PARADIGMY ROLE INTERAKCÍ CD40-CD40L V NEMOCI

Transplantace. Transplantační chirurgie by nedosáhla takového stupně úspěchu, jaký byl zaznamenán v posledních desetiletích, bez vývoje účinných imunosupresiv, která minimalizují riziko odmítnutí transplantátu. Monoklonální protilátka (MAb) proti CD40L byla použita jako imunosupresivní léčba na mnoha zvířecích transplantačních modelech. U primátů podání anti-CD40L MAb zpomaluje rejekci transplantátu, zatímco kombinace s CTLA4Ig, chimérickým proteinem sestávajícím z extracelulární domény povrchové buněčné molekuly CTLA-4 a Fc oblasti lidského IgG1, který blokuje dráhu CD28-B7, má aditivní a synergické účinky. Tato kombinovaná léčba udržuje přežití ledvinových alograftů u primátů a zvyšuje přežití kožních štěpů u myší (53, 69). Přechod na léčbu anti-CD40L MAb po 60 dnech konvenční imunosuprese pomocí CsA byl účinnou léčbou v modelu ledvinového alograftu u opic, přestože je známo, že CsA snižuje expresi CD40L na T buňkách (7). Bylo prokázáno, že exprese genu CD40L se v případech akutní rejekce zvyšuje čtyřnásobně. To by mohlo sloužit jako neinvazivní metoda pro sledování funkce alograftu a také pro stanovení biologické odpovědi na klasické imunosupresivní látky, jako je CsA a takrolimus, o nichž je známo, že inhibují indukci CD40L (54). Na zvířecích transplantačních modelech inhibitory kalcineurinu potlačují expresi CD40L na T-buňkách in vitro, ale ne v lymfoidní tkáni, což naznačuje, že dráha CD40-CD40L zůstává během léčby těmito látkami funkční, což může přispívat k odmítnutí alograftu v klinickém prostředí (63).

Ateroskleróza. Současný pohled na aterosklerózu, nejrozšířenější smrtelné onemocnění v západním světě, je pohled na chronické, degenerativní, zánětlivé onemocnění, u kterého se předpokládá, že imunitní systém hraje důležitou roli. CD40 a CD40L jsou nadměrně exprimovány v experimentálních a lidských aterosklerotických lézích. Ligace CD40 na typech buněk asociovaných s ateromem, jako jsou endotelové buňky, buňky hladkého svalstva a makrofágy, vede ke zvýšené expresi mediátorů rozvoje aterosklerózy, jako jsou cytokiny, chemokiny, růstové faktory a metaloproteinázy. Blokování interakcí CD40-CD40L pomocí anti-CD40L MAb u myší vede ke snížení tvorby a progrese myšího ateromu, ale také podporuje takové změny v biologii a struktuře léze, které mohou být důležité pro stabilizaci plaku u lidského onemocnění (52).

Trombocyty také exprimují CD40L a předpokládá se, že významně přispívají k náboru zánětlivých buněk do poškozeného endotelu in vivo (5). Aktivované T-buňky exprimující CD40L se nacházejí ve stěně aterosklerotických cév, což podporuje hypotézu, že aktivované CD4+ T-buňky mohou organizovat aterosklerotický proces (43).

Další onemocnění, u nichž může hrát dvojice CD40-CD40L roli, jsou stručně uvedena v tabulce 1. Níže následuje stručná diskuse o úloze této interakce u autoimunitních onemocnění systémový lupus erythematodes (SLE), revmatoidní artritida (RA) a polymyozitida.

SLE. (i) Exprese CD40L u lidského SLE (tabulka 2). Desai-Mehta a kol. uvedli, že mononukleární buňky periferní krve (PBMC) pacientů s aktivním lupusem vykazují 21násobné zvýšení procenta CD40L+ CD4+ buněk ve srovnání se zdravými osobami. Při další stimulaci PBMC anti-CD3 MAb se procento CD40L+ CD4+ buněk zvýšilo pětinásobně u zdravých subjektů, ale pouze 1,4násobně u pacientů s aktivním SLE. Procento CD40L+ T buněk však stále zůstávalo vyšší ve skupině pacientů s aktivním SLE. PBMC od pacientů se SLE v remisi se chovaly podobně jako u kontrolní skupiny. Podobná pozorování se týkala exprese CD40L u CD8+ T buněk čerstvě izolovaných od pacientů s aktivním-SLE (22krát vyšší exprese než u kontrolní skupiny). B buňky nadměrně exprimují CD40L u pacientů s aktivním-SLE v míře srovnatelné s mírou pozorovanou u aktivovaných T buněk. Normální lidské B buňky exprimují velmi nízké hladiny CD40L a pouze při manipulaci, na rozdíl od B buněk aktivního-SLE, které exprimují CD40L spontánně (12).

Ve studii publikované Koshy et al. vykazovaly aktivované PBMC zdravých subjektů nebo pacientů s kontrolou onemocnění vysoce intenzivní expresi CD40L s postupným poklesem na hodnoty blízké výchozím po 48 h, zatímco PBMC s lupusem vykazovaly v tomto časovém bodě nadále významně vyšší hladiny CD40L. V této studii nebyla zjištěna žádná zjevná korelace exprese CD40L s aktivitou onemocnění (33).

Higuchi et al. potvrdili tyto výsledky jak u SLE, tak u myšího lupusu, což naznačuje, že ektopická exprese CD40L v B buňkách lupusu může hrát klíčovou roli při rozvoji SLE. Transgenní myši náchylné k lupusu, které exprimují CD40L na B buňkách, spontánně produkují autoprotilátky a navíc se u poloviny těchto myší vyvíjí glomerulonefritida s ukládáním imunitních komplexů (22). Devi et al. rovněž potvrdili vysokou expresi CD40L na T a B buňkách lupusu. Konkrétně 45 % T buněk pacientů se SLE exprimuje CD40L ve srovnání s pouhými 8 až 18 % T buněk zdravých osob nebo pacientů s RA. Navíc 30 % ze 48 zkoumaných pacientů se SLE mělo zvýšenou expresi CD40L i na B buňkách (13). Na rozdíl od výše uvedených výsledků však existuje jedna zpráva, ve které nebyly zjištěny žádné změny v expresi CD40L v lupusových lymfocytech. Místo toho tito autoři uváděli vysokou expresi CD86 na B buňkách SLE, což je rovněž důležitá kostimulační molekula (3). Jiná studie uvádí, že monocyty pacientů s aktivním SLE aberantně exprimují CD40L. Bylo studováno 23 pacientů s aktivním SLE a porovnáno se 16 zdravými jedinci. Výsledky ukázaly sedminásobné zvýšení frekvence periferních monocytů exprimujících CD40L u pacientů se SLE ve srovnání se zdravými osobami. Exprese CD40L byla ověřena na úrovni mRNA i proteinu a významně korelovala s aktivitou onemocnění (28).

CD40L je z povrchu buněk aktivovaných T-buněk odštěpován matrixovou metaloproteinázou, přičemž se uvolňuje sCD40L, molekula o velikosti přibližně 18 až 20 kDa, která tvoří homotrimery. Zpráva zkoumající funkční úlohu sCD40L dospěla k závěru, že sCD40L může vyvolat aktivaci a diferenciaci B-buněk. Plazmatické hladiny sCD40L byly významně vyšší u pacientů s aktivním SLE než u zdravých dárců. Tyto hladiny korelovaly s aktivitou onemocnění hodnocenou pomocí SLEDAI a titry cirkulujících autoprotilátek proti dvouvláknové DNA (dsDNA). Byla vyslovena hypotéza, že vysoké hladiny sCD40L zjištěné u pacientů s aktivním-SLE mohou hrát patogenetickou roli při vaskulitidě a při nefritidě vyskytující se u aktivního lupusu. Autoři navrhli, že hladiny sCD40L by mohly v budoucnu sloužit jako prediktivní marker vzplanutí onemocnění SLE (27). Vakkalanka et al. rovněž prokázali významně vyšší průměrné koncentrace sCD40L u pacientů s lupusem než u kontrol onemocnění a zdravých osob. Konkrétně studovali 66 pacientů se SLE a porovnávali je s 30 pacienty s kontrolou onemocnění a 23 zdravými osobami. U zdravých osob byl sCD40L téměř nedetekovatelný, zatímco 38 pacientů se SLE mělo hladinu sCD40L vyšší než 2 ng/ml (s průměrnou koncentrací 2,61 ± 2,15 ng/ml) a pouze 7 pacientů s kontrolou onemocnění mělo hladinu sCD40l vyšší než 1 ng/ml. Pacienti byli rozděleni do tří skupin, těžké, středně těžké a lehké, podle klinických projevů. Pacienti s těžkým SLE měli průměrnou koncentraci sCD40l 3,93 ± 2,86 ng/ml, pacienti se středně těžkým SLE měli průměrnou koncentraci sCD40l 2,81 ± 1,57 ng/ml a konečně pacienti s mírným onemocněním měli průměrnou koncentraci sCD40l 1,52 ± 1.06 ng/ml, což naznačuje korelaci mezi hladinou sCD40L a aktivitou onemocnění (62).

Přestože indukce CD40L na aktivovaných normálních T-buňkách je v přítomnosti CsA inhibována, je zajímavé, že tento účinek neplatí pro T-buňky SLE. Studie exprese CD40L u lidského lupusu dospěla k závěru, že CsA nedokáže inhibovat prodlouženou a zvýšenou expresi CD40L, pozorovanou in vitro na T buňkách lupusu aktivovaných anti-CD3 MAb. Rezistence vůči CsA byla nezávislá na aktivitě onemocnění. Cirkulující lupusové monocyty rovněž vykazují výraznou rezistenci vůči inhibičním účinkům CsA na expresi CD40L. Tyto výsledky naznačují, že indukce CD40L na T buňkách SLE může být regulována cestou nezávislou na vápníku/kalcineurinu (29).

Není jasné, proč je exprese CD40L u pacientů se SLE vyšší a zda má tato nadměrná exprese patogenetické důsledky. Bylo navrženo, že T-lymfocyty SLE při aktivaci zapojením TCR upřednostňují profil s dominancí NFAT namísto vyváženého profilu transkripčních faktorů NFAT-AP-1. V tomto případě se jedná o tzv. Tento panel intracelulárních mediátorů podporuje transkripci a stabilitu mRNA určitých genů, včetně genu CD40L. Časná exprese CD40L na T buňkách SLE vyžaduje dráhu NFAT citlivou na CsA, ale prodloužená exprese je více závislá na specifické MAP kináze, tj. kináze regulované extracelulárním signálem. Zvýšená a přetrvávající aktivita kinázy regulované extracelulárním signálem v T buňkách lupusu by mohla přispívat k nadměrné expresi CD40L prostřednictvím aktivace transkripčního faktoru AP-1 a pravděpodobně stabilizací mRNA CD40L (10, 68). Cytoplazmatické toky Ca2+ jsou v cirkulujících T a B buňkách pacientů se SLE nadnormální a předpokládá se, že tato abnormalita může představovat molekulární pozadí abnormální exprese CD40L u lupusu (38, 40, 64). Existují také důkazy, že nedostatek řetězce TCR ζ, který byl popsán u pacientů se SLE, může být částečně zodpovědný za výše zmíněnou supranormální odpověď Ca2+ (39, 61). Tato souvislost byla posílena nedávnou zprávou, že transfekční korekce deficitu řetězce TCR ζ v T buňkách lupusu vede k normalizaci cytoplazmatických toků Ca2+ (48).

(ii) Použití anti-CD40L MAb v modelech lupusu a u SLE. Mnohočetné funkce CD40/CD40L v imunitní odpovědi z něj učinily atraktivní cíl pro terapeutický zásah u autoimunitních onemocnění. MAb proti CD40L byly zpočátku testovány na modelech myšího lupusu. Léčba myší F1 typu New Zealand Black × New Zealand White (NZB × NZW) kontinuálními infuzemi MAb proti CD40L vedla k oddálení nástupu onemocnění v průměru o 4 měsíce, snížení hladin autoprotilátek IgG anti-dsDNA, oddálení akumulace T buněk s aktivovaným paměťovým fenotypem, snížení počtu B buněk ve slezině a potlačení přepínání tříd Ig a somatických mutací. Sérové hladiny IgG anti-dsDNA protilátek byly 4 až 10krát nižší než u neléčených věkově odpovídajících kontrol. Po ukončení léčby se fenotyp T-buněk léčených myší stal nerozlišitelným od fenotypu kontrol a B-buňky dosáhly plně aktivovaného fenotypu se zvýšením titrů IgG anti-dsDNA a rozvojem proteinurie a progresivního onemocnění ledvin (65).

V jiné studii byla použita kombinovaná léčba protilátkou anti-CD40L a CTLA4Ig. Krátkodobá kombinovaná léčba NZB×NZW F1 prenefritických myší vedla k opožděnému nástupu renální dysfunkce po dobu přibližně 6 měsíců. Po nástupu proteinurie byla opakovaná léčba schopna navodit remisi u dříve léčených myší, ale ne u dříve neléčených myší. Došlo ke snížení hladiny IgG anti-dsDNA autoprotilátek a myší slezina byla výrazně ochuzena o B buňky, a to i 16 až 20 týdnů po infuzi. Předpokládá se, že léčba CTLA4Ig a anti-CD40L MAb může působit synergicky a blokovat antiapoptotické signály, a tím usnadňovat apoptózu B buněk během časné aktivace B buněk. Tato léčba nezpůsobila dlouhodobou globální imunosupresi (66).

Slibné výsledky získané v experimentálních studiích na zvířatech nebyly potvrzeny u SLE. U lidského lupusu zůstává cyklofosfamid „zlatým standardem “ pro léčbu závažného orgánového postižení. Cyklofosfamid je alkylační látka, která způsobuje nespecifickou inhibici imunitní odpovědi a klinicky významnou imunosupresi. Má významné nežádoucí účinky, včetně karcinomu močového měchýře a selhání gonád, což vyvolává potřebu nových terapeutických intervencí. Podávání cyklofosfamidu je zavedenou léčbou lupusové nefritidy, která je častou a obávanou komplikací SLE a jednou z hlavních příčin morbidity a mortality.

Byly publikovány dvě studie podávání anti-CD40L MAb u lidského lupusu. Do první, dvojitě zaslepené, placebem kontrolované multicentrické studie fáze 2, bylo zařazeno 85 pacientů s mírným až středně aktivním SLE, kteří v průběhu 16 týdnů dostali 6 injekcí IDEC-1 (anti-CD40L MAb) nebo placeba. Účinnost byla hodnocena ve 20. týdnu, především pomocí SLEDAI. Výsledky ukázaly, že léčba přípravkem IDEC-1 byla bezpečná a dobře snášená, ale neprokázala účinnost ve srovnání s placebem (19, 26).

Druhá studie hodnotila pacienty s biopticky prokázanou proliferativní lupusovou nefritidou pomocí BG9588 (anti-CD40L MAb). Do studie bylo zařazeno 28 pacientů s aktivní proliferativní lupusovou nefritidou, kteří dostávali 20 mg přípravku BG9588/kg tělesné hmotnosti v dvoutýdenních intervalech po dobu prvních tří dávek a v měsíčních intervalech po dobu dalších čtyř dávek. Výsledky ukázaly 50% snížení proteinurie (pokud byla přítomna) bez zhoršení renálních funkcí, vymizení hematurie a zvýšení sérové koncentrace C3. Titry autoprotilátek proti dsDNA se po léčbě snížily s průměrným snížením o 38,8 %, 50,1 % a 25,3 % po 1, 2 a 3 měsících od zahájení léčby (4). Tato studie byla předčasně ukončena z důvodu tromboembolických komplikací. Konkrétně byly hlášeny dva případy infarktu myokardu. Trombotické účinky komplikující tento léčebný režim vyvolaly důležité otázky týkající se budoucích studií s lidmi. Je třeba poznamenat, že žádný z pacientů, u nichž došlo k trombotické příhodě, neměl prokazatelné antifosfolipidové protilátky. Úloha interakce CD40-CD40L v těchto trombotických komplikacích zůstává nejasná a hypotetická.

Studie 5 pacientů s lupusovou nefritidou, kteří dostávali anti-CD40L terapii, ukázala, že krátká léčba vede ke snížení počtu B buněk produkujících IgG anti-DNA protilátky. Tyto změny přetrvávaly několik měsíců po ukončení léčby (25). Podobná studie u čtyř pacientů s aktivní lupusovou nefritidou, kteří dostávali anti-CD40L léčbu (BG9588), ukázala, že během anti-CD40L léčby vymizely z periferie B buňky exprimující CD38, CD5 a CD27, které jsou považovány za markery diferenciace B buněk. Tyto změny byly spojeny s poklesem hladin anti-dsDNA protilátek, proteinurie a indexu aktivity onemocnění SLE (20).

RA. (i) Exprese CD40L u RA (tabulka 2). RA je běžné autoimunitní systémové revmatické onemocnění charakterizované chronickým tkáňovým destruktivním procesem připisovaným možné probíhající imunitní odpovědi řízené antigenem. Protože se předpokládá, že klíčovou roli hrají aktivované T buňky, není překvapivé, že interakce CD40-CD40L byly studovány v souvislosti s RA.

Berner et al. studovali expresi CD40L na T buňkách pacientů s RA. Studovali 62 pacientů s RA a 20 zdravých osob. CD40L byl silně exprimován na >10 % T buněk u 29 % pacientů s RA, ale na 0 % T buněk u zdravých kontrol. Pacienti s RA s >10 % CD4+ CD40L+ T buněk měli aktivnější onemocnění. Osmdesát tři procent pacientů v této skupině mělo zvýšenou hladinu C-reaktivního proteinu, 89 % bylo pozitivních na revmatoidní faktor (RF) a žádný z nich nesplňoval kritéria American College of Rheumatology pro kompletní klinickou remisi, což naznačuje silnou korelaci mezi aktivitou onemocnění a expresí CD40L (2). Vysoká exprese CD40L může odrážet zvýšenou a prodlouženou aktivaci lymfocytů, která vede ke zvýšené a prodloužené zánětlivé aktivitě. Expresi funkčního CD40L ve vysokých hladinách na T-buňkách pacientů s RA prokázali také MacDonald et al (42).

Jiná studie se zabývala úlohou signalizace CD40-CD40L při produkci RF. Ve zdravém imunitním systému jsou vysokoafinitní autoreaktivní B buňky odstraněny. U zdravých jedinců existují v lymfatických uzlinách B buňky produkující nízkoafinitní RF, ale vysokoafinitní RF jsou nedetekovatelné. U RA se vysokoafinitní B-buňky produkující RF hromadí v zanícené synovii. Výsledky této studie ukázaly, že interakce mezi CD40L na aktivovaných T-buňkách s CD40 na B-buňkách produkujících RF je klíčová nejen pro přežití těchto autoreaktivních B-buňek, ale také pro syntézu RF. Bylo zjištěno, že dva signály nezbytné a dostačující pro indukci vysokoafinitní syntézy RF in vivo jsou IgG a interakce CD40-CD40L. Při absenci interakce CD40-CD40L byly RF B buněk odstraněny (35).

Cho a kol. studovali úlohu interakce CD40-CD40L při produkci vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF). U RA má zanícená synovie vlastnosti podobné nádoru. Přetrvávání a expanze revmatoidního pannusu závisí na neovaskularizaci, protože rozsáhlá migrace mononukleárních buněk do synovie a prorůstání pannusu závisí na existenci bohatého cévního lůžka. VEGF, dimerický glykoprotein vázající heparin, je ústředním mediátorem angiogeneze a indukuje proliferaci endoteliálních buněk a propustnost kapilár. Bylo prokázáno, že ligace CD40 na synoviálních fibroblastech pomocí CD40L na aktivovaných T buňkách vede ke zvýšené produkci VEGF, která se dále zvyšuje v přítomnosti IL-1, TNF-α a transformujícího růstového faktoru β (8). Ligace CD40 na synoviocytech RA pomocí CD40L na aktivovaných T buňkách v synovii významně zvyšuje produkci TNF-α v závislosti na dávce (21). TNF-α je klíčovým cytokinem v patogenezi RA. Kromě TNF-α se prostřednictvím interakcí CD40-CD40L zvyšuje také produkce IL-10 (15). T buňky synoviální tekutiny pacientů s RA exprimují vysoké hladiny CD40L ve srovnání s T buňkami z periferní krve zdravých dárců a po aktivaci in vitro vykazují prodlouženou expresi CD40L na vysoké úrovni. Výsledky ukázaly, že 8,71 % T buněk synoviální tekutiny od pacientů s RA je CD40L+ oproti 1,74 % v kontrolní skupině (41). Potenciální role interakce CD40-CD40L v patogenezi RA vedla ke snahám o farmakologickou manipulaci této osy jako terapeutického přístupu u pacientů s RA.

(ii) Použití anti-CD40L MAb na zvířecích modelech RA. Léčba anti-CD40L MAb potlačuje rozvoj kolagenem indukované artritidy, což je zvířecí model RA. Přesněji řečeno, rozvoj zánětu kloubu byl zablokován a infiltrace subsynoviální tkáně zánětlivými buňkami a eroze chrupavky byly sníženy (14). U transgenních myší K/B×N, což je model Ig zprostředkované artritidy, léčba anti-CD40L MAb významně snížila rozvoj artritidy, pokud byla podána týden před začátkem klinicky zjevného onemocnění, ale léčba byla neúspěšná, pokud byla podána u zavedeného onemocnění (36).

Dermatomyozitida/polymyozitida. V jedné studii analyzující 9 pacientů s polymyozitidou a dermatomyozitidou bylo zjištěno, že T-buňky infiltrující svaly byly CD40L+ ve všech 9 případech, což naznačuje potenciální roli interakcí CD40-CD40L u výše uvedených klinických jednotek (58).

.