Jednotlivé nebalancované translokace a inverze (třídy A a C): mechanismy vzniku

Přímým výsledkem této studie je, že u 20 z 37 de novo nebalancovaných translokací má duplikace mateřský původ (obr. 1, Online zdroj 1: tabulka S2). Vzhledem k tomu, že vyšetřování rodičovského původu nebylo informativní nebo nebylo možné v šesti případech (případy 7, 14, 23, 24, 33 a 35), představují de novo nebalancované translokace, u nichž je duplikovaná oblast mateřského původu, 64,5 % (20/31) plně informativních případů. Kombinací těchto údajů a zjištění, že v osmi z těchto případů (případy 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 a 32) byly nalezeny tři alely (obr. 1, Online Resource 1: Table S2), dvě mateřské a jedna otcovská, byly přítomny alespoň v části duplikační oblasti, se rýsuje scénář, že v nejméně 25 % (8 z 31) je primárním faktorem výskytu de novo nebalancovaných translokací mateřská meiotická nedisjunkce, po níž následuje částečná záchrana trizomie supernumerického mateřského chromozomu (obr. 1a). Nejpravděpodobnějším vysvětlením přítomnosti tří alel v duplikované oblasti, dvou mateřských a jedné otcovské, by byla nedisjunkce při mateřské meióze I (mat-MI) (obr. 1A.I). Alternativně musela nedisjunkci v mateřské meióze II (mat-MII) předcházet meiotická rekombinace proximálně nebo v místě translokačního zlomu. Naproti tomu u 12 případů (4-6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 a 37) se stejným mateřským duplikovaným haplotypem nelze vyloučit jiné mechanismy (obr. 1b), ačkoli mohly být také důsledkem buď nedisjunkce mat-MI (obr. 1A.I), nebo po telomerním crossing-overu, podle přednostního výskytu telomerních crossoverů prokázaného u některých nedisjunkčních chromozomů (Oliver et al. 2014) nebo mateřské MII (mat-MII) nedisjunkce (obr. 1A.II), jak bylo zaznamenáno v řadě případů záchrany trizomie (přehled v Chantot-Bastaraud et al. 2017).

Je dobře známo, že anafázové zpoždění nadpočetného chromozomu následované jeho zachycením v mikrojádře je základem mnoha případů chromotripsy (Zhang et al. 2015; Ly et al. 2017; Zhu et al. 2018). V důsledku toho je v jedné dceřiné buňce nadpočetný chromozom eliminován, zatímco v druhé může roztříštění genomového materiálu mikrojádra následované opětovným usazením všech nebo některých fragmentů uvnitř hlavního jádra vést k masivní reorganizaci původního chromozomu, který si buď zachová většinu svého materiálu, i když reorganizovaného v novém pořadí, nebo některé své části ztratí (obr. 1). 1a), přičemž to, které části původního nadpočetného chromozomu se ztratí a které zůstanou zachovány, může záviset na stochastických událostech, na náchylnosti přerušených konců k integraci mezi sebou nebo s jinými částmi genomu a/nebo na následném výběru buněk, které mohou přežít a množit se za přítomnosti minimální segmentální nerovnováhy. Teoreticky mohou být centrické fragmenty zachovány jako nadpočetné markerové chromozomy jejich cirkularizací s vytvořením kruhových chromozomů, čímž se překoná absence telomerické sekvence na obou koncích. Zachování supernumerárních intersticiálních centrických fragmentů vyžaduje rovněž vytvoření neocentromery nebo alternativně zachycení fragmentu jiným chromozomem s vytvořením de novo inzertní translokace. Kato et al. skutečně (Kato et al. 2017) nedávno popsali případ de novo intersticiální translokace vzniklé chromotripsí nadpočetného chromozomu přítomného v trisomické zygotě. A konečně zachování nadpočetných fragmentů vybavených telomerou na jednom konci vyžaduje buď zachycení telomery, např. translokaci nadpočetného markerového chromozomu, jak uvádí Vetro et al. (2012) (případy 2 a 3), nebo její zachycení jiným chromozomem, recipientním, který ztratí svou distální část, čímž vznikne 46chromozomová buňka s nebalancovanou de novo translokací, jak je popsáno zde. Případ 6 s duplikací stejného mateřského haplotypu (obr. 1, Online Resource 1: Table S2) skutečně ilustruje výskyt události chromotripsy (obr. 1a), jak ukazuje přítomnost dvou nesousedících duplikovaných oblastí oddělených ~ 1,3 Mb, z nichž ta intersticiální má inverzní orientaci (Online Resource 2: Figure S15). Události chromotripse byly pozorovány v řadě případů de novo nebalancovaných translokací (Weckselblatt et al. 2015) a u většiny z nich bylo zjištěno, že jsou otcovského původu a zahrnují více než dva chromozomy (Marcozzi et al. 2018). Naproti tomu nebalancovaná translokace v našem případě 6 byla mateřského původu a skutečně de novo, což je v souladu s FISH vyšetřením rodičovských metafází. Navíc, alespoň jak bylo posouzeno na základě vyšetření aCGH s vysokým rozlišením (1M) a FISH, zahrnovala pouze dva chromozomy, zatímco složitější přestavba byla vyloučena. Proto je lákavé spekulovat, že zygota nebo rané embryo bylo trizomické pro chromozom 8 buď z důvodu meiotické, nebo postzygotické mateřské nedisjunkce. Po roztříštění nadpočetného chromozomu 8 následovalo obnovení pouze dvou nesousedících částí, včetně telomerní, které, když už byly sešity zpět, získal příjemce 18q (obr. 1a).

Model vzniku de novo nebalancovaných translokací, vycházející z trisomické zygoty, odpovídá i případu 24, i když jsme nemohli provést žádné podpůrné molekulární šetření. Přítomnost reziduální buněčné linie trisomické pro chromozom 9 spolu s hlavní linií s normálním karyotypem a třetí s nebalancovanou translokací t(14;9) však naznačuje, jak mohou počínaje trisomickou zygotou vznikat různé buněčné linie, některé s úplnou ztrátou nadpočetného chromozomu a jiné se ztrátou jeho části (9p) a jeho zbytkovou částí (celý 9q) zachycenou jiným chromozomem. Tento typ mozaiky tří buněčných linií byl dokumentován zřídka (Phillips et al. 1997), ale v prenatální diagnostice jsou mozaiky s jednou normální buněčnou linií a druhou s de novo nebalancovanou translokací poměrně časté a u většiny z nich lze zjistit zvýšený věk matky (Kovaleva a Cotter 2017; Van Opstal et al. 2018).

Nezávislou podporou hypotézy, že mateřská nedisjunkce je hlavním spouštěčem de novo nebalancovaných translokací, je zvýšený mateřský věk. V našich osmi případech (případy 1, 2, 9, 11, 15, 19, 28 a 32), kde byla duplikace bezpochyby spojena s mateřskou meiotickou nedisjunkcí (dvě různé mateřské alely v oblasti duplikace), bylo skutečně doloženo zvýšení průměrného věku matky (34,75 let, Online Resource 1: Table S1), přičemž je třeba vzít v úvahu, že průměrný věk matky v Itálii v roce 2016 činil 31,8 let (ISTAT, https://www.istat.it/). Zvýšení (33,5 roku) bylo rozpoznáno také u 12 případů (případy 4, 5, 6, 10, 12, 13, 17, 22, 26, 30, 34 a 37) s duplikací stejné mateřské alely, což je slučitelné s mateřskou nedisjunkcí jako iniciační událostí. Dokonce i v případech, kdy byla duplikace otcovská, bylo prokázáno zvýšení, i když mnohem omezenější, průměrného věku matky (32,6 let), což možná naznačuje, že při vzniku těchto nevyvážených translokací mohou hrát roli i jiné mechanismy než mateřská nedisjunkce. Ve čtyřech případech (3, 8, 29 a 36) analyzovaných pomocí SNP array skutečně nebyla přítomna mateřská heterodisomie v neduplikované části homologních chromozomů (Online Resource 1: Table S2), jak by se dalo očekávat u trizomické zygoty, u níž nadpočetný otcovský chromozom prošel chromotripsí se záchranou pouze telomerní části. Vezmeme-li tedy v úvahu i zanedbatelnou frekvenci trizomií pocházejících z missegregace v otcovské meióze (Nagaoka et al. 2012), jeví se výskyt nebalancovaných translokací zažehnaných částečnou trisomickou záchranou otcovské trisomické zygoty jako velmi nepravděpodobný. Místo toho se jako pravděpodobnější jeví jiné mechanismy, například zděděný nebo postzygotický dvouřetězcový paternální zlom vyžadující opravu zachycením telomer (obr. 1b). Případ 25, který je mozaikový pro dvě buněčné linie, přítomné v krvi a ve fibroblastech, s terminální delecí 2q a derivačním chromozomem der(2)t(2q;14q) otcovského původu (Online Resource 2:Figure S9), této hypotéze skutečně odpovídá. V přítomnosti terminální delece se tedy mohou v různých buňkách raného embrya vyskytovat různé opravné mechanismy v různých časech, což nakonec vede k mozaikovému stavu. V tomto modelu iniciuje událost translokace deletovaný chromozom, který funguje jako recipientní, zatímco duplikovaný je dárcem, který funguje jako oprava zranění (obr. 1b). Není však možné rozlišit, zda je delece skutečně první událostí vedoucí k translokaci, nebo je naopak sekundární při vzniku dicentrického chromozomu (obr. 1BIII a IV), který v důsledku svého asymetrického roztržení vytváří inv-dup del chromozom a jednoduše deleční chromozom, ten je pak opraven zachycením telomer (obr. 1b). Je možné, že přetrvávání dicentra po prvních embryonálních děleních má za následek zlomy různé velikosti v různých buňkách, opět opravené buď telomerázou, nebo zachycením telomer.

Pozoruhodné je, že ať už je mechanismus jakýkoli, byla zjištěna vysoká prevalence případů, kdy obě dysbalance mají stejný rodičovský původ (obr. 1, Online Resource 1: Table S2), přestože podle postzygotické finální události by se v polovině případů očekával biparentální původ delece a duplikace. Vysvětlení může poskytnout průkaz odlišné kompartmentalizace obou sad rodičovských chromozomů u myších embryí do 8buněčného stadia (Du et al. 2017). Jelikož se toto období shoduje s velmi vysokou chromozomální nestabilitou, (McCoy et al. 2017), je lákavé spekulovat, že mechanismus, jako je zachycení telomer, nezbytný pro stabilizaci dřívější strukturální abnormality, se vyskytuje na stejné rodičovské chromozomální sadě původní anomálie. Naproti tomu by se očekávalo, že další pozdější přenastavení proběhne náhodně a bude zahrnovat chromozomy obou rodičovských původů, což by vedlo k nebalancovanému translokačnímu chromozomu biparentálního původu, jak jsme skutečně zjistili v pěti případech (případy 10, 12, 27, 30 a 31; obr. 1, Online zdroj 1: tabulka S2).

Stejně jako u přestaveb třídy C jsme u junkčních zlomových bodů nezjistili žádné zvláštnosti, které by mohly objasnit, zda je jejich stabilizace zachycením telomery chromozomální části opačné k odstraněné způsobena jiným mechanismem ve srovnání s případy, kdy je zachycení telomery závislé na jiném chromozomu. Tuto analýzu však bylo možné provést pouze ve dvou případech. Zjištění, že ve 4 z 5 případů byly delece i duplikace otcovského původu, naznačuje, že pocházejí buď z původní delece, nebo ze zlomu dicentrického chromozomu.

Komplexní nebalancované translokace a inverze (třídy B a D)

Všeobecně panuje shoda, že tyto přestavby vznikají přechodným dicentrickým, po jeho asymetrickém zlomu vedoucím k inv-dup del a jednoduše delečnímu chromozomu (obr. 1B.III). K získání stabilizující telomerické sekvence může dojít různými způsoby: telomerázou zprostředkovaným přidáním de novo sekvencí TTAGGG, zachycením telomer distální části jiného chromozomu (Yu a Graf 2010) nebo opačné části téhož chromozomu (Buysse et al. 2009; Fan a Siu et al. 2001), nebo dokonce vytvořením kruhového chromozomu (Rossi et al. 2008). Dva případy translokace inv-dup del(8p), které jsme mohli genotypizovat (případy 42 a 44), vznikly podle očekávání (Giglio et al. 2001) NAHR u mat-MI, jak dokládá přítomnost dvou mateřských a jedné otcovské alely v oblasti duplikace 8p (Online zdroj 1: tabulka S2). Tato opakující se abnormální rekombinace je zprostředkována vysoce identickými segmentálními duplikacemi umístěnými na 8p23 v rámci normálního a invertovaného chromozomu 8 (Giglio et al. 2001). V zygotě bude výsledný dicentrický chromozom pravděpodobně podléhat různým zlomům v různých buňkách, což někdy vede k mozaikovému stavu s buněčnou linií del(8p) a druhou s inv-dup del(8p) (Hand et al. 2010), nebo ve výjimečných případech dokonce třetí s inv-dup del(8p) končící distální oblastí jiného chromozomu (Pramparo 2004). Tyto mozaiky jsou častěji detekovány v prenatální diagnostice, zatímco v postnatálním životě je nejčastějším nálezem alespoň v krvi jediná buněčná linie s inv-dup del(8p), ať už translokací, nebo bez ní. V našich třech případech s translokací (případy 42, 43 a 44) byly telomery dány 6q, 17p, respektive Xq, všechny mateřského původu a se stejným duplikačním haplotypem mateřských chromozomů 6, 17 a X, jak se očekává u stabilizační události, ke které došlo postzygoticky. Ve zbývajících třech případech (případy 39, 40 a 45), které jsou stejně jako všechny inv-dup del přestavby nezasahující 8p neopakující se, byl translokovaný inv-dup otcovského původu s identickými otcovskými alelami v oblasti duplikace, zatímco zachycení telomer bylo ve dvou případech zajištěno chromozomem otcovského původu (případy 39 a 49, Online zdroj 2.): S3, S4) a mateřský ve třetím případě (případ 45), což byl plod, u něhož byl translokační chromozom t(inv-dup5p;3q) v mozaice s buněčnou linií obsahující netranslokační inv-dup del(5p) (online zdroj 2: obrázek S12). Pozoruhodné je, že duplikace 5p má v obou buněčných liniích různou velikost (Online zdroj 1: tabulka S1), což skutečně ukazuje, že původní dicentrický chromozom byl pravděpodobně přítomen v zygotě nebo ve velmi raném embryu (obr. 2). 1b), prodělal v různých buňkách mimo štěpné stadium embrya různé zlomy.

Identické duplikované alely byly bona fide zaznamenány u všech inv-dup del přestaveb nezasahujících 8p, což svědčí o intrachromozomálním původu těchto přestaveb (Hermetz et al. 2014). V souladu s tím se zdá, že tyto inv-dup translokační přestavby jsou konečným výsledkem počáteční mitotické události, pravděpodobně v raném embryu (Voet 2011), jako je dvouřetězcový zlom následovaný intrařetězcovým párováním v relativně blízkých místech inverzních homologních sekvencí, což vede ke vzniku dicentrického chromozomu s interponovanou oblastí normální kopie (Hermetz et al. 2014; Rowe et al. 2009). Jak již bylo zmíněno, reciproční produkt inv-dup del, tedy odstraněný chromozom, může být opraven a stabilizován zachycením distální části nehomologního chromozomu nebo opačného ramene téhož chromozomu, což vede k jednoduché nebalancované translokaci, respektive inverzi, jak navrhujeme u některých přestaveb uvedených ve třídách A a C (obr. 1). 1b).

Zlomové junkce

Sekvenování zlomové translokační junkce bylo možné provést ve 26 případech (Online zdroj 1: tabulka S1, Online zdroj 2: obrázek S1), ačkoli ve 4 případech kryptická složitost (případy 4, 10, 28 a 51) bránila jemnému sekvenování. V 16 případech (případy 3, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 18, 22, 27, 30, 39, 40, 44, 50 a 52) byly zjištěny znaky alternativního nehomologního spojování (alt-NHEJ) nebo replikace zprostředkované mikrohomologií (MMBIR), jako jsou mikrohomologie a šablonovité nebo nešablonovité malé inzerce (Online Resource 2: Figure S1). Pozoruhodné je, že ačkoli v případech 18 a 40 došlo k přestavbě v rámci Alu sekvencí, přítomnost 5 bp krátké šablonovité inzerce, resp. 4 bp mikrohomologie ukázala, že přestavba neproběhla mechanismem zprostředkovaným NAHR, ale spíše alt-NHEJ nebo MMBIR. Kanonická NHEJ (c-NHEJ, tupé konce spojů) se vyskytla ve čtyřech případech (případy 26, 29, 31 a 43). V případech 2 a 38 se zlomové spoje nacházely na okraji homologního retrotranspozonu (Online zdroj 2: obrázek S13). Toto zjištění naznačuje, že v menšině případů tyto sekvence usnadňují opravné mechanismy, jako je zachycení telomer. Ačkoli Robberecht a kol. zjistili, že většina jejich de novo nebalancovaných translokací byla zprostředkována NAHR mezi LINE, HERV nebo segmentálními duplikacemi (Robberecht a kol. 2013), můžeme NAHR událost vyloučit přinejmenším v případě 2, kde přítomnost dvou duplikovaných mateřských haplotypů, z nichž jeden je translokován na recipientní chromozom, jasně ukazuje na nedisjunkci mat-MI (obr. 1, Online Resource 1: Tabulka S2), což znemožňuje připsat translokaci meiotické události. Bylo totiž prokázáno, že retrotranspoziční události zprostředkované LINE-1 se vyskytují v somatických buňkách raného lidského embrya, v lidských embryonálních kmenových buňkách a přinejmenším u myší hlavně v embryogenezi (přehled Kazazian a Moran 2017), což podporuje, že i v našich případech byl vznik translokace postzygotickou událostí.

Kombinace těchto znaků naznačuje, že za spojení donorového chromozomu s příjemcovým, případně s opačnou částí téhož chromozomu, jsou zodpovědné mechanismy založené na opravách (c-NHEJ a alt-NHEJ) a mechanismy replikačních oprav (MMBIR) (obr. 1).

Vztah genotyp-fenotyp

Ačkoli korelace genotyp-fenotyp u velkých nebalancovaných přestaveb, jako jsou ty uváděné v naší studii, jsou obecně poměrně hrubé, námi uváděné údaje přidávají i v této souvislosti některé další podrobnosti.

Silný důkaz, že některé nebalancované translokace pocházejí ze zygoty se supernumerárním chromozomem, který prošel chromotriptickou událostí, naznačuje, že oblast duplikace, ačkoli se zřejmě skládá pouze z distální oblasti chromotriptického chromozomu, může obsahovat fragmenty z jiných částí, jak je tomu v našem případě 6 a jak ukázali Weckselblatt et al. (2015). Pokud je v těchto případech velikost roztříštěných kousků nižší než ta, kterou lze detekovat pomocí array CGH, hrozí, že abnormální fenotyp bude přisouzen pouze genům, které se jeví jako duplikované nebo odstraněné, zatímco další morbidita může být způsobena abnormální expresí genů vzniklých narušením TAD (Fukami et al. 2017).

U nebalancovaných translokací pocházejících z částečné záchrany trizomie by navíc v případě, že by se chromotripsie vyskytla na nadpočetném chromozomu otcovského původu, mohla následující mateřská hetero/izodisomie pro zbývající dva chromozomy generovat další patogenitu (Niida et al. 2018) buď redukcí do homozygotního stavu variant způsobujících onemocnění přítomných u matky v heterozygotním stavu, nebo v důsledku přítomnosti imprintovaných genů, které jsou exprimovány pouze otcovskou alelou.

Nakonec je lákavé spekulovat, že volba toho, která telomera je zachycena pro stabilizaci porušeného chromozomu, nemusí být náhodná, ale ovlivněná deregulací původních TAD (Topologically Associated Domains), což zase vytváří příznivý substrát pro specifické mezichromozomální kontakty a prostorovou 3D kompartmentalizaci chromatinu (Dekker a Mirny et al. 2016).