Zkoumané houby

Izoláty Escovopsioides byly získány z houbových zahrádek různých druhů listnáčů a nelistnáčů, které byly nasbírány v předchozích studiích . Tato sbírka zahrnuje 20 izolátů získaných z Atta sexdens, Atta capiguara, Atta cephalotes, Acromyrmex balzani, Acromyrmex heyeri, Acromyrmex lundi a Trachymyrmex tucumanus, kromě typového druhu E. nivea získaného z Acromyrmex subterraneus subterraneus (tab. 3). Také jeden další izolát byl získán z kolonie nelistnatého mravence Apterostigma megacephala nalezené v Parauapebas, Pará, Brazílie (tabulka 3). Všechny izoláty vykazovaly popsané morfologické znaky rodu Escovopsioides: hyalinní kolonie na PDA, terminální a interkalární vezikuly nesoucí lageniformní fialidy, hyalinní konidie v dlouhých řetízcích, aleurokonidie a chlamydospórovité struktury .

Izoláty jsou uchovávány jako suspenze konidií při – 80 °C (v 10% glycerolu) a v destilované vodě při 10 °C ve sbírce Laboratoře ekologie a systematiky hub (LESF), Rio Claro, stát São Paulo, Brazílie. Všechny izoláty byly oživeny ze zásob inokulací konzervovaných konidií na médium PDA a inkubovány 7 dní při 25 °C ve tmě. Všechny zkoumané izoláty byly získány jako monosporické kultury.

Molekulární charakterizace Escovopsioides

Genomická DNA byla extrahována metodou CTAB z kultur pěstovaných na 2% malt agaru (MA2%) po dobu 5 dnů, ve tmě. U všech izolátů byly amplifikovány geny kódující tef1 (primery: EF6-20F a EF6A-1000R), LSU (primery: CLA-F a CLA-R) a také ITS (primery: ITS5 a ITS4). Pro tef1 byl jako templát pro amplifikaci použit 1 μl zředěné genomové DNA (1:100) za použití kuliček illustra™ PureTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare) za následujících podmínek: počáteční denaturace při 94 °C po dobu 2 min, následovaná 15 cykly při 94 °C po dobu 30 s a počáteční teplotou žíhání při 65 °C klesající o 1 °C na cyklus touchdown a konečnou extenzí při 72 °C po dobu 1 min. Byl proveden druhý krok PCR: 94 °C po dobu 30 s, následovalo 35 cyklů při 94 °C po dobu 30 s, 48 °C po dobu 30 s a závěrečný krok prodloužení při 72 °C po dobu 1 min. Pro ITS byly jako templát pro PCR použity 2 μl naředěné genomové DNA (1:100) podle podmínek popsaných v Schoch et al.: 94 °C po dobu 3 min, následovalo 35 cyklů při 94 °C po dobu 1 min, 55 °C po dobu 1 min a závěrečný krok prodloužení při 72 °C po dobu 2 min. Pro LSU byly pro PCR použity 2 μl naředěné genomové DNA (1:100) podle podmínek popsaných v Augustin et al. : 95 °C po dobu 2 min, 40 cyklů po 30 s při 95 °C, 60 s při 62 °C, 90 s při 72 °C a 5 min extenze při 72 °C. Produkty PCR byly obarveny pomocí GelRed™ (Biotium) a po elektroforéze v 1% agarózovém gelu vizualizovány pod UV zářením.

Amplikony byly přečištěny pomocí sady Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Kit (Promega) podle protokolu výrobce. Vzorky byly analyzovány v přístroji NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) a 20 ng DNA bylo sekvenováno pomocí BigDye™ Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific) podle pokynů výrobce. Vzhledem k vysokému obsahu GC v oblasti ITS Escovopsioides bylo do sekvenačních reakcí přidáno 5 % DMSO. Forwardové a reverzní sekvence byly generovány v ABI 3500 (Life Technologies) a sestaveny do kontigů v programu BioEdit v.7.1.3 . Sekvence vytvořené v této studii byly uloženy v NCBI-GenBank (Additional file 1: Table S1).

Fylogenetická analýza

Kromě sekvencí vytvořených v této studii byly z NCBI-GenBank získány sekvence typového druhu (E. nivea) spolu se šesti popsanými druhy Escovopsis a osmi houbami patřícími do Hypocreales (Hypomyces, Trichoderma a Lecanicillium). Celý soubor dat použitý v této studii tak obsahoval sekvence 37 hub (Additional file 1: Table S1).

Pro fylogenetickou analýzu byly sekvence zarovnány v programu MAFFT . Sekvence tef1, ITS a LSU byly spojeny v programu Winclada v.1.00.08. Jako rekonstrukční algoritmus byla použita bayesovská inference. Pro tef1 a ITS/LSU byl vybrán nukleotidový substituční model GTR + G a GTR + I + G pomocí AIC v jModeltest2 s intervalem spolehlivosti 95 %. Byly tedy provedeny rozdělené nezávislé analýzy souboru dat v MrBayes, každá se třemi zahřívanými řetězci a jedním studeným řetězcem. MCMC vzorkování v každé analýze probíhalo až do jednoho milionu generací. Ke konvergenci vyhřívaných a studených řetězců došlo, když byla směrodatná odchylka rozdělených frekvencí nižší než 0,01; poté bylo prvních 25 % generací vyřazeno jako burn-in.

Dual-culture experiments

Provedli jsme testy in vitro, abychom ověřili antagonistický potenciál Escovopsioides vůči houbě pěstované mravenci listnáči. Vybrali jsme 13 z 21 izolátů Escovopsioides (tabulka 3) na základě následujících kritérií: i) jakýkoli polymorfismus zjištěný v genu tef1; ii) různé přidružené druhy mravenců; iii) zeměpisná poloha (tj. různá města a místa sběru). Dva z vybraných izolátů (LESF 596 a LESF 599) již byly hodnoceny z hlediska interakcí s kultivary hub ve studii Varanda-Haifig et al. . Tento test jsme však zopakovali pro porovnání s dalšími izoláty Escovopsioides.

V duálně-kultivačních pokusech byla použita houba Leucoagaricus gongylophorus FF2006 kultivovaná mravencem druhu Atta sexdens rubropilosa. Tento kmen se udržuje na agarových podložkách postupným přenášením každých 24 dní při teplotě 25 °C. Produkce gongylidií tímto kmenem se kontroluje v každém cyklu přenosu. Tato houba byla pěstována na médiu PDA a inkubována při 25 °C po dobu 14 dnů v temnu. Po uplynutí této doby byly fragmenty mycelia (o průměru 8 mm) přeneseny na nové Petriho destičky (90 × 15 mm) obsahující rovněž PDA ve vzdálenosti 1,5 cm od okraje. Tyto destičky byly inkubovány při 25 °C po dobu 14 dnů v temnu. Poté byly ve vzdálenosti 3 cm od mutualistické houby naočkovány fragmenty mycelia (o průměru 8 mm) Escovopsioides, které byly předtím inkubovány na PDA. Pro porovnání účinků Escovopsioides na růst mycelia kultivaru houby s účinky způsobenými jinými houbami jsme použili jeden izolát Escovopsis sp. (LESF 19) z houbových zahrad Atta sexdens rubropilosa (Botucatu, Brazílie). Tento izolát byl získán inokulací malých kousků houbových zahrádek na PDA doplněnou chloramfenikolem. Kontrolní destičky byly naočkovány stejnou mutualistickou houbou, avšak nebyly naočkovány žádné Escovopsioides ani Escovopsis. Všechny destičky byly inkubovány 14 dní při 25 °C ve tmě. Každá kombinace Escovopsioides, Escovopsis a mutualistické houby byla provedena na deseti destičkách. Experimentální a kontrolní destičky byly snímány v intervalech 0, 2, 3, 5, 7 a 10 dnů na skeneru HP Deskjet F2050. Snímky byly použity k měření plochy růstu kolonií (cm2) mutualistické houby v programu ImageJ v. 1.38 .

Plochy růstu mycelia L. gongylophorus v pokusech s dvojkulturami byly analyzovány pomocí dvoucestné smíšené analýzy ANOVA, přičemž jako proměnná mezi subjekty byly použity houbové izoláty (Escovopsioides a Escovopsis) versus kontrola a jako proměnná v rámci subjektu čas (dny), tedy s ohledem na opakované měření času v ošetřeních. Údaje byly zkontrolovány na normalitu a homogenitu rozptylů pomocí Shapiro-Wilkova, respektive Levenova testu. Vzhledem k porušení těchto kritérií byla data v případě potřeby transformována pomocí logaritmu nebo odmocniny. Vícenásobné srovnání s různými vláknitými houbami bylo provedeno pomocí t-testu s Bonferroniho korekcí.

Pro srovnání mezi izoláty byla plocha růstu mycelia L. gongylophorus v kontaktu s izoláty Escovopsioides vydělena průměrnou plochou jeho kontroly v 10. den. Údaje byly zkontrolovány na normalitu a homogenitu rozptylů. Byla provedena jednosměrná ANOVA s plochou získanou v 10. den mezi všemi testovanými houbami, přičemž srovnání mezi jednotlivými ošetřeními bylo provedeno pomocí post-hoc Tukey-HSD testu. Statistické analýzy byly provedeny v programu R v. 2.12.1 .

Bioanalýzy na fragmentech houbových zahrádek v nepřítomnosti dělnic

Leucoagaricus gongylophorus se pěstuje v koloniích attinových mravenců v houbových zahrádkách. Abychom zjistili, zda se Escovopsioides může vyvíjet na houbové zahrádce bez možných ochranných účinků dělnic, provedli jsme biologické testy na fragmentech tohoto substrátu bez přítomnosti mravenců. Fragmenty houbové zahrádky byly získány z jedné dospělé a zdravé kolonie A. sexdens rubropilosa udržované v Centru pro studium sociálního hmyzu (UNESP, Rio Claro). Fragmenty houbové zahrádky o objemu 2 cm3 zbavené mravenců a vývržků byly umístěny do sterilních Petriho misek s navlhčenou vatou na okrajích (podle Elizondo-Wallace et al. ). Před provedením pokusů byly misky ponechány 1 den při 25 °C, aby bylo možné vyhledat mravence, kteří případně zůstali ve fragmentech.

Připravili jsme 10 ml suspenze 0,05% Tween 80 s myceliální hmotou a konidiemi každého z 12 Escovopsioides (izolát LESF 591 nebyl v tomto pokusu použit) a jednoho izolátu Escovopsis použitého v pokusech s duálními kulturami. Tato suspenze byla dvakrát až třikrát přefiltrována podle Newmeyerovy metody, aby se oddělily konidie od fragmentů hyf přítomných v suspenzi. Poté byla suspenze zředěna v Neubauerově komůrce na 105 až 2,105 konidií ml-1 . Alikvoty 100 μl suspenze konidií byly naočkovány na povrch zahradního fragmentu pomocí mikropipety. V rámci negativní kontroly bylo na povrch zahrádky přidáno stejné množství sterilního 0,05% roztoku Tween 80. Petriho misky s houbovou zahrádkou byly uchovávány při teplotě 25 °C po dobu až 10 dnů, přičemž pro každé ošetření bylo použito pět misek a pro každou příslušnou kontrolu pět misek. Případný vývoj hyf inokulovaných hub byl denně pozorován na stereomikroskopu (EZ4, Leica). Konidie Escovopsioides na houbových zahrádkách byly pozorovány tak, že byly odebrány úlomky mycelia rostoucí na zahrádkách, které byly namontovány do vody a pozorovány pod mikroskopem (DM500, Leica).

Údaje o růstu a konidii na houbových zahrádkách byly hodnoceny jako: žádný růst (skóre 0), růst pozorovaný pouze na stereomikroskopu (skóre 1), makroskopický růst (skóre 2) a konidie (skóre 3) po dobu 10 dnů sledování (Additional file 1: Figure S1). Konidiaci jsme pozorovali pouze po makroskopickém růstu houby na houbových zahrádkách. Byl získán celkový součet skóre z pěti Petriho misek v každém dni a převeden v procentech z maximálního možného součtu pro přímé srovnání.

Vliv Escovopsioides na zahrádky s dělnicemi

Dělnice mají důležitou roli v obraně kolonií proti patogenům a nežádoucím mikrobům v houbových zahrádkách . Proto jsme provedli pokusy s cílem ověřit vliv dělnic v houbových zahrádkách inokulovaných konidiemi stejných hub, které byly použity v bioanalýzách na houbové zahrádky v nepřítomnosti mravenčích dělnic (12 izolátů Escovopsioides a 1 izolát Escovopsis).

Bioanalýzy s použitím kolonií mravenců v královské linii jsou náročné vzhledem k velkému počtu kolonií, které by tento typ pokusu vyžadoval. Proto jsme provedli biologické testy s fragmenty zahrad obsahujícími dělnice, abychom posoudili účinky houbových izolátů in vivo. Ačkoli toto experimentální uspořádání nepředstavuje to, co se vyskytuje v přirozených koloniích, ukázalo orientační informace o obranném působení dělnic proti testovaným houbám. Tato biologická zkouška byla upravena podle metody Elizondo-Wallace et al. Byly použity plastové nádoby s malou vrstvou sádry na dně, aby se zabránilo vysychání houbových zahrádek. Do plastových nádob bylo umístěno asi 20 cm3 houbové zahrádky ze stejné kolonie použité v předchozím pokusu. Experimentální sestava obsahovala celkem 84 nádob, takže ošetření s konidiemi 13 hub a kontrola měly po šesti nádobách. Vybrali jsme dělnice mravenců s průměrem hlavohrudi mezi 1,0 a 1,6 mm , do každé nádoby jsme pak umístili 50 těchto dělnic. Dělnice s průměrem menším než 1,0 mm nebyly započítány a dělnice s průměrem větším než 1,6 mm byly vyloučeny. Tento postup byl přijat proto, aby byla zajištěna homogenita mezi šesti kontejnery z každého ošetření i mezi ošetřeními, protože dělnice v intervalu mezi 1,0 a 1,6 mm mají významnou čisticí aktivitu . Vnitřní povrch nádoby byl potažen teflonem® , aby se zabránilo úniku mravenců.

Nádoby byly inkubovány při teplotě 25 °C po dobu 3 dnů, aby se houbové zahrady stabilizovaly. Suspenze konidií byly získány výše popsaným způsobem. Pomocí rozprašovače bylo na povrch houbových zahrádek nastříkáno celkem 1 ml suspenze konidií. Houbové zahrádky v negativní kontrole byly postříkány pouze1 ml sterilního 0,05% roztoku Tween 80.

Pokusy byly sledovány po 0, 5 a 10 dnech inokulace, aby se zkontroloval zdravotní stav houbových zahrádek. Tento parametr byl založen na skórovacím systému, v němž zdravé zahrádky obdržely skóre 0, částečně degradované zahrádky obdržely skóre 1 a zcela degradované („infikované“) zahrádky obdržely skóre 2. Mravenčí odstraňování kusů houbových zahrádek a jejich přidělování na skládky odpadu bylo hlavním znakem zhoršení stavu zahrádek, který jsme zkoumali (viz doplňkový soubor 1: obrázek S2). Skóre získaná ze šesti kontejnerů každého pokusu ve 3 dnech pozorování byla porovnána pomocí Friedmanova testu.

Pro ověření přítomnosti izolátů Escovopsioides na houbových zahrádkách ve dnech 0, 5 a 10 po ošetření byly ze zahrádek odebrány úlomky a naočkovány na MA2% doplněný 150 μg ml- 1 chloramfenikolu. Destičky byly inkubovány při 25 °C po dobu 7 dnů ve tmě. Pro každou ze šesti nádob z každého ošetření bylo použito pět destiček s jedním fragmentem zahrady, celkem 30 destiček pro každé ošetření. Fragmenty s pozitivním růstem byly spočítány a dlouhodobá přítomnost inokulovaných hub v zahrádkách byla testována pomocí Fisherova exaktního testu. V této analýze jsme porovnávali podíl frangmentů infikovaných konidiemi hub (Escovopsioides a Escovopsis) oproti kontrole bez konidií v každém dni pokusu. Porovnávali jsme také různá ošetření s inokulovanými houbami mezi sebou v každém dni pokusu.

.