí těhotenství postižené NTD) ; (4) léky, o nichž je známo, že interferují s metabolismem vitaminů B (chloramfenikol, methotrexát, metformin, sulfasalazin, fenobarbital, fenytoin, primidon, triamteren, barbituráty) ; (5) index tělesné hmotnosti (BMI) před těhotenstvím ≥ 30 kg/m2; nebo (6) alergie na některou ze složek studijního doplňku.

Velikost vzorku

Velikost vzorku byla vypočtena na základě primárního cíle odhadnout rozložení (průměr ± směrodatná odchylka) změny primárních výsledků (sérový folát, RBC folát a UMFA) po 16 týdnech suplementace. K dosažení tohoto cíle budeme potřebovat 50 žen (25 v každé skupině); vzorek o velikosti alespoň n = 50 je obecně uznáván jako dostatečný pro pilotní studie klinického výzkumu . K tomu bude připočtena 20% inflace zohledňující odpadlé účastnice nebo ztrátu při sledování; celkem tedy bude rekrutováno 60 žen (30 v každé skupině).

Recruitment

Plakáty budou vystaveny v BC Women’s Hospital, na lékařských a prenatálních klinikách a v maloobchodních zařízeních pro těhotné ženy (např. prenatální kurzy, fitness studia, obchody s těhotenským oblečením) po celém Vancouveru, BC, Kanada. Podrobnosti o studii budou sděleny personálu a zdravotnickým pracovníkům, včetně lékařů, porodních asistentek, zdravotních sester a případně dalších. Bude využita reklama na sociálních sítích (Facebook a Instagram), která bude zaměřena na těhotné ženy ve věku 19-42 let v širší oblasti Vancouveru, BC.

Získání informovaného souhlasu a potvrzení způsobilosti

Ženy, které mají zájem o účast, budou kontaktovat přímo koordinátora výzkumu (KMC). Při té příležitosti budou popsány podrobnosti studie, způsobilost a informovaný souhlas. Způsobilým účastnicím, které budou chtít být zařazeny do studie, bude přiděleno identifikační číslo studie a bude naplánována jejich základní návštěva. Účastníci budou poučeni, aby pokračovali v jakékoli stávající prenatální multivitaminové/folátové suplementaci až do své základní návštěvy. Nepovinná poporodní fáze studie bude popsána ve formuláři informovaného souhlasu; účastníci, kteří se rozhodnou pokračovat po uplynutí základních 16 týdnů, však dostanou k podpisu samostatný formulář souhlasu.

Návštěvy ve studii

Návštěvy ve studii budou umožněny ve Vancouveru, BC, Kanada v budově University of British Columbia, Food, Nutrition and Health Building a v jednotce pro hodnocení klinického výzkumu v BC Children and Women’s Hospital. Výchozí stav (8.-21. týden těhotenství): Účastník i koordinátor výzkumu (KMC) podepíší formulář informovaného souhlasu; kopie bude naskenována a zaslána účastníkovi e-mailem po návštěvě studie. Účastnice vyplní základní dotazník, který zachytí zdravotní a výživovou anamnézu a demografické údaje. K výpočtu DFE bude použit validovaný dotazník o frekvenci stravování . Hmotnost a výška budou změřeny pomocí elektronické váhy a stadiometru a zaznamenány s přesností na 0,1 kg a 0,10 m. Bude odebrán vzorek žilní krve o objemu 12 ml na lačno po dobu 3 hodin. Účastníci budou dostávat studijní doplňky stravy (buď kyselinu listovou, nebo kyselinu (6S)-5-methyltetrahydrofolovou) a bude jim poskytnut deník pro zaznamenávání denního příjmu doplňků stravy. Střední bod: Po 8 týdnech budou všechny ženy kontaktovány za účelem kontroly dodržování pravidel, řešení případných otázek nebo problémů a naplánování závěrečné návštěvy. Závěrečná návštěva (24.-37. týden těhotenství): bude odebrán vzorek 12 ml žilní krve na lačno po dobu 3 hodin, změřena hmotnost, jak je popsáno výše, a účastnice vyplní závěrečný dotazník, aby zjistily jakékoli změny zdravotního stavu nebo užívání léků od výchozího stavu. Účastníci vrátí svůj doplňkový deník a všechny zbývající kapsle budou spočítány. Po porodu: Při závěrečné návštěvě mohou účastnice, které plánují kojit a které mají fungující mrazák v domácnosti, pokračovat v poporodní fázi studie. Po získání souhlasu pomocí druhého formuláře informovaného souhlasu jim budou vydány doplňky stravy, které budou užívat přibližně do 1 týdne po porodu, a nový deník doplňků stravy. Účastnice budou proškoleny, jak odebírat malý (3 ml) vzorek mateřského mléka v jejich domácnosti 5.-7. den po porodu, a dostanou všechny potřebné pomůcky (podrobněji popsáno v části „Sběr a zpracování mateřského mléka“ níže). Účastnice uloží svůj vzorek mateřského mléka do mrazničky a oznámí koordinátorovi výzkumu, až bude připraven k vyzvednutí. K vyzvednutí dojde do 4 dnů od oznámení a v této době bude odebrán vzorek žilní krve o objemu 12 ml. Ženy budou poučeny, aby užily svůj folátový doplněk 2 hodiny před odběrem vzorků mateřského mléka i krve, aby se standardizoval vrchol UMFA v plazmě (a potenciálně i vychytávání UMFA do mateřského mléka; načasování tohoto procesu však není dobře popsáno).

Studijní doplňky

Kyselina listová a kyselina (6S)-5-methyltetrahydrofolová budou poskytovány odděleně od prenatálních multivitaminů. Toto rozhodnutí bylo učiněno proto, že některé ženy uvádějí nesnášenlivost při konzumaci prenatálních multivitamínů; ta je obvykle způsobena vysokým obsahem železa a odezní po prvním trimestru . V případě dočasné nesnášenlivosti mohou účastníci multivitamín vynechat nebo si vzít poloviční dávku multivitamínu a zároveň pokračovat v doplňování plné dávky folátu. Základní složky kyseliny listové a prenatálních multivitaminů poskytla společnost Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada). Objemové množství kyseliny (6S)-5-methyltetrahydrofolové (Metafolin®) poskytla společnost Merck & Cie (Schaffhausen, Švýcarsko). Všechny sypké složky byly složeny do rostlinných gelových kapslí ve společnosti Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada). Kapsle kyseliny listové a kyseliny (6S)-5-methyltetrahydrofolové jsou vzhledově identické, aby bylo možné provést dvojí zaslepení. Prenatální multivitamín obsahuje stejné složení mikroživin jako WN Pharmaceuticals Ltd.® Prenatal (NPN 80025456), pouze kyselina listová byla odstraněna. Celkový souhrn kvality všech studijních doplňků byl dokončen společností Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) a ověřen společností Health Canada, přičemž dávky kyseliny listové a (6S)-5-methyltetrahydrofolové byly potvrzeny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Oznámení o povolení žádosti o klinické hodnocení (Submission No. 244456) bylo poskytnuto ředitelstvím pro přírodní a nepředepsané zdravotnické výrobky společnosti Health Canada dne 26. července 2019.

Dvojité zaslepení, randomizace a poskytnutí balení doplňků

Nezávislý výzkumný asistent společnosti Natural Factors (Coquitlam, BC, Kanada) přidělí zaslepovací kódy (A nebo B) doplňkům kyseliny listové a kyseliny (6S)-5-methyltetrahydrofolic. Lahvičky s folátovými doplňky budou označeny „A“ nebo „B“ a bude na nich uvedeno, že „kapsle jsou buď s kyselinou listovou, nebo s foláty“. Účastníci i primární výzkumný tým budou zaslepeni, pokud jde o přidělení doplňků, které budou odkódovány až po dokončení závěrečných statistických analýz. Pořadí randomizace bude vytvořeno počítačem nezávislým statistikem s použitím bloků po čtyřech, z nichž každý bude obsahovat dva účastníky pro každou skupinu doplňků. Primární výzkumný tým bude zaslepen, pokud jde o pořadí randomizace. Při základní návštěvě každého účastníka koordinátor výzkumu (KMC) zruší zaslepení přidělení (A nebo B) pouze pro dané ID studie, aby mohl poskytnout přidělené studijní doplňky. Při základní návštěvě obdrží účastníci balíček doplňků obsahující všechny kapsle pro 16týdenní intervenci; pokud se účastníci rozhodnou pokračovat v poporodní fázi studie, dostanou při závěrečné návštěvě další doplňky, které budou užívat až do ~ 1 týdne po porodu.

Souběžná medikace

Po zařazení do studie nebudou po celou dobu intervence platit žádná omezení ohledně užívání léků; všechny léky však musí být nahlášeny. Jedinou výjimkou budou doplňky stravy obsahující foláty/kyseliny listové, které nebudou povoleny po celé intervenční období.

Strategie pro zvýšení adherence

Těhotné ženy bývají vysoce motivované a obecně mají zájem o účast v klinických výzkumných studiích . Podle průzkumu kanadské agentury pro veřejné zdraví 94 % žen v Britské Kolumbii během těhotenství doplňuje prenatální multivitamíny . Proto budou účastnice při zařazení do studie pravděpodobně zvyklé na každodenní užívání doplňků stravy. Koordinátor výzkumu (KMC) bude kontaktovat každou účastnici v polovině období (8 týdnů po základní návštěvě), aby vyřešil případné dotazy nebo obavy. Balíček doplňků navíc umožní organizované skladování doplňků doma a deník doplňků bude sloužit jako každodenní připomínka pro zlepšení dodržování pravidel po dobu 16 týdnů. Z těchto důvodů očekáváme vysokou míru dodržování protokolu studie (> 90 %).

Odběr a zpracování krevních vzorků

Venózní krevní vzorky (celkem 12 ml) budou odebírány do 6ml zkumavky s kyselinou ethylendiamintetraoctovou

(EDTA), 2ml zkumavky s EDTA a 4ml zkumavky se sérem (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) při vstupní, výstupní a případné poporodní návštěvě. Základní a závěrečný odběr krve proběhne po 3hodinovém lačnění; tento časový rámec je dostatečný k omezení matoucího vlivu nedávného příjmu folátů na sérové koncentrace. Krevní vzorek po porodu (~ 1 týden po porodu) bude odebrán bez lačnění, protože to neovlivní hladinu folátů v RBC a sníží zátěž účastníků. Po odběru budou zkumavky chráněny před světlem, jemně převráceny podle doporučení výrobce, uloženy do chladničky a převezeny do laboratoře k okamžitému zpracování (do 2 h od odběru).

Pro přípravu hemolyzátu plné krve bude plná krev (0,3 ml) odebrána ze 6ml zkumavky EDTA a zředěna 1/11 přidáním 3,0 ml 1% roztoku kyseliny askorbové a následně inkubována při 37 °C po dobu 30 min. Poté se 6ml zkumavka EDTA odstředí při 3000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 °C. Plazma bude odebrána a (pouze pro základní a koncové vzorky) zbývající obsah 6ml zkumavky EDTA bude zpracován pro izolaci mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) pomocí izolačního protokolu SepMate PBMC (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Kanada). Pro kompletní krevní obraz se použije zkumavka EDTA o objemu 2 ml. Zkumavka se 4 ml séra bude ponechána při pokojové teplotě po dobu ~ 30 minut (dokud se nesrazí) a poté bude centrifugována při 3000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 °C; sérum bude odebráno. Všechny alikvoty budou až do další analýzy uchovávány při teplotě – 80 °C.

Sběr a zpracování mateřského mléka

Ženy budou poučeny, aby sbíraly mateřské mléko 5.-7. den po porodu mezi 13:00 a 14:50 (protože průměrná koncentrace folátů v této době se zdá být reprezentativní pro průměrné koncentrace folátů v průběhu 24 hodin) , 2-3 h po posledním plném odstříkání. Účastnice budou kompletně odsávat mateřské mléko (ručně nebo elektrickou odsávačkou) z pravého prsu. Po odstříkání mateřského mléka budou ženy poučeny, aby mléko jemně promíchaly a poté pomocí sterilní falkonové pipety převedou 0,5 ml do dvou jantarových kryovialek (každá obsahuje 0,005 g kyseliny askorbové pro 1% ředění) a 1 ml do dvou jantarových kryovialek. Všechny kryovialky budou jasně označeny na úrovni 0,5 a 1 ml. Ženy umístí všechny zkumavky do mrazicího boxu, který bude uložen v mrazničce po dobu až 4 dnů. Vzorky budou vyzvednuty zmrazené a přeneseny do laboratoře ke skladování při teplotě – 80 °C až do další analýzy.

Laboratorní analýzy

Foláty v séru (nmol/l) a foláty v RBC (nmol/l) budou analyzovány mikrobiologickým testem, jak je celosvětově doporučováno, pomocí metody mikrotitračních destiček popsané Molloy et.al . RBC folát (nmol/L) se vypočítá podle následujícího vzorce :

Plasmatické biomarkery včetně UMFA (nmol/l), S-adenosyl-methioninu (μmol/l), S-adenosyl-homocysteinu (μmol/l), celkový homocystein (μmol/l), celkový cystein (μmol/l), methionin (μmol/l), volný cholin (μmol/l) a betain (μmol/l) budou analyzovány pomocí hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií . Vitamin B12 (pmol/l) bude analyzován pomocí imunoanalyzátoru. Pyridoxal-5-fosfát (nmol/l) bude analyzován pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Genové varianty budou genotypizovány pomocí genotypovacích testů TaqMan SNP . Kompletní krevní obraz bude proveden pomocí automatického hematologického analyzátoru (Sysmex XNL-550). Formy folátu v mateřském mléce (včetně UMFA, THF, 5-methyl-THF, 5-formyl-THF a 5,10-methenyl-THF) budou kvantifikovány pomocí kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií; celkový folát bude představovat součet těchto forem . Koncentrace FBP v mateřském mléce se bude měřit pomocí kompetitivního vazebného radioaktivního testu (jak popsal Selhub et al.).

Souhrn údajů, které budou shromažďovány

Demografické, zdravotní a výživové údaje prostřednictvím strukturovaných dotazníků

Sběr základních údajů bude zahrnovat věk, etnickou příslušnost, paritu, vzdělání, povolání, příjem domácnosti, anamnézu léků a medikace, uváděnou hmotnost před těhotenstvím, celkovou stravu (včetně veganské, vegetariánské, ketogenní, bezlepkové stravy a všech potravin/skupin potravin, kterým se z jakéhokoli důvodu vyhýbáme) a užívání doplňků stravy. Závěrečný sběr dat bude zahrnovat jakékoli změny v celkovém zdravotním stavu nebo užívání léků od základní návštěvy.

Anthropometrics

Předtěhotenský BMI bude vypočítán na základě vlastní udávané předtěhotenské hmotnosti a naměřené výšky. Měření účastnic budou provedena na počátku (hmotnost a výška) a na konci těhotenství (pouze hmotnost) pro výpočet přírůstku hmotnosti v průběhu intervence a celkového přírůstku hmotnosti v průběhu těhotenství (s využitím vlastní hlášené hmotnosti před těhotenstvím a naměřené hmotnosti na konci těhotenství).

Vyhodnocení stravy

Celkové DFE (μg/den) z potravinových folátů a doplňkové kyseliny listové budou vypočteny pomocí Block Folic Acid/Dietary Folate Equivalents Screener (NutritionQuest, Berkeley, CA, USA), validovaného dotazníku o frekvenci stravování .

Postpartální údaje

Budou zaznamenány celkové týdny suplementace, týdny těhotenství při porodu, dodržování protokolu o odběru mateřského mléka a načasování suplementace foláty před odběrem mateřského mléka a vzorků krve po porodu.

Kritéria pro odstoupení od studie

Kritéria pro odstoupení od studie zahrnují spontánní nebo plánované ukončení těhotenství, užívání dalších doplňků výživy obsahujících foláty/kyseliny listové a po nežádoucí/vážné nežádoucí příhodě související s doplňky/intervencí ve studii (podle rozhodnutí kvalifikovaného zkoušejícího (CM)). Účastníci mohou také kdykoli sami odstoupit a nebudou shromažďovány žádné další informace. Bez ohledu na důvod odstoupení budou všechny dříve shromážděné údaje uchovány pro analýzu. Účastnice, které porodí před závěrečnou návštěvou, budou mít možnost pokračovat v poporodní fázi studie za předpokladu, že budou i nadále denně doplňovat studijní doplňky.

Zpracování údajů a ochrana osobních údajů

Všechna data a biologické vzorky budou identifikovány pomocí studijního ID každého účastníka. Data s osobními identifikátory budou uložena na šifrovaném, heslem chráněném počítači v zabezpečeném prostoru serveru výzkumného ústavu BC Children’s Hospital. Údaje s odstraněnými osobními identifikátory budou vyčištěny a koordinátor výzkumu (KMC) a nezávislý výzkumný asistent je dvakrát vloží do systému REDCap (Research Electronic Data Capture), který je umístěn ve výzkumném ústavu BC Children’s Hospital Research Institute. KMC, JAH a CDK budou mít přístup ke konečnému souboru dat. Papírové dokumenty budou uloženy v uzamčené kartotéce a biologické vzorky budou uloženy v uzamčeném mrazáku umístěném v laboratoři hlavního výzkumníka (CDK) na University of British Columbia. Účastníci mohou být informováni o přidělení doplňku folátů a výsledcích folátů v krvi/mléce (pokud je to relevantní) (včetně DFE, sérových a RBC folátů na začátku, na konci a po porodu a celkových koncentrací folátů v mateřském mléce) po dokončení závěrečných statistických analýz.

Data a statistická analýza

Pro základní údaje účastníků bude použita popisná statistika. Spojité proměnné budou uváděny s průměrem ± směrodatnou odchylkou (nebo mediánem a mezikvartilovým rozpětím, pokud nejsou rozděleny normálně) a kategoriální proměnné jako absolutní čísla pro jednotlivé skupiny a procenta. Počty kapslí budou použity pro výpočet adherence účastníků a doplňkový deník bude použit pro popisný vhled do překážek adherence. Údaje budou posouzeny z hlediska normality a v případě, že údaje nebudou odpovídat normálnímu rozdělení, bude zvážena transformace nebo použití ekvivalentních neparametrických testů. Statistické analýzy budou provedeny pomocí programu Stata (StataCorp, College Station, TX, USA). Všechny analýzy budou zpočátku provedeny na základě záměru léčit podle počátečního rozdělení do skupin na počátku studie a bez imputace chybějících údajů. Sekundární analýzy per-protokol budou provedeny včetně těch, kteří plně dokončili studii a dodržovali protokol studie. K případné korekci chybějících údajů v analýzách citlivosti bude použita vícenásobná imputace .

Primární analýzy

Vypočítáme průměr ± směrodatnou odchylku primárních výsledků (sérový folát, RBC folát a plazmatický UMFA) v každé skupině na začátku a na konci studie a také průměr ± směrodatnou odchylku změny těchto výsledků v každé skupině. Tyto odhady budou použity pro výpočet velikosti vzorku definitivní studie.

Druhotné analýzy

Exploratorní analýzy primárních výsledků budou provedeny pomocí vícenásobného lineárně-regresního modelu s cílem zjistit, zda se změna od výchozího stavu ke konečnému stavu liší podle stavu léčby, s úpravou na výchozí hodnoty a vysvětlující proměnné (DFE, exploratorní biomarkery, týdny těhotenství při zahájení užívání doplňků). Bude rovněž vypočten podíl žen s UMFA ≥ 0,2 nmol/l (považovaným za detekovatelnou koncentraci) na počátku a na konci léčby v každé skupině. Pro informaci o našem sekundárním cíli bude odhadnuta celková míra účasti ve studii vydělením celkového počtu zařazených žen celkovým počtem žen, které měly zájem o účast. Týdenní míra náboru bude odhadnuta vydělením celkového počtu zařazených žen celkovým počtem týdnů, které byly potřebné k jejich náboru. Míra udržení účastnic bude odhadnuta vydělením počtu žen, které dokončí celou studii, celkovým počtem zařazených žen. Pro každou strategii náboru (včetně plakátů, sociálních médií, ústního podání) bude vyhodnocen celkový dosah (pouze sociální média), dotazy, zapsané osoby a náklady. Šance na zápis po dotazování pro každou strategii bude vyhodnocena pomocí poměru šancí. Pokud budou k dispozici, budou zaznamenány důvody pro nezapsání.

Porodní analýzy

Vypočítáme průměr ± směrodatnou odchylku pro podíl kyseliny listové v mateřském mléce (vydělení koncentrace kyseliny listové v mateřském mléce součtem všech forem folátu v mateřském mléce) a pro RBC folát matky po porodu. K odhadu vztahu mezi koncentrací kyseliny listové v mateřském mléce a UMFA v plazmě matky po porodu bude použita lineární regrese. Výsledky po porodu budou dále analyzovány pomocí vícenásobné lineární regrese s úpravou na koncové hodnoty a vysvětlující proměnné (DFE, celkový počet týdnů suplementace, dodržování protokolu o odběru mateřského mléka).

Bezpečnost

Kyselina listová je poskytována v dávce, která odpovídá kanadským doporučením pro těhotné ženy (0,4-1,0 mg/den); je tedy považována za málo rizikovou. Vápníková sůl kyseliny (6S)-5-methyltetrahydrofolové je považována za bezpečnou a je obsažena v kanadských prenatálních multivitamínech bez stanovené tolerovatelné horní hranice (v současné době není známo žádné riziko poškození). Randomizace proběhne mezi 8. a 21. týdnem těhotenství (po uzavření neurální trubice). Vzhledem k nízkému riziku této pilotní studie nebylo sestavení výboru pro sledování údajů považováno za nezbytné. Veškeré obavy o bezpečnost a případné rozhodnutí o ukončení studie budou řešit hlavní zkoušející (CDK a JAH) a kvalifikovaný zkoušející (CM) a oznámí je etické komisi pro výzkum a kanadskému zdravotnictví. K odpojení intervenčních kódů může být přistoupeno kdykoli, pokud to bude považováno za nezbytné pro sledování bezpečnosti účastníků

.