Úvod

Mnohé pokroky v různých oblastech výzkumu, včetně vývojové biologie, biologie kmenových buněk a technologie tkáňového inženýrství, usnadnily regenerativní medicínu. První generací regenerativní medicíny je transplantační terapie kmenovými buňkami s využitím tkáňových kmenových buněk, embryonálních kmenových buněk (ES) nebo indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPS) . Například transplantace kostní dřeně se již stala běžnou léčbou leukémie a hypoplastické anémie. Kromě toho se ES buňky i iPS buňky dostávají do klinických zkoušek u mnoha nemocí a poškození, včetně leukémie, Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby, srdečního infarktu, cukrovky, onemocnění jater a různých dalších stavů . Tkáňová regenerace je považována za druhou generaci regenerativní medicíny a na trhu je již několik produktů, včetně kůže a chrupavky. Kromě toho se v klinické studii zkoumá první terapie regenerace tkání na světě pomocí iPS buněk získaných buď od pacienta, nebo od anonymního dárce, která má léčit věkem podmíněnou makulární degeneraci .

Nová generace regenerativní terapie se zaměřuje na celé orgány složené z více typů buněk se složitou trojrozměrnou strukturou . V tomto desetiletí přinesl pokrok v oblasti biologie kmenových buněk a vývojové biologie nové možnosti regenerace funkčních orgánů. Během embryonálního vývoje vznikají orgány z příslušných orgánových zárodků, které jsou vyvolány vzájemnými interakcemi mezi osudově podmíněnými epiteliálními a mezenchymálními kmenovými buňkami podle jednotlivých orgánotvorných polí (obr. 1a) . Funkční orgánové regenerace bylo poprvé dosaženo v roce 2007 vyvinutím nové metody buněčné manipulace k vytvoření bioinženýrského orgánového zárodku s orgánotvorným potenciálem epiteliálních a mezenchymálních kmenových buněk izolovaných z embryonálního orgánového zárodku (obrázek 1b) . Tato průkopnická studie a následné studie informovaly o plně funkční regeneraci několika typů ektodermálních orgánů, čímž poskytly důkaz pro koncept funkční regenerace orgánů .

Další změna paradigmatu přišla v roce 2008 s objevem organoidů, které byly generovány navozením orgánotvorného pole v buněčném agregátu vzniklém z pluripotentních kmenových buněk, jako jsou ES buňky a iPS buňky, a také z tkáňových kmenových buněk (obrázek 1c) . Lze generovat prakticky všechny typy organoidů, včetně organoidů centrálního nervového systému (tj. mozkové kůry, hypofýzy, zrakového pohárku a vnitřního ucha) . Ačkoli vznik organoidu představuje technologický průlom, který nyní slouží jako základní nástroj v mnoha základních biologických a klinických aplikacích, organoidy stále mohou pouze částečně reprodukovat strukturu a funkci původních orgánů. Proto většina dosud vytvořených jednotlivých organoidů mohla nahradit omezené a/nebo částečné funkce kompletního orgánu, a proto jsou v současné době považovány za miniorgány. Nedávno byly úspěšně vyvinuty organoidy slinných žláz, které vykazují plně funkční regeneraci orgánů s ortotopickou transplantací . Vzhledem k tomu, že principy vývoje ektodermálních orgánů jsou podobné jako u jiných orgánů, je důležité získat hlubší znalosti o regeneraci ektodermálních orgánů, aby bylo možné dosáhnout úplné funkční regenerace jiných orgánů (obrázek 1a). Regenerace integumentárního orgánového systému (IOS) pomocí organoidní metody in vivo navíc jasně ukázala možnost regenerace orgánového systému .

V tomto přehledu popisujeme nedávný pokrok v regeneraci orgánů pomocí různých populací kmenových buněk a strategií založených na vývojové biologii a biologii kmenových buněk a diskutujeme budoucí směry pro terapii náhradou orgánů jako další generaci orgánové regenerativní medicíny.

Vývoj trojrozměrné metody manipulace s buňkami, metody orgánových zárodků, pomocí embryonálních buněk

Výzkumníci se již několik desetiletí pokoušejí regenerovat orgány kombinací funkčních buněk, lešenářských materiálů a fyziologicky aktivních látek pomocí technik tkáňového inženýrství . Přestože tyto předchozí studie přinesly určitý přínos k regeneraci orgánů, existují značné obavy týkající se výsledků těchto studií, jako je nízká účinnost indukce orgánů a nekontrolovatelný směr a velikost regenerovaného orgánu. S pokrokem v oblasti kmenových buněk a vývojové biologie došlo v posledních 30 letech k pokroku v reprodukci organogeneze ve fetálním stadiu. Vývojový proces regenerace orgánů začíná indukcí zárodku orgánu epiteliálně-mezenchymálními interakcemi v orgánovém poli, které se formují po vytvoření tělesného plánu během raného vývoje. V průběhu let byly vyvinuty techniky manipulace s buňkami určené k regeneraci orgánových zárodků, ale úplné reprodukce vývoje a regenerace funkčních orgánů nebylo dosaženo .

Vyvinuli jsme bioinženýrskou metodu, označenou jako metoda orgánových zárodků, k rekapitulaci indukce orgánových zárodků prostřednictvím epiteliálních a mezenchymálních interakcí v raných vývojových stadiích . Kompartmentalizovali jsme epiteliální a mezenchymální buňky izolované z myšího embrya při vysoké hustotě buněk v kolagenovém gelu typu I, abychom dosáhli přesné replikace procesů probíhajících během organogeneze. Pomocí této nové metody jsme pozorovali funkční regeneraci několika typů ektodermálních orgánů, jako jsou zuby, vlasové folikuly a sekreční žlázy .

Plně funkční bioinženýrsky vytvořené zuby

3.1. Vývoj zubu

Ve vývoji zubních zárodků dochází zpočátku ke ztluštění zubní lamely (stadium lamina) (obr. 2a). Zubní zárodek se vyvíjí a interaguje s epitelem a mezenchymem ústní sliznice. Následně je u myší v 11.-13. embryonálním dni (ED) epiteliálními signály indukováno ztluštění epitelu v místě budoucího zubu a následné prorůstání epitelu (stadium pupenu) do podkladového mezenchymu odvozeného od nervového hřebene. V ED 13-15 funguje uzel skloviny jako signalizační centrum odpovědné za tvorbu a udržování zubní papily. Primární sklovinné uzly se tvoří v zubním pupenu a objevují se při přechodu ze stadia pupenu do stadia čepičky. V ED 17-19 dochází k terminální diferenciaci epiteliálních a mezenchymálních buněk v zárodku zubu . Mezenchym se také diferencuje v zubní dřeň a periodontální tkáně, ze kterých se stane cement, periodontální vazivo a alveolární kost. Tvorba zubního kořene je zahájena po vytvoření zubní korunky a zralé zuby se prořezávají do ústní dutiny.

3.2. Plně funkční regenerace zubů

Ztráta zubů v důsledku zubního kazu, parodontálního onemocnění nebo úrazu způsobuje zásadní problémy se správnou funkcí ústní dutiny a je spojena s orálními a celkovými zdravotními problémy . Konvenční stomatologická ošetření určená k obnově okluzních funkcí po ztrátě zubů jsou založena na náhradě zubů umělými materiály, jako jsou fixní nebo snímatelné zubní náhrady a můstky. Přestože se tyto umělé terapie široce uplatňují při léčbě zubních poruch, je obnova okluze nezbytná, protože zuby se koordinují s okluzní silou a ortodontickou silou okolních svalů a integrita stomatognátního systému se udržuje vytvořením okluzního systému během růstu čelisti v postnatálním období . Nedávné pokroky v regeneraci tkání umožnily vědcům posílit funkce biologických zubů tím, že usnadňují vývoj základního zubu remodelací kosti a napomáhají schopnosti vnímat škodlivé podněty .

Jak ukázala naše předchozí studie, zárodek bioinženýrského zubu se po transplantaci do oblasti ztraceného zubu vyvine do správné struktury zubu a úspěšně prořezává do ústní dutiny (obrázek 2b) . V případě transplantované bioinženýrské jednotky zralého zubu zahrnující zralý zub lze do oblasti ztraceného zubu vštípit parodontální vazivo a alveolární kost díky integraci kosti v příjemci (obrázek 2c) . Bioinženýrský zub udržuje interakce s parodontálním vazem a alveolární kostí pocházející z bioinženýrské zubní jednotky díky úspěšné integraci do kosti. Tvrdost skloviny a dentinu bioinženýrských zubních komponent byla při analýze pomocí Knoopova testu tvrdosti v normálním rozmezí . Za důležitý směr do budoucna se považuje kontrola tvaru zubu. Zuby se vytvářejí vedením mezenchymu podle plánu těla během procesu vývoje. Pokud jde o morfologickou kontrolu zubu, šířka zubu je řízena plochou kontaktů mezi epiteliálními a mezenchymálními buněčnými vrstvami a počet hrotů je řízen expresí Shh ve vnitřním epitelu skloviny . Tato technologie bioinženýrského zubu přispívá k realizaci regenerační terapie nahrazující celý zub jako terapie nové generace.

Plně funkční bioinženýrský vlasový folikul

4.1. Vývoj vlasového folikulu

Myši mají na hřbetě čtyři různé typy chlupů, které se klasifikují jako chlupy strážní, šídlové, auchenové a klikaté. Vývoj vlasových folikulů v myší kůži na zádech začíná určením osudu mezenchymálních buněk přibližně v ED 10,5, což vede k vytvoření kožního kondenzátu. Vzájemné interakce mezi kožním kondenzátem a nad ním ležící epidermis vedou k indukci vlasového plaku (obrázek 3a). Jakmile je vlasový plakód vytvořen, dochází k vývoji vlasových folikulů ve třech vlnách, počínaje vývojem ochranného vlasu v ED 14,5, následovaného šídlovitými a auchenovými vlasy v ED 17 a klikatými vlasy při narození . Spodní konec epitelu vlasového kolíčku, který obepíná kondenzovanou dermální buňku, tvoří zárodek vlasové matrix. Kondenzovaná dermální buňka vytváří dermální papilu, která je považována za niku pro mezenchymální kmenové buňky vlasového folikulu a indukuje diferenciaci vlasové matrix a vytváří vnitřní kořenové pouzdro vlasového folikulu a vlasový stvol. Oblast bulbu také vytváří niku pro epitelové kmenové buňky a současně se spojuje s nervovými vlákny a svalem arrector pili (obrázek 3a) .

4.2. Plně funkční regenerace vlasového folikulu

Vlasový orgán má biologické funkce termoregulace, fyzické izolace před UV zářením, vodotěsnosti, hmatového vjemu, ochrany před škodlivými podněty, maskování a sociální komunikace . Poruchy vypadávání vlasů, jako je vrozená dysplazie vlasových folikulů a androgenní alopecie, jsou psychicky nepříjemné a mají negativní dopad na kvalitu života obou pohlaví . Současná farmakologická léčba nestačí k dosažení ideální kontroly vypadávání vlasů, jako je vrozená dysplazie vlasových folikulů nebo alopecie areata . Zvýšila se poptávka po vývoji bioinženýrských technologií, které umožňují regenerativní léčbu vypadávání vlasů.

V rámci vlasového cyklu dochází k pravidelné obnově zárodků vlasových folikulů a epiteliální a mezenchymální kmenové buňky schopné regenerovat vlasové folikuly jsou přítomny i u dospělých. Proto je tento orgán jediným orgánem, u kterého lze rekonstituční zárodky regenerovat z buněk odvozených od dospělých. Byla popsána autologní transplantace vlasových folikulů, při níž je jeden vlasový folikul izolován z oblasti zdravé vlasové pokožky a transplantován pacientům s alopecií mužského typu, přičemž transplantované vlasové folikuly si zachovávají své vlastnosti . Podle mnoha výzkumníků náhrada dermálních buněk v kůži pomocí mezenchymálních buněk, které jsou odebrány z cibulek dospělých vlasů ve vlasovém folikulu, vyvolává tvorbu nových vlasových folikulů . Regenerace vlasových folikulů, které fungují ve spolupráci s okolní tkání, je však obtížná. Naše skupina rekonstituovala bioinženýrský zárodek vlasového folikulu, který obsahuje mezenchymální kmenové buňky, pomocí epiteliálních buněk získaných z bulbů a buněk dermální papily izolovaných nejen z embryí, ale také z dospělých myší (obrázek 3b) . Po ortotopické transplantaci se bioinženýrské zárodky vlasových folikulů vyvinou ve zralé vlasové folikuly se správnou strukturou a produkují vlasy po celý svůj život (obrázek 3c). Regenerované vlasové folikuly se navíc účinně spojily s okolní tkání hostitele a vykazovaly pilomotorický reflex v reakci na podání acetylcholinu (obr. 3d). Tato studie prokázala potenciál tkáňových kmenových buněk izolovaných z dospělých vlasových folikulů pro vývoj v lidské vlasové folikuly v oblasti regenerativní medicíny.

Plně funkční bioinženýrské sekreční žlázy

5.1. Vývoj slinných a slzných žláz

Sekreční žlázy, včetně slinných a slzných žláz, mají zásadní význam pro ochranu a zachování fyziologických funkcí v mikroprostředí ústní dutiny a očního povrchu. Sekreční žlázy se vyvíjejí prostřednictvím vzájemných epiteliálně-mezenchymálních interakcí . Slinné žlázy se dělí na tři hlavní typy: příušní žlázu (PG), podčelistní žlázu (SMG) a podjazykovou žlázu (SLG). SMG se vyvíjí invaginací epitelu do mezenchymální oblasti na ED 11 . Invaginovaná epitelová tkáň proliferuje a vytváří epitelovou stopku (obrázek 4a) . Terminální pupen vytváří rozvětvenou strukturu vývojem rozštěpu a opakováním procesu prodlužování a větvení z ED 12,5-14,5 . Terminální pupeny se diferencují v acinární buňky a dozrávají k syntéze proteinů sekretů na ED 15 . Naproti tomu slzná žláza se vyvíjí také invaginací epitelu do mezenchymálního vaku v temporální oblasti oka na ED 12.5 . Zaoblené epitelové pupeny se sbíhají do horního spojivkového fornixu, který pak invaginuje do okolního mezenchymu . Zárodek slzné žlázy tvoří větve prostřednictvím prodlužování stopky a morfogeneze tvorby rozštěpu. Základní struktury slzné žlázy je dosaženo pomocí ED 19 .

5.2. Regenerace slinných a slzných žláz

Suchost v ústech a suchost v očích jsou běžné příznaky. Mezi onemocnění slinných žláz patří nádory slinných žláz, obstrukční poruchy, infekce a příznaky systémových onemocnění, jako je Sjögrenův syndrom, lymfom a metabolická onemocnění . Tyto stavy postihují také slzné žlázy, což vede k suchosti očí . Dysfunkce a poruchy spojené s těmito exokrinními žlázami mají za následek celkové snížení kvality života. Současná léčba onemocnění charakterizovaných suchostí v ústech a očích však léčí pouze příznaky . Tyto terapie mají pouze dočasný účinek a nezvrátí dysfunkci exokrinních žláz.

Naše skupina se zaměřila na vývoj lepší léčby rekonstitucí bioinženýrského zárodku slinné žlázy z epiteliálních a mezenchymálních buněk odvozených z embryonálních zárodků slinných žláz myší ED 13,5-14,5 pomocí námi vyvinuté metody orgánových zárodků (obr. 4b) . Po ortotopické transplantaci po odstranění nativních slinných žláz se bioinženýrský zárodek slinné žlázy vyvinul ve zralou slinnou žlázu a mezi slinným vývodem hostitele a bioinženýrským slinným vývodem se vytvořilo správné spojení (obrázek 4b). Tento postup vedl k vývoji spojeného slinného vývodu u myši příjemce se strukturami acinární tkáně, které byly podobné přirozené slinné žláze (obrázek 4c). Bioinženýrsky vytvořená SMG regenerovala serózní acinární buňky a vykazovala přirozenou strukturu orgánu. Byl také zaznamenán vstup nervů do těchto bioinženýrských slinných žláz a sekrece slin byla ve slinné žláze vyvolána stimulací chuťového pohárku pomocí kyseliny citronové (obr. 4d).

Také jsme rekonstituovali bioinženýrský zárodek slzné žlázy z epiteliálních a mezenchymálních buněk odvozených ze zárodků slzné žlázy myšího embrya ED 16,5 . Bioinženýrský zárodek slzné žlázy, který byl vytvořen metodou orgánových zárodků, úspěšně prošel morfogenezí větvení. Po transplantaci se tyto žlázy vyvinuly ve zralé struktury sekrečních žláz in vivo. Tyto výsledky potvrdily možnost regenerace bioinženýrské sekreční žlázy pomocí transplantace orgánových zárodků.

Generace organoidů jako miniorgánů z pluripotentních kmenových buněk

Organoidy, které reprodukují částečnou strukturu a funkci orgánů, byly generovány z multipotentních kmenových buněk na základě konceptu rekapitulace procesu indukce pole pro tvorbu orgánů s následnou samoorganizací během embryonální organogeneze. Této indukce bylo dosaženo použitím různých kombinací cytokinů, které napodobují vzorování a umístění signalizace v embryu. Tento koncept byl poprvé prokázán úspěšným vytvořením organoidu optického pohárku z ES buněk . Následně byly indukovány různé organoidy v jednotlivých orgánotvorných polích, například sítnice, hypofýza, mozek, vnitřní ucho a vlasový folikul v poli hlavy; štítná žláza a plíce v poli hrudníku; a tenké střevo, žaludek a ledviny v poli břicha .

Dospělé tkáňové kmenové buňky, jako jsou střevní , plicní , žaludeční a pankreatické kmenové buňky , jsou rovněž schopny vytvářet organoidy prostřednictvím samoorganizace své niky, které mohou částečně reprodukovat původní strukturu tkáně. Ačkoli se definice organoidu mírně liší v závislosti na jeho původu (tj. pluripotentní kmenové buňky nebo tkáňové kmenové buňky), organoidy částečně napodobují strukturu orgánu nebo tkáně a mohou růst do omezené malé velikosti, a proto jsou považovány za miniorgány. Proto na rozdíl od bioinženýrského zárodečného orgánu není organoid schopen sám o sobě zcela nahradit funkce původních orgánů po ortotopické transplantaci; ortotopická a heterotopická transplantace více organoidů však může částečně obnovit funkci orgánu .

Nedávno jsme úspěšně regenerovali plně funkční slinnou žlázu z myších ES buněk in vivo (obr. 4e,f) . Pomocí obecné metody tvorby organoidů jsme vytvořili primordium slinné žlázy jako organoid indukcí orgánotvorného pole (tj. ústního ektodermu), který byl poté transplantován ortotopicky. Transplantovaný organoid se vyvinul ve zralou slinnou žlázu se správnou strukturou tkáně, jako je acinární tkáň, a vytvořil vhodná spojení s okolními tkáněmi, včetně vývodu PG a nervů. Regenerovaná slinná žláza navíc vylučovala sliny v reakci na chuťovou stimulaci pomocí kyseliny citronové, což dokazuje úplné obnovení funkce původní slinné žlázy po ortotopické transplantaci organoidu (obrázek 4f). Tyto studie jasně ukazují proveditelnost funkční regenerace orgánů pomocí organoidů, které byly vytvořeny indukcí orgánotvorného pole v multipotentních kmenových buňkách, nikoli v embryonálních kmenových buňkách s orgánotvorným potenciálem. Vývoj nového kultivačního systému in vitro umožňujícího růst organoidů velkých orgánů, jako jsou játra a ledviny, do vhodné velikosti by měl být dalším tématem výzkumu pro dosažení regenerace orgánů.

Regenerace trojrozměrného IOS z iPS buněk

Koordinovaná funkce více orgánů, souhrnně označovaných jako orgánový systém, jako je centrální nervový systém, oběhový systém, trávicí systém a IOS, je životně důležitá pro udržení homeostázy v organismu . Proto je regenerace celého orgánového systému další výzvou v oblasti regenerativní medicíny. IOS je největší orgánový systém v těle. Tento systém obsahuje kromě kožní tkáně, která se skládá z epidermis, dermis a podkožního tuku, také několik orgánů, jako jsou vlasové folikuly, mazová žláza a potní žláza. Systém kožních orgánů hraje důležitou roli v homeostáze, jako je vylučování vlhkosti a kožního mazu a ochrana před ultrafialovým zářením a vnější stimulací vlasovými chloupky. Poškození kůže těžkými popáleninami je život ohrožující. Vrozené defekty a ztráta kožních přívěsků významně ovlivňují kvalitu života, i když je možná částečná regenerační léčba pomocí epidermálních listů. Bylo popsáno vytvoření umělé kůže, která se skládá z epidermis a dermis, a regenerace orgánů vlasových folikulů pomocí buněčné manipulace. Přesto se dosud nepodařilo regenerovat žádný kožní orgánový systém.

Nedávno jsme úspěšně regenerovali IOS navozením orgánotvorného pole v embryoidních tělíscích (EB) odvozených z myších iPS buněk (obr. 5a) . Po transplantaci EBs do subrenálního pouzdra byla v bioinženýrsky vytvořené IOS potvrzena tvorba kožních přídatných orgánů včetně vlasových folikulů, mazových žláz a podkožní tukové tkáně bez nádorového bujení (obr. 5b,c). Počet a hustota regenerovaných vlasů v bioinženýrské IOS byly navíc stejné jako v přirozených vlasech, což naznačuje, že organogeneze v IOS probíhala podobným způsobem jako při normálním vývoji. Bioinženýrská IOS vytvořená v subrenální kapsidě byla po transplantaci do kůže na zádech nahých myší plně funkční, o čemž svědčí opakující se vlasový cyklus (obrázek 5d). Tato studie prokázala koncept regenerace orgánového systému in vivo. Z hlediska praktického využití je žádoucí nová strategie generování orgánového systému in vitro. Jednou z takových strategií by mohlo být sestavení více typů organoidů jako částí. Výzkum zaměřený na kontrolu konfigurace organoidů a jejich pěstování in vitro bude dalším trendem v oblasti regenerativní medicíny.

Závěr a budoucí perspektivy

V tomto desetiletí učinily studie orgánové regenerace vycházející z bioinženýrské technologie velký pokrok směrem k realizaci orgánové regenerativní terapie díky začlenění konceptů z biologie kmenových buněk a vývojové biologie. Na základě poznatků z organoidních studií lze prakticky všechny miniorgány generovat buď z pluripotentních kmenových buněk, nebo z tkáňových kmenových buněk, což rozptyluje obavy ohledně zdroje buněk pro regenerativní terapii orgánů. Funkční regenerace ektodermálních orgánů pomocí buněk izolovaných z embryonálních orgánových zárodků, kmenových buněk s orgánovým indukčním potenciálem a pluripotentních kmenových buněk potvrzuje koncept orgánové substituční terapie.

Vývoj trojrozměrného kultivačního systému in vitro se schopností pěstovat organoidy a orgánové zárodky do vhodné velikosti je nezbytný pro dosažení funkční regenerace více orgánů a orgánových systémů. Současné kultivační systémy in vitro neumožňují vhodný růst nebo udržení organoidů nebo orgánových zárodků z důvodu výskytu nekróz uvnitř těchto tkání, zejména v důsledku nedostatečného přísunu živin. In vivo je systém krevního oběhu nezbytný pro udržení funkcí orgánů prostřednictvím přenosu kyslíku, zásobování živinami a odstraňování odpadu. Nedávný pokrok v oblasti tkáňového inženýrství ukázal, že cévní síť dodává biologické látky do nitra buněčného sféroidu . Navíc jsme dříve vyvinuli systém orgánové perfuzní kultivace s využitím cévní sítě, který udržoval játra potkana ve zdravém stavu po delší dobu , což poskytlo vodítka pro vývoj nového trojrozměrného kultivačního systému.

Protože kmenové buňky vlasových folikulů jsou jediné dospělé kmenové buňky, které mají orgánově indukční potenciál a mohou být transplantovány autogenně, první klinická studie orgánové regenerační terapie u člověka bude nepochybně zkoumat regeneraci vlasových folikulů. Regenerace vlasových folikulů pomocí naší metody orgánových zárodků se nyní zkoumá v předklinické studii, která má léčit pacienty trpící androgenní alopecií, s cílem provést klinické zkoušky v roce 2020. Tato regenerační terapie vlasových folikulů bude milníkem v orgánových regeneračních terapiích a povede k vývoji materiální a citlivé infrastruktury pro realizaci orgánové regenerační medicíny. Aplikace poznatků o regeneraci vlasových folikulů a odborných znalostí získaných z klinických studií na další orgánové zárodky nebo organoidy umožní v příštích několika desetiletích regeneraci dalších orgánů z pluripotentních a tkáňových kmenových buněk v kombinaci s organoidními technologiemi.

Dostupnost dat

Tento článek neobsahuje žádná další data.

Příspěvky autorů

T.T. navrhl tento přehled. E.I., M.O., M.T. a T.T. napsali rukopis.

Konkurenční zájmy

Tato studie byla provedena na základě dohody o vynálezech mezi společností Riken and Organ Technologies Inc. T.T. je ředitelem společnosti Organ Technologies Inc.

Financování

Publikace tohoto přehledu byla částečně podpořena grantem Grant-in-Aid for KIBAN (A) od Ministerstva školství, kultury, sportu, vědy a technologie (grant č. 25242041) a grantem na spolupráci (pro T.T.) od společnosti Organ Technologies Inc. Tato práce byla částečně financována společností Organ Technologies Inc.

Poznámky pod čarou

.